专利名称：：一种同时测定人血浆中多种局部麻醉药物浓度的方法
技术领域：
：本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种同时测定人血浆中多种局部麻醉药物浓度的方法。
背景技术：
：普鲁卡因(PR0)、利多卡因(LID)、罗哌卡因(R0P)、丁卡因(TET)和布比卡因(BUP)是目前临床上常用的局部麻醉药物。其中ROP与BUP属于起效慢但作用时间长的长效局部麻醉药物，而PR0、TET、LID属于起效快但作用时间短的短效局部麻醉药物。临床上常合并使用长效和短效局部麻醉药物以便于手术顺利实施。PR0、LID、R0P、TET和BUP五种药物的药动学个体间差异大、合并用药普遍、肝肾功能异常会导致药物血浆浓度和药效变化，以及药动学特性与药物的中枢神经系统毒性和心脏毒性直接相关，因此通过检测血浆中上述药物的浓度来调整给药剂量，对保证用药的安全和有效有重要意义。TET易被血浆中胆碱酯酶水解，提高TET在分析过程中的稳定性是保证其血浆浓度测定方法准确度的关键，也是建立同时测定人血浆中PR0、LID、R0P、TET和BUP五种局部麻醉药物浓度的分析方法的关键。迄今，国内外未见同时测定上述五种药物的相关分析方法的文献报道。
发明内容本发明的目的是克服已有技术的缺陷，提供一种测定人血浆中多种局部麻醉药物浓度的方法。尤其涉及一种简便、快速、灵敏、可同时测定人体普鲁卡因(PR0)、利多卡因(LID)、罗哌卡因(R0P)、丁卡因(TET)和布比卡因(BUP)血药浓度的方法。本方法无需昂贵的设备和试剂，具有操作简便、快速、血浆用量少、成本低等优点，适合常规血药浓度监测。本方法通过下述技术方案实现待测样品预处理后，经酸性流动相在色谱柱分离，用紫外检测器检测。本方法包括下述步骤1)样品预处理取待测样品，加入血浆胆碱酯酶抑制剂新斯的明抑制样品水解，经氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液碱化，加入定量的有机溶媒，上述操作均在3'C以下冰浴条件下进行；进行常温萃取、离心后，取上层有机溶液氮气吹干、流动相复溶，取上清液进样；所述的新斯的明溶液为0.52mg/tnL，氢氧化钠或氢氧化钾溶液为0.52mol/L，所述的有机溶媒优选乙醚溶液；2)样品分离采用通用型的液相色谱柱，其填料为KromasilCi8，高效液相系统采用通用型高压泵和进样器，采用30mmol/L的磷酸二氢钾水溶液(含0.14~0.18%三乙胺溶液，磷酸溶液调pH=4.8~5.l)和乙腈的混合液作为流动相，等度洗脱；所述的磷酸二氢钾水溶液乙腈为63士2:37±2，优选磷酸二氢钾水溶液乙腈为63:37，V/V;3)样品检测采用通用型紫外检测器210±1nm检测LID、ROP和BUP的峰面积，290±1nm检测PRO和TET的峰面积，用标准曲线方程换算成浓度。本方法具有以下优点1.同时测定只需一种方法即可测定人血浆中PR0、LID、R0P、TET和BUP浓度，降低了分析成本，简化了分析步骤，减少了血浆采集量，大大提高了以上五种药物临床血药浓度检测的效率。2.采样量少测定一份样品只需0.5ml血浆样本；3.预处理简便样品碱化后乙醚萃取，简便易行，适用于常规检测；4.灵敏度高通过双波长检测，明显提高同时测定的检测灵敏度，PRO、LID、R0P、TET和BUP的最低定量限均为0.05叫/mL;5.选择性强内源性物质、常用麻醉和镇痛药物以及常用抗生素药物等对测定不干扰。6.测定时间短整个色谱分析测定过程为13min。本发明方法快速准确、操作简便、灵敏度高、成本低，适合临床常规监测。所述PRO、LID、ROP、TET和BUP测定的线性良好，浓度范围均为0.055网/mL，方法回收率稳定，日内和日间的精密度(相对标准差，RSD)均小于12%。图1:典型色谱图未服用PRO、LID、ROP、TET和BUP受试者的空白血浆，其中，A:210nm;B:290nm。图2:典型色谱图空白血浆添加PRO、LID、ROP、TET和BUP标准品(PRO、LID、ROP、TET和BUP的浓度均为0.05|ng/mL)其中，A:210nm;B:290nm。图3:使用PRO和BUP受试者的色谱图，其中，A:210nm;B:290nm。图4:使用TET和ROP受试者的色谱图，其中，A:210nm;B:290nm。图5:使用LID和ROP受试者的色谱图，其中，A:210nm;B:290咖，其中，1:LID，2:ROP，3:BUP,4:PRO，5:TET，6:内标(卡马西平)。具体实施方式实施例1色谱条件Waters2690HPLC系统，Waters2487双波长紫外检测器，Millennium32色谱工作站(Version4.0);色谱柱KromasilCl8(250mmX4.6mm,5nm);柱温40°C;流动相30mmol/L磷酸二氢钾水溶液(含0.14%三乙胺溶液，磷酸溶液调pF^4.8):乙腈(61:39，V/V);流速l.OmLmin-';210nm测定LID、ROP和BUP的浓度，290nm测定PRO和TET的浓度。血浆样品预处理取0.5mL血样分别加入0.5rng/mL新斯的明溶液50pl、5网/mL内标溶液lOOpl和0.5mol/LKaOH溶液lOOuL，涡旋10Sec，混匀，加入乙醚3mL，上述操作均在3"以下冰浴条件下进行；涡旋2min，2500gX8min离心，取上清液2.5mL于另一试管中，40。C氮气流吹干，残留物加入lOOpL50%甲醇/水溶解，涡旋10Sec，12000gX8min离心，分取上清液30pL进行，内标法以峰面积定量。专属性取不同来源的10名未服用PR0、LID、R0P、TET和BUP的受试者的空白血浆，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，未发现血浆内源性物质对上述测定组分有干扰。此外，常见合并用药地西泮、咪唑安定、芬太尼、曲马多、ti引哚美辛、阿司匹林、对乙酰氨基酚、头孢唑啉、头孢替安、头孢呋辛钠、更昔洛韦、喷昔洛韦、利巴韦林、阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔等对测定没有干扰。PR0、LID、R0P、TET、BUP和内标的典型色谱保留时间分别为3.5、5.6、6.3、8.1、9.0、11.1min，整个色谱分析过程时间为13min。线性试验精密称取PR0、LID、R0P、TET和BUP标准物质适量，用50%甲醇溶解，稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含PR0、LID、R0P、TET和BUP血浆浓度分别为0.05,0.1,0.25，1，2.5和5Pg/mL的标准血样。取血浆0.5mL,按"血浆样品预处理"方法操作。内标法以待测组分与内标的峰面积比(/0和待测组分浓度(C)作加权(l/0线性回归，线性范围均为0.055化/mL，最低定量限均为0.05Pg/mL,PR0、LID、R0P、TET和BUP的标准曲线回归方程分别为PRO力-l.0515，产0.9993;LID力-O.3180.00252，户0.9982;ROP力=0.401C-O.0130，r=0.9996;TET#0.838C-0.0104，产0.9998;BUP/1=0.342C-O.0107，尸0.9998。准确度和精密度精密称取PR0、LID、R0P、TET和BUP标准物质适量，50%甲醇溶解并稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含PR0、LID、R0P、TET和BUP血浆浓度分别为0.15，2和4Pg/mL的系列血样，各取血浆0.5mL,按"血浆样品预处理"方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD)，其中(C实測-C理论)/C理论X100X为偏差，结果表明三种待测物的日内和日间精密度均小于12%，相对偏差小于12%。本方法测定同时使用PRO和BUP受试者，某受试者的分析色谱图显示二者浓度分别为2.16和1.83吗/mL(图3)。表l显示了PRO、LID、R0P、TET和BUP的日内、日间精密度和准确度。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例2色谱条件Waters2690HPLC系统，Waters2487双波长紫外检测器，Millennium32色谱工作站(Version4.0);色谱柱KromasilCl8(250ramX4.6mm，5pm);柱温40°C;流动相30mmol/L磷酸二氢钾水溶液(含0.18%三乙胺溶液，磷酸溶液调pH4.1):乙腈(65:35，V/V);流速l.OmL'min—';210nm测定LID、ROP和BUP的浓度，290nm测定PRO和TET的浓度。血浆样品预处理取0.5mL血样分别加入2mg/mL新斯的明溶液50pl、g/mL内标溶液100pl和2mol/LNa0H溶液100uL，涡旋8Sec，混匀，加入乙醚3mL，上述操作均在3。C以下冰浴条件下进行；涡旋2min，2500gX10min离心，取上清液2.5mL于另一试管中，40。C氮气流吹干，残留物加入100HL5(^甲醇/水溶解，涡旋10Sec，10000gX10min离心，分取上清液30pL进行，内标法以峰面积定量。取不同来源的10名未服用PR0、LID、R0P、TET和BUP的受试者的空白血浆，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，未发现血桨内源性物质对上述测定组分有干扰。此外，常见合并用药地西泮、咪唑安定、芬太尼、曲马多、d引哚美辛、阿司匹林、对乙酰氨基酚、头孢唑啉、头孢替安、头孢呋辛钠、更昔洛韦、喷昔洛韦、利巴韦林、阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔等对测定没有干扰。PR0、LID、R0P、TET、BUP和内标的典型色谱保留时间分别为3.7、5.6、6.5、8.7、9.4、12.0min，整个色谱分析过程时间为13min。线性试验精密称取PRO、LID、R0P、TET和BUP标准物质适量，用50%甲醇溶解，稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含PR0、LID、R0P、TET和BUP血桨浓度分别为0.05，0.1，0.25，1，2.5和5Pg/mL的标准血样。取血浆0.5mL,按"血浆样品预处理"方法操作。内标法以待测组分与内标的峰面积比(力)和待测组分浓度(C)作加权(l/0线性回归，线性范围均为0.055Pg/mL，最低定量限均为0.05Pg/mL，PR0、LID、R0P、TET和BUP的标准曲线回归方程分别为PRO^l.17C+0.0384，严0.9996;LID/N),29100151，广0.9991;R0P/^0.393C+0.00027，产0.9993;TET#0.820C-0.0108,产0.9996;BUP力=0.344C-0.00328，产0.9995。准确度和精密度精密称取PRO、LID、R0P、TET和BUP标准物质适量，50%甲醇溶解并稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含PR0、LID、R0P、TET和BUP血浆浓度分别为0.15，2和4Pg/mL的系列血样，各取血浆0.5mL，按"血浆样品预处理"方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD)，其中(C实甜-C理论)/Ca论X100M为偏差。结果表明三种待测物的日内和日间精密度均小于9%，相对偏差小于10%。本方法测定受试者血浆，使用TET和ROP的受试者的分析色谱图显示二者浓度分别为1.25和1.28叫/mL(图4)。表2显示了PR0、LID、ROP、TET和BUP的日内、日间精密度和准确度。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例3色谱条件Waters2690HPLC系统，Waters2487双波长紫外检测器，Millennium32色谱工作站(Version4.0);色谱柱KromasilC,s(250咖X4.6咖，5pm);柱温40°C;流动相30飄ol/L磷酸二氢钾水溶液(含0.16%三乙胺溶液，磷酸溶液调pH^4.9):乙腈(63:37，V/V);流速1.0mLmin—';210nm测定LID、ROP和BUP的浓度，290nm测定PRO和TET的浓度。血桨样品预处理取0.5mL血样分别加入lmg/mL新斯的明溶液50pl、g/mL内标溶液100pl和lmol/LNaOH溶液lOOuL，涡旋12Sec，混匀，加入乙醚3mL，上述操作均在3。C以下冰浴条件下进行；涡旋2min，3000gX9min离心，取上清液2.5mL于另一试管中，40°C氮气流吹干，残留物加入100pL50%甲醇/水溶解，涡旋10Sec，11000gX9min离心，分取上清液30pL进行，内标法以峰面积定量。取不同来源的10名未服用PR0、LID、R0P、TET和BUP的受试者的空白血浆，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，未发现血浆内源性物质对上述测定组分有干扰。此外，常见合并用药地西泮-,咪唑安定、芬太尼、曲马多、吲哚美辛、阿司匹林、对乙酰氨基酚、头孢唑啉、头孢替安、头孢呋辛钠、更昔洛韦、喷昔洛韦、利巴韦林、阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔等对测定没有干扰。PR0、LID、R0P、TET、BUP和内标的典型色谱保留时间分别为3.6、5.4、6.4、8.1、8.8、11.6min，整个色谱分析过程时间为13min。线性试验精密称取PR0、LID、R0P、TET和BUP标准物质适量，用50%甲醇溶解，稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含PR0、LID、R0P、TET和BUP血浆浓度分别为0.05，0.1,0.25，1，2.5和5Pg/mL的标准血样。取血浆0.5mL，按"血浆样品预处理"方法操作。内标法以待测组分与内标的峰面积比")和待测组分浓度(C)作加权(l/0线性回归，线性范围均为0.0554g/mL，最低定量限均为0.05iVmL，PR0、LID、R0P、TET和BUP的标准曲线回归方程分别为PROX=l.186H).0323，广0.9998;LID/H).294C-0.000778，f0.9996;ROP#0.4100.00161，r=0.9992;TET#0.838C-0.0103，产0.9997;BUP#0.353C-0.00093，f0.9992。准确度和精密度精密称取PRO、LID、ROP、TET和BUP标准物质适量，50%甲醇溶解并稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含PRO、LID、ROP、TET和BUP血浆浓度分别为0.15，2和4Pg/mL的系列血样，各取血浆0.5mL，按"血浆样品预处理"方法操作，考察曰内和日间的精密度和准确度。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD)，其中(C实测-C理论)/C理论X100M为偏差。结果表明三种待测物的日内和日间精密度均小于8%，相对偏差小于9%。本方法测定受试者血浆，使用LID和ROP的受试者的分析色谱图显示二者浓度分别为0.94和1.降g/mL(图5)。表3显示了PR0、LID、R0P、TET和BUP的日内、日间精密度和准确度。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1、一种同时测定人血浆中多种局部麻醉药物浓度的方法，其特征是待测样品预处理后，在酸性流动相下，经色谱柱分离后，用紫外检测器检测，包括以下步骤1)样品预处理取待测样品，在3℃以下冰浴条件下，加入血浆胆碱酯酶抑制剂抑制样品水解，经氢氧化钠或氢氧化钾碱化，加入定量的有机溶媒；常温萃取、离心后，取上层有机溶液氮气吹干、流动相复溶，取上清液进样；2)样品分离采用通用型的液相色谱柱，其填料为KromasilC18，250mm×4.6mm，5μm，柱温40℃；高效液相系统采用通用型高压泵和进样器，采用磷酸二氢钾水溶液和乙腈的混合液作为流动相，等度洗脱；所述磷酸二氢钾水溶液乙腈为63±237±2，V/V；3)双波长检测样品采用通用型紫外检测器波长210±1nm检测LID、ROP和BUP的峰面积，波长290±1nm检测PRO和TET的峰面积，用标准曲线方程换算成浓度。2、根据权利要求l所述的方法，其特征是，所述的血浆胆碱酯酶抑制剂为新斯的明溶液，浓度为0.52mg/mL。3、根据权利要求l所述的方法，其特征是，所述的氢氧化钠或氢氧化钾溶液浓度为0.52mol/L。4、根据权利要求l所述的方法，其特征是，所述的有机溶媒为乙醚溶液。5、根据权利要求l所述的方法，其特征是，所述的局部麻醉药物是普鲁卡因、利多卡因、罗哌卡因、丁卡因和布比卡因。6、根据权利要求2所述的方法，其特征是所述的新斯的明在3'C以下冰浴条件抑制血浆胆碱酯酶活性，控制丁卡因水解。7、根据权利要求l所述的方法，其特征是所述步骤2)的色谱条件是通用型的液相色谱柱，其填料为KromasilC18,高效液相系统通用型高压泵和进样器，以30mmol/L的磷酸二氢钾水溶液和乙腈的混合液作为流动相等度洗脱，所述的磷酸二氢钾水溶液含0.14~0.18%三乙胺溶液，磷酸溶液调pH-4.85.1;所述的磷酸二氢钾水溶液乙腈为63:37，V/V。全文摘要本发明属医学检验领域，涉及一种可同时测定人血浆中多种局部麻醉药物浓度的方法。本方法采用血浆胆碱酯酶抑制剂抑制在3℃以下冰浴条件抑制血浆胆碱酯酶活性，控制丁卡因水解，保证了方法的准确度；利用利多卡因、罗哌卡因和布比卡因，普鲁卡因和丁卡因分别在在210和290nm下有较强紫外吸收的特征，经酸性流动相在色谱柱分离后，用紫外双波长法检测，该法能使上述局部麻醉药物同时测定的灵敏度大为提高。本法样品取样少，预处理简单、快速、灵敏，无需昂贵的设备和试剂，分析周期短，成本低，适合多种药物临床常规血药浓度的监测。文档编号G01N30/02GK101393196SQ20081020138公开日2009年3月25日申请日期2008年10月17日优先权日2008年10月17日发明者崔学艳,施孝金,李中东,正焦,覃韦苇,钟明康申请人:复旦大学附属华山医院