专利名称：豆科黄芪属多年生草本植物中一种致毒物检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测方法，特别是一种豆科黄芪属多年生草本植物中致毒物检测方法
背景技术：
豆科黄芪属多年生草本植物，是一种常见的草本植物，由于这类植物粗蛋白和矿物质元素等含量较高，多用作草食动物的食物，其中最典型的是沙打旺，其起源于欧亚大陆，包括我国在内的东北亚和北美部分国家，在我国，原产于黄河故道，到上个世纪末，全国约有100多万公顷，主要分布在黄土高原地区。沙打旺营养丰富，粗蛋白和矿物质元素等含量较高，是一种高产优质的牧草品种。在我国北方草地畜牧业占有十分重要的地位。沙打旺，适应性强，喜温耐寒，耐干旱，耐盐碱，可广泛地播种于干旱，半干旱的荒漠地区，在治理水土流失、防风固沙和改良土壤等方面亦有重要作用。该牧草具有重要的经济价值。然而， 当豆科黄芪属多年生草本植物染病后，如沙打旺感染黄矮根腐病后，牲畜进食后会出现一系列的中毒反应，其主要表现在可使牲畜的肝脏肿大、产生流产等病症。可见当豆科黄芪属多年生草本植物染病后其植株中有毒性存在，会对采食的牲畜产生毒害或不良作用。这将严重影响了畜牧业的发展。虽然业界对此已有了解，但豆科黄芪属多年生草本植物染病后其内部有何种有毒物质，以及如何检测这种有毒物质至今尚无具体的报道和介绍。因此搞清染病的豆科黄芪属多年生草本植物中的有毒物质，找出一种可以检测病株的方法对畜牧业的发展有着积极的意义。但在现有技术中至今尚为一个空白。

发明内容
本发明提供一种可解决现有技术所未能解决的问题，能检测出豆科黄芪属多年生草本植物是否染病并对采食的动物产生病害的方法。本发明的方法是先将待检测植物粉碎后用醇与水的溶液或丙酮进行浸取提取， 将所得到的提取液浓缩得到浸膏，再将浸膏用水溶解后用等体积的乙酸乙酯进行萃取，然后检测萃取液中化合物7，3' - 二羟基-2' ,4' -二甲氧基-异黄烷的含量，根据检测得到被检植物中所含的化合物7，3' - 二羟基-2' ,4' - 二甲氧基-异黄烷含量的多少确定被检植物是否属于染病有毒的病株。本发明的豆科黄芪属多年生草本植物中一种致毒物检测方法，也可以是先将待检测植物粉碎后用醇与水的溶液或丙酮进行浸取提取，将所得到的提取液浓缩得到浸膏，再将浸膏用水溶解后先将浸膏水溶液用等体积的石油醚萃取，所得的水相再用等体积的乙酸乙酯进行萃取，然后检测萃取液中化合物7，3' - 二羟基-2' ,4' - 二甲氧基-异黄烷的含量，根据检测得到被检植物中所含的化合物7，3' - 二羟基-2' ,4' -二甲氧基-异黄烷含量的多少确定被检植物是否属于染病有毒的病株。采用这种方法可以克服用乙酸乙酯直接萃取时植物中的一些杂质，例如蜡质、小极性的苯的衍生物、色素等，对检测精度的影响。
上述本发明的豆科黄芪属多年生草本植物中一种致毒物检测方法中可采用气相色谱法或者紫外分光光度计法或者高效液相色谱法对萃取液用进行检测。本发明优选的豆科黄芪属多年生草本植物中一种致毒物检测方法中是采用高效液相色谱法进行检测。在检测时，待检测植物粉碎后用乙醇的水溶液进行提取，其中的乙醇水溶液为体积比为60-95%的乙醇水溶液。经本发明相关的研究表明，豆科黄芪属多年生草本植物中一种致毒物质是化合物 7,3' - 二羟基-2'，4' -二甲氧基-异黄烷(DDIF)。本发明相关的研究表明，未染病的豆科黄芪属多年生草本植物或多或少也是含有DDIF的，但未染病的豆科黄芪属多年生草本植物中所含DDIF极少，不会造成采食的动物致病。但当豆科黄芪属多年生草本植物染病后，其内部所含的DDIF量会明显升高，并足以造成食用的动物发病，甚至中毒。在这一基础上，本发明给出以上的对豆科黄芪属多年生草本植物中的DDIF检测的方法，并给出建议的确定豆科黄芪属多年生草本植物是否染病有毒的数值，即当被检植物中的DDIF的含量达到5%。(质量比)以上时，即可认为植物染病，并足以对所采食的动物产生致病作用。关于这方面的具体内容说明见后续的具体实施方式
内容。本发明可以有效检测出豆科黄芪属多年生草本植物中致毒物-DDIF的含量，同时提示本发明可以用于对其它的草本植物中的DDIF含量进行检测。


图1为胚胎细胞分化图，其中左图为正常蟾蜍的胚胎细胞分裂和早期胚胎发育图，右图为将DDIF稀释后作用于蟾蜍胚胎细胞的细胞图，其中所用样本为非洲蟾蜍。图2为染病的沙打旺植株中萃取液定容至25mL的色谱图。图3为正常的沙打旺植株中萃取液定容至2mL的色谱图。
具体实施例方式以下结合具体实施方式
对本发明进行详细解说，其中所用的被检植物为沙打旺。实施例1 沙打旺病株毒性萃取物的筛选采自甘肃环县的沙打旺病株茎部分3公斤，将其全部碾碎后于室温下用10升90 % 的乙醇水溶液(体积比)冷浸提取三次，合并提取液并通过减压蒸馏将其浓缩，晾干后得到总浸膏200克。将浸膏用水溶解后，用等体积的石油醚萃取，所得的水相接着用等体积的乙酸乙酯进行萃取，所得的水相再用等体积的正丁醇进行萃取，得到四种不同极性萃取物组分石油醚组分、乙酸乙酯组分(35g)、正丁醇组分和水相组分。将以上得到的这四个组分分别进行小鼠饲喂实验，发现仅乙酸乙酯组分在5mg的剂量下可导致小鼠死亡。其他部分没有观察到明显的毒害小鼠现象。实施例2 有毒化合物的分离与提纯将实施例1得到的乙酸乙酯萃取物拌以35g硅胶Q00-300目)，自然挥干之后， 用400g硅胶Q00-300目)湿法装柱进行柱层析，用石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，每200mL 为一流份，得到A G共7个组分。洗脱的梯度如下A(30:1)，B(15:l)，C(8:l)，W4:l)， E(2:1)，F(1:1)，G(甲醇冲柱)。组份D，经TLC检测后合并相似组分，得到D1-D9九个部分， D9部分经石油醚-乙酸乙酯体系重结晶得到化合物，经表征证实这种化合物为7，3 ‘ -二羟基-2'，4' -二甲氧基-异黄烷(DDIF)，其表征如下化合物DDIF的物理和光谱数据无色晶体；熔点145°C ； [a]D20 = -18. 5° (c =0. 5，甲醇)；ESIMS 显示分子离子峰[M+H]+ 为 m/z = 303 ；1H NMR(400MHz, acetone_d6)， 6. 88 (1H, d, J = 8. 4Hz, H_5)，6· 71 (1H，d, J = 8. 8Hz, H_6 ' ) ,6. 64 (1H, d, J = 8. 4Hz, H-5' )，6. 37 (1H, dd, J = 8. 4,2. 4Hz, H_6)，6. 30 (1H, d, J = 2. 4Hz, H_8)，4. 17 (1H, dd, J =12. 4，3. 6Hz, H-2a)，3. 91 (1H, d, J = 10. 4Hz, H_2b)，3. 45 (1H, m, H_3)，2. 90 (1H, dd, J =14. 8,3. 6Hz, H-4a) ,2. 78 (1H, dd, J = 16,4. 8Hz, H_2b) ； 13CNMR(1 OOMHz，acetone_d6)， 71. 4 (C-2)，33. 1 (C-3)，32. 4 (C_4)，109. 2 (C_5)，108. 3 (C_6)，156. 3 (C_7)，104. 0 (C_8)， 157. 9(C-9), 114. 6(C-IO),128. 5 (C-l' ),147. 1 (C-2 ' ),140. 7 (C-3' ),148. 7 (C-4 ')， 131. 4(C-5' ), 117. 7(C-6')。实施例3 :化合物DDIF纯品的毒性实验将实施例2得到的DDIF纯品进行小鼠注射实验，发现在100 μ g的剂量下，可以导
致小鼠死亡。将DDIF配置成lOmg/mL的二甲基亚砜标准溶液，并保存在_20°C的冰箱内作为供试样品。将供试样品稀释成一系列浓度给非洲蟾蜍胚胎细胞给药，观察不同浓度的化合物对胚胎细胞分裂和早期胚胎发育的影响。胚胎在室温条件下培养Mh，用3. 7%甲醛固定成像，记录胚胎细胞停止分裂、死亡的个数。实验重复三次。通过胚胎细胞实验，证实化合物 DDIF在1 μ g/mL可以明显阻止非洲蟾蜍胚胎细胞分化，参见图1。实验结论DDIF在ΙΟΟμ g的剂量下，可以导致小鼠死亡；细胞实验表明，DDIF在 1 μ g/mL的浓度下，对非洲蟾蜍胚胎细胞有很强的毒性，所测胚胎细胞均停止分化，死亡。实施例4 高效液相色谱法检测沙打旺病株中化合物DDIF的含量供试样品的制备分别精密称取沙打旺病株和正常株茎部分各10g，将其全部碾碎后于室温下用60-95%的乙醇水溶液冷浸提取三次。合并提取液进行减压浓缩，晾干后得到总浸膏用水溶解，将浸膏水溶液用等体积的石油醚萃取，所得的水相接再用等体积的乙酸乙酯萃取，再分别将病株和正常株的乙酸乙酯萃取物用氯仿/甲醇2 1(体积比)溶解后用葡聚糖凝胶(Sephdex LH-20)过柱以除去色素，洗脱剂为氯仿/甲醇2 1 (体积比)。将病株和正常株样品分别溶解于色谱纯甲醇中，并分别用容量瓶定容至25mL和2mL， 最后经微孔滤膜(0.45μπι)过滤，作为供试样品。将上述供试样品进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为0. 醋酸水溶液(A)，10%乙腈甲醇溶液(B)，0 10min，54% B ；10 25min，54% 57% B ；25 45min，57% 75% B ；45 50min，75% 85% B ；50 60min，85% 100% B。流速 0. 6;3ml/min，UV 检测波长 280nm,柱温为室温，进样量10 μ L，理论塔板数按公式N = 16 [VE/ff]2计算不低于4000，对照品与周围的峰的分离度按R = 2^^2)/^+^)]计算，R大于1.5%，所得色谱图如图2、 图3所示，其中病株样品用容量瓶定容至25mL，正常株样品用容量瓶定容至2mL。标准样品的制备精密称取DDIF标准品溶解于色谱纯甲醇中，用容量瓶定容至 lmL，最后经微孔滤膜(0.45μπι)过滤，作为标准样品。再将DDIF分别配成0. 02mg/mL， 0. 2mg/mL, 0. 3mg/mL, 0. 5mg/mL, 0. 6mg/mL, 0. 7mg/mL, lmg/mL 的系列标准溶液，高效液相 (仪器及型号Waters 600-2996)每次分别注射配好的DDIF标准样品10 μ L，η = 3，按58% B的HPLC条件测定峰面积的积分值，以峰面积(y)为纵坐标，对照品质量(χ)为横坐标进行回归，绘制标准曲线，得线性回归方程:y = 2. 20X106x+5236. 44,R2 = 0. 9999 ；线性范围为 0.01-50 μ g ；将病株和正常株色谱图中的峰面积代入线性回归方程即得病株和正常株中DDIF 的含量M 病=11113.89±142.91yg/g(l. 11% )，M 正常=335. 52 士 6. 49 μ g/g(0. 03% )。实验结论本实验表明DDIF为沙打旺病株中含量最大的化合物，并且病株中的含量为正常株中含量的33倍。在进行受试植物浸取时同时用不同的浸取液体平行处理，即对相同的植物样采用 60-95 %的甲醇水溶液冷浸提取和用丙酮浸取，其效果相差无几。
权利要求
1.豆科黄芪属多年生草本植物中一种致毒物检测方法，其特征在于将待检测植物粉碎后用醇与水的溶液或丙酮进行浸取提取，将所得到的提取液浓缩得到浸膏，再将浸膏用水溶解后用等体积的乙酸乙酯进行萃取，然后检测萃取液中化合物7，3' - 二羟基-2'， 4' -二甲氧基-异黄烷的含量，根据检测得到被检植物中所含的化合物7，3' -二羟基-2' ,4' -二甲氧基-异黄烷含量的多少确定被检植物是否属于染病有毒的病株。
2.权利要求1所述的豆科黄芪属多年生草本植物中一种致毒物检测方法，其特征在于将萃取液用气相色谱法或者紫外分光光度计法或者高效液相色谱法进行检测。
3.豆科黄芪属多年生草本植物中一种致毒物检测方法，其特征在于将待检测植物粉碎后用醇与水的溶液或丙酮进行浸取提取，将所得到的提取液浓缩得到浸膏，再将浸膏用水溶解后先将浸膏水溶液用等体积的石油醚萃取，所得的水相再用等体积的乙酸乙酯进行萃取，然后检测萃取液中化合物7，3' - 二羟基-2' ,4' - 二甲氧基-异黄烷的含量，根据检测得到被检植物中所含的化合物7，3' - 二羟基-2' ,4' -二甲氧基-异黄烷含量的多少确定被检植物是否属于染病有毒的病株。
4.根据权利要求3所述的豆科黄芪属多年生草本植物中一种致毒物检测方法，其特征在于将萃取液用气相色谱法或者紫外分光光度计法或者高效液相色谱法进行检测。
5.根据权利要求4所述的豆科黄芪属多年生草本植物中一种致毒物检测方法，其特征在于所用的检测方法为高效液相色谱法。
6.根据权利要求1至5所述的任一豆科黄芪属多年生草本植物中一种致毒物检测方法，其特征在于待检测植物粉碎后用乙醇的水溶液进行提取，其中的乙醇水溶液为体积比为60-95%的乙醇水溶液。
全文摘要
本发明公开豆科黄芪属多年生草本植物中一种致毒物检测方法。本发明的方法是先将待检测植物粉碎后用醇与水的溶液或丙酮进行浸取提取，将所得到的提取液浓缩得到浸膏，再将浸膏用水溶解后用等体积的乙酸乙酯进行萃取，然后检测萃取液中化合物7，3′-二羟基-2′，4′-二甲氧基-异黄烷的含量，根据检测得到被检植物中所含的化合物7，3′-二羟基-2′，4′-二甲氧基-异黄烷含量的多少确定被检植物是否属于染病有毒的病株。
文档编号G01N1/40GK102353738SQ20111025162
公开日2012年2月15日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者南志标, 李亚, 李彦忠, 陈佳, 陈建军, 高坤, 魏石磊 申请人:兰州大学