专利名称：一种电离辐射致外周血淋巴细胞dna损伤的评价方法
技术领域：
本发明涉及细胞的检测方法，具体涉及一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法。
背景技术：
外周血淋巴细胞是电离辐射的敏感细胞，是研究电离辐射致DNA损伤的细胞模型之一。Y-H2AX蛋白质是DNA损伤后发生改变的分子，是DNA损伤的特异性分子。对Y-H2AX蛋白质的检测可以评价DNA损伤情况，对于研究DNA损伤的分子机制有广泛地应用。流式细胞仪具有快速、高通量等特点，可以检测细胞内Y-H2AX蛋白质的含量。目前利用流式细胞仪分析外周血淋巴细胞中Y-H2AX蛋白质的含量的方法存在实验重复性差，不同个体来源外周血样品之间差异大等问题，这些问题是因为缺少对照细胞，增加实验误差所引起的。


发明内容
本发明的目的是解决流式细胞仪分析外周血淋巴细胞中Y -H2AX蛋白质含量的方法存在实验重复性差，不同个体之间差异大等问题。我们的研究发现电离辐射后外周血淋巴细胞中Y-H2AX蛋白质含量增加，而粒细胞中Y-H2AX蛋白质含量不受电离辐射影响，可以作为分析淋巴细胞中Y-H2AX蛋白质含量的对照细胞，采用Y-H2AX的RL/G值(淋巴细胞的Y-H2AX蛋白质含量与粒细胞中Y-H2AX蛋白质含量的比值)来评价电离辐射后外周血淋巴细胞DNA损伤程度。本发明提供一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法。该方法操作简单，结果稳定，可以广泛应用于诊断、细胞生物学研究等领域。本发明的一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法包括下列步骤I)外周血样品有核细胞的固定；2)洗涤细胞，去除固定液；3)加入破膜剂对有核细胞破膜，裂解红细胞；4)洗涤细胞，去除破膜剂；5)加入荧光标记的抗Y -H2AX蛋白质的特异性抗体；6)洗涤细胞，去除未结合的抗体；7)流式细胞仪检测样品中淋巴细胞对应的荧光强度值，即为Y -H2AX蛋白质的含量;8)流式细胞仪检测样品中粒细胞对应的荧光强度值，即为Y-H2AX蛋白质的含量;9)计算步骤7)中淋巴细胞的Y-H2AX蛋白质含量与步骤8)中粒细胞中Y-H2AX蛋白质含量的比值——Y -H2AX的RL/G值；10) DNA损伤程度的判断方法Y -H2AX 的 RL/G 值< I. 5 为正常；Y -H2AX 的 RL/G 值> I. 5 为 DNA 损伤，Y -H2AX的RL/G值越大，DNA损伤越严重。


图I :不同剂量Y射线照射后外周血淋巴细胞和粒细胞中Y-H2AX蛋白含量变化。图2 :62名未受照射人外周血Y-H2AX的RL/G值，平均值为1.21±0. 12(1.01
I.54)。图3 :不同剂量Y射线照射后外周血Y -H2AX的RL/G值的变化。
具体实施例方式实施例I)利用肝素抗凝管取健康人外周血O. 9ml，平均分为3份，每份O. 3ml，其中第I份 未照射，第2份经2Gy Y射线照射，第3份经6Gy Y射线照射；2)血样加入I. 5ml固定液(2%多聚甲醛溶液)，室温作用30分钟；3)室温离心(500g)5分钟，去上清；4)利用I. 5ml PBS缓冲液对细胞沉淀进行洗涤，室温条件下离心(500g) 5分钟，去除上清，保留沉淀；5)加入I. 5ml浓度为O. 4%的Triton-100溶液，混匀细胞沉淀，室温作用15min ；6)室温条件下离心(500g) 5分钟，去上清；7)加入I. 5ml PBS缓冲液洗涤细胞，室温离心(500g) 5分钟，去除上清，保留细胞
沉淀；8)重复步骤6)；9)在细胞沉淀中加入小鼠抗人Y -H2AX抗体100 μ I (I : 200倍稀释)，混匀后37°C条件下作用30min ；10) I. 5mlPBS洗涤细胞，保留细胞沉淀，去除未结合的抗体；11)重复步骤9);12)加入100 μ I FITC标记的兔抗小鼠IgG(第二抗体，I 200倍稀释)，混匀后37 °C避光作用30分钟；13) I. 5mlPBS缓冲液洗涤细胞，弃上清；14)重复步骤 12)；15)流式细胞仪检测样品中淋巴细胞对应的荧光强度值，即为淋巴细胞的Y-H2AX蛋白质的含量；16)流式细胞仪检测样品中粒细胞对应的荧光强度值，即为粒细胞的Y -H2AX蛋白质的含量；17)计算步骤15)中淋巴细胞的Y-H2AX蛋白质含量与步骤16)中粒细胞中
Y-H2AX蛋白质含量的比值——Y -H2AX的RL/G值；18) DNA损伤程度的判断方法19) Y -H2AX 的 RL/G 值 <1.5 为正常；Y -H2AX 的 RL/G 值 > L 5 为 DNA 损伤，
Y-H2AX的RL/G值越大，DNA损伤越严重。
权利要求
1.一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法包括下列步骤 1)外周血样品有核细胞的固定； 2)洗涤细胞，去除固定液； 3)加入破膜剂对有核细胞破膜，裂解红细胞； 4)洗涤细胞，去除破膜剂； 5)加入荧光标记的抗Y-H2AX蛋白质的特异性抗体； 6)洗涤细胞，去除未结合的抗体； 7)流式细胞仪检测样品中淋巴细胞对应的荧光强度值，即为淋巴细胞的Y-H2AX蛋白质的含量； 8)流式细胞仪检测样品中粒细胞对应的荧光强度值，即为粒细胞的Y-H2AX蛋白质的含量; 9)计算步骤7)中淋巴细胞的Y-H2AX蛋白质含量与步骤8)中粒细胞中Y-H2AX蛋白质含量的比值一一 Y -H2AX的RL/G值； 10)DNA损伤程度的判断方法 Y -H2AX 的 RL/G 值< L 5 为正常；Y -H2AX 的 RL/G 值> L 5 为 DNA 损伤，Y -H2AX 的RL/G值越大，DNA损伤越严重。
全文摘要
本发明涉及一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法。该方法主要利用电离辐射照射外周血，采用特异性抗体标记外周血淋巴细胞和粒细胞中γ-H2AX蛋白质，通过流式细胞术分析两种细胞中γ-H2AX蛋白质的含量，并以粒细胞作为参照，计算淋巴细胞中γ-H2AX蛋白质的相对含量。采用γ-H2AX的RL/G值(淋巴细胞的γ-H2AX蛋白质含量与粒细胞中γ-H2AX蛋白质含量的比值)来评价电离辐射后外周血淋巴细胞DNA损伤程度。该方法操作简单，结果稳定，可以广泛应用于诊断、细胞生物学研究等领域。
文档编号G01N15/14GK102914495SQ20121037998
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者王治东, 陈英, 张学清 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所