专利名称：环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌的方法
环介导紫显扩增-微孔板杂魏米电化雜测繊球菌的方法狱繊本发明涉及一种利用环介导^T增(LAMP) M与纳米fei己基因序列电化学分析技7(^检测!^^lt属特异性DNA序列的方法，即环介导等显扩增嶺 L^^^米电化^^PM^菌的方法。 背景狱Ig^^菌(streptococcus suis)是一种广泛分布预乳动物和人体内的溶血性^^菌，卵圆形，大小 为O. 7—1. 4 ，往^^两个以上的菌#^^^成 。革兰R^阳生。i^^g^W虽，对千燥、 湿^ ，常用消毒I^T将其杀死。在动辦几W^;力斷轿卩外gW:^f七诱导下，i^0会引发猪 ^^菌病，属国家规定的二类动物赚，是一种人畜共患传染病。彭l^急性出血'l4Pfofl症、心内膜炎、 脑膜炎、关节炎、哺乳條下痢和孕猪,等。離球菌麟不仅聰猪舰翻市炎、脑膜炎、关节炎 及心内膜炎，而且可li^寺定人群魏^E亡，危害严重。在lfg^上，急鹏^^^菌病以脑炎和tt 症为雄，慢鹏以关节炎、心内膜炎、淋巴结鹏中为,。本病4四執可姓，以冬春季多发， 不同年,可;t^，病猪和病愈带菌猪是本病的主對专 ，病原^^于各脏器、血液、肌肉、关节和 Mtl中，主要经消雌和损伤的 。病源性^^e菌也可以ii^^，引m^病。病鱼眼球明显突出，其周围充血，鳃盖内顶^lflLMr^g燃出血，夏季高水温时病^Mffi3i。妇K温2or以下时，除J^^l^M较缀歐卜，各鳍和体表 敏，Mi^gl^往会有llML布疫^^烂。解剖鱼体，！iit^炎舰，幽门垂、肝、肾、脾等 ^出血。病鱼絲t欲，离^t游于水面^^于水底，数日内即死亡。 通綱IJ^^菌,蹄三沐1.生敏化鉴定技术，该微时，操條贞，不能满鹏害防治的需要；2. ^^吸附i離，3潔^^gjS法(PCR法)，跡^ttr照伤法腿、灵敏，但需要昂贵的pcR仪。目前尚未j,环介导^r增方法与电化学分析技7i^ffl检测^^s的方法。 发明内容本发明的目的^^纳米硫化镉敏己 "序列微孑1^^交电化学分析与环介导# "增糊检测猪 麟謝属特异性基因w^法，即环介导^ "增嶺孔^^穷内米电化^#测 ^菌，以剋野见有技术的不足，从而为^^菌的检测^i，单易行的'I^I方法，^i^，品、t^斗和生物体内^^^菌本发明的主要原鹏(1) !ft^设it"组可以i鄉鹏DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引 物和下游内弓物)和两个外弓胸(上嫩卜引物和下微卜弓胸)，内引^^含耙DNA的!BC链mSX能 (2)其中一个内引救信先和耙DNA杂交，随后的^g换DNA合自具有高度OT换活性的DNA聚5娜的参与下由^h外引物启动，释放出单链DNA，荆乍为由杂效鹏的另一端的一个内引物和一个外 引物启动的DNA合j^fc产生一个原始的茎环DNA; (3)内弓物以原始執DNAm^fc启繊 置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一^f 的由两倍茎长度的，DNA; (4)在^M斜牛 下，内弓物以茎环DNA为微，ilil^g娜成多^^有耙DNAfifim列的執DNA，在一小时内 该循环鹏可使耙DNA累积剷109拷贝;扩增的/^t^微孑Lfei:固定后与纳米硫化镉feia的mf"序列发 生好杂交鹏而结合，利用强鹏躲顿链DNA掘雜子溶解后細高灵敏的电化学分析旅测 定溶解的鏑离子'产生的电化学分析信号与扩增，的鹏目关，进而翻电化雜测检测^^菌 种属特异性DNA序列的目的。本发明涉及的纳米硫化錄CdS)feia探针序列微 版固定电化学分析与环介导^M扩增连用检测猪 ^^菌W^法，其中的淑诉嗨液包括如下(1) - (4):(1) 环介导雛扩增(LAMP)鹏液包括lOxThermopol a^M冲液、300—500 Mmol/LdNTP、 2—4mmol/L硫,、0.8—1.2nmol/L上 游内引物、0.8—1.2 Mmol/L下游内弓胸、0.2—0.3 pmol/L上微卜弓,、0.2—0.3 pmol/L下嫩卜弓物和1 —1.5mol/L甜魏；1U/mLUNG酵；其中lOxThermopol S^^冲液含有200mmol/LpH8.8的三縫甲 基MS甲烷一&^、 100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫,、20mmol/L硫m^和1 ^曲^MX—100;其中，上游内引物5-TGArcnTCTrGTCACCTGTrCCArCTGTCCGTArGGATGTrC-3、下游内弓l物5-ACGTTGGTAAGGAAACCAAGGATGAnTCAACAACAGCTTCT隱3、上齢卜引物5-CGTGCGCnAAArTCTATGC-3、下微卜弓物5- GAGAAAITCCITCACCGTAC -3;(2) BstDNA聚德8U/mL;J^盼混"^tldNTP内的四种脱fl^糖核酸的质量比为dinP:dAIP:dGTP:dCIP=2:l:l:l0(3) J^的环介导^W增a^液敏23ML的劇赵贼为2.5pLl(KIlieimopolMi^夷冲液、1.0 nL10mmol/LdNTP (四种脱ft^糖核酸阶混^tl)、 1.0pL20MmoI/L上游内弓l物(FIP)、 1.0ML20Mmol/L 下游内引物(bip)、 0.25nL20Mmol/L上微卜弓嫩(F3)、 0.25^iL20Mmol/L下微卜弓卿(B3)、 0.5mL100 mmol/LMgS04、 12单1.511101^甜^^口争鹏0 (鄉双蒸冰)。(4) ^^^菌种属特异性基因(recA)微序列的纳米硫化镉(CdS)曙Mf序列iHB液，其帝恪 方法如下将3.84mL,乙酸加到50mL浓度为0.w.4mmol/L的氯化镉(002 )溶液中混合均匀，用0.5mol/L NaOH溶液调节混合液的pH歡10.5-11.5，通氮气総2545 min后，在勸J^^和氮气做下向战混合液中缓漫滴加1.34mmol/L的硫化钠(Na2S)溶液2540mL，滴加完毕后，^^^^24h，混合液 逐船也^m色，即可得到纳米CdS溶胶；再取5.0mL纳米CdS溶麟心纯化，7乂船分散于2.0mL 水中，加入100 mL 40.輔.0 mmol/L乙教3-二甲基氨M^)^二3a^k麟(EDC)、 100 mL 40.0<60.0 mmoI/LN隱^^aWl安(NHS)及O.l mmo!/L徽序列(5'"GATTTCAACAACAGCTrCT-3')，室温 下 15-20h， ^gj3Z驗1,r/minTM心2545min，用PBS溶液洗涤多次，再分散于PBS溶液中， 得到含有硫徽序列的纳米CdS-微序列硫液，于-2t下保存。《顿j^环介导^rms^检测it^^菌的方法，依次包括下列步骤(1)陽(3):(1) 待检样品腿微的提恥提取样品核酸，提取方法不限定，只要會^^证其中提取的DNAOD26028o會嫩超lM4l.6"2.0范围 内即可，^iiSlJ救l(MOOn^ML范围内即可以。(2) 进俩介导^r增破久皿有23 pLLAMP M^液的aS管中加入1 mL上述待检样品,dna和0.5 pL的UNG酶， 于疸^7K浴上50。C腿3min，于恒温95 。C驢3—5min，立即置于冰上1 —3 min;B. 在鹏管中加入1 pLBstDNA聚娜；C. 于直温60—65。C方爐45—90min;D. 将^jg调到80-95 。C，鹏3—5min后中ihgjM躬杯介导^T增鹏的扩增,-^^ 節幅特异性基因(recA)的双链目标序列，取出待用。(3) J^X链目标序列繊所得的单链目标序列与纳米CdS^t"序列硫液中,己微序列杂 顿进行电化翔定将J^X链目标序列在100 。CtK浴中穀弗10min，然后在冰浴中'I^I7賴卩得到单链目标序列，取100 pL单链目标序列的溶^M微孑版中，37<€ ^W过夜，再于60^千燥箱中0,5-L5h蒸干，用含有1% 吐温20的磷離缓赠液(PBS"瘠鹏去未固定的单链目标序列；再取100 jiL繊己微序列的纳 米CdS^f序列t就輕固定了单链目标序列的微孑版中，45^水^^交2040min， ^!^^tf双 链DNA，然后取出微孑,PBST、 PBS和水各冲冼5次，每次一倂中，以清鹏去除去未杂交的丰斜己 微序列。3纷L中残留的溶^^轻拍出，取100ML1.0moI/L的5g^溶液^A射L，静置5min，氧化溶 解杂^tl双链DNA上的纳米CdS，然后狄20 pL 5.0 mol/L NaOH调节溶液的pH輕中性；再取 150uLpH4.7含1.8Xl(Mmol/L汞离刊Hg2+)的,-lt^(NaOAoHOAc)加入微孑版中，直接以微 孑L为^Mfe，以玻碳电极为工作电极，在-1.4V下 ^只120-180s，静止5s后从-1.2V向-0.6V溶出 扫描，在-1.01 V处出现的阳极溶出峰电流即为领糧信号，此信号即为猪^^菌,异性基因的响应信号，荆乍为环介导等尉广增嶺孔fe^穷内米电化^^测^^^的依据。进行同位 阳极溶出伏安法 4顿的电化学工作站的其它織體如下电位增量0.004 V，振幅0.05V，脉冲繊0.06 3，采样驗 0.02 s，脉冲周期02s。下列織例进"^i兑明本发明，但不应当作对本发明的限制。 鄉例l按下歹鹏方制乍纳米硫化镉撒序列硫涨将3.84 mL统基乙働口到50 mL浓度为1.0 mmol/L的CdCl2溶液中混合均匀，用0.5 mol/L NaOH溶 液调节混合液的pH働ll，通氮气麟30min后，在動^^和氮气微下向J^混合液中缓漫滴加 1.34mmol/L的Na2S溶液30mL。滴加完毕后，^^24h，混合 1^^^色，即可得到纳米 CdS溶胶。取5.0 mL纳米CdS溶麟心纯化，水船分散于2.0mL水中，力口入100 pL 50.0 mmol/LEDC、 100 ML50.0mmol/LNHS及0.1mmo]/LMf序列，室温下,18h， i^gj^t^ l画i/minT^心30min，用PBs溶液洗涤多次，再分散于pbs溶液中，得到含有feia徽序列的纳^i^f七镉^f序列feia液，于-2t下保機用。按照以下辦进行检测(1) Mt#品DNA的提取 ^^ GBT 19495.3-2004方^^取样品的DNA。(2) 进fi1^^菌EPSPS基因环介导^r增^^a. 23 mLLAMP HJ^液的鹏管中加入1 ml待检微dna，和0.5 的ung酶，于恒温 7K浴上50。C腿3min， 95。C腿5min,立即置于冰上lmin;B. 在破管中加入l pLBstDNA聚娜；C. 于恒^7K浴上65 。C體1小时；D. 将水浴调到80'。，鹏3111]11后中11^^得到环介导^^增鹏的扩增 /- a^^薪中属特 异性基因(recA)的双链目标序列，取出待用。(3) 微孑,交电化雜测将J^X链目标序列在100 。CtK浴中蕭弗10min，然后在冰浴中'l^im卩得到单链目标序列，取100 HL单链目标序列的溶^M微孑版中，37 孵育过夜，再于60T千燥箱中lh蒸干，用含有1%吐温 20的PmSM冲溶液(PBST) 、mit去未固定的单链目标序列;再取100ML ^t射己^h序列的纳米CdS陽微序列^i己輕固定了单链目标序列附微孑版中，45X:7乂m^交30 min， 4^^^t/双链DNA， 然Jg取出微孔OT PBST、 PBS和7K各i^冼5次，每次一併中以除去未固定的^H己W"序列，)I狩L中残 留的溶^g拍出，取100 pL 1.0mol/L的石ft^溶液SA射L静置5 min，氧化溶解杂^tf双链DNA 上的纳米CdS，然后SA 20 mL 5.0 mol/L NaOH调节溶液的pH iSS中性；再取150 nL pH 4.7含 1.8Xl()4mol/L汞离节Hg2"的醋酸-醋,(NaOAc-HOAc)加入微孑版中，直接以微孑l^h时微孔为鹏 化柳池，以繊电极为工作电极，在-1.4V下l5^只150s，静止5s后从-1.2V向-0.6V溶出扫描， 在-1.01 V处出现的阳极溶出峰电流即为测量信号，此信号即为猪^^菌属特异性基因的响应信号，并 作为环介导^T增溜孑L^^^I米电化^^测^^0的依据。进行同位 阳极溶出伏安齒^的 电化学工j憐的其它織體如下电位增量0.004V，振幅0.05V，脉冲繊0,06s，釆样驗0.023， 脉冲周期0,2s。 鄉例2按下歹歸制微顶ilW薪中属特异性基因recA的环介导離扩增淑愴(1) lamp鹏液含有2.5 pL lOxThermopol Mi^劍液、1.010mmol/LdNTP、 1.0 ^L20Mmol/L上游内引物(F1P)、 1.0nL20Mmol/L下游内引物(BIP)、 0.25nL20Mmol/L上嫩卜引物(F3)、 0.25nL20nmol/L下微卜引物 (B3)、 0.5ML100mmol/LMgSO4、 12.5ML2mol/l甜魏、1U/jjLUNG醒1 U4iL和4nLddH20 。 其中戶腿的上游内引物、下游内引物、上嫩卜引物、下微卜引物同上。(2) BstDNA聚鏽B: 8U/mL; 離照以下辦进行检测(1) 样品DNA的提取A取200mg待检样品，置于L5mL离心管中，用台式离心机2000转/min离心5min，弃上清瓶B. 力口入1.5mL灭菌)5^7K，混匀，用台式离心机12000转/分离心5min，弃上清液；C. 力口入150ML灭菌双蒸水，混匀，100。C沸水浴中力口热15min;D. 用台式离心机12000转/分离心5min，IU:清至一个新的1.5mL离心管中，即为待检微DNA;(2) 进行，沙门氏菌的环介导^r增a^A. 23pL LAMP ^gj^液的鹏管中力口入1 mL待检丰鎌DNA，和0.5 的UNG酶，于恒温 7K浴上50。C艘3min， 95。C腿5min，立即置于冰上lmin;B. 在^S管中力口入1 pLBstDNA聚娜；C. 亍恒船K浴上65 。C腿1 h;D.将7]C浴调到80°C， Mi^3min后中ihSiS得到环介导^rmSiS的扩增 ^tMi^薪中属特 异性基因(recA)的双链目标序列，取出待用。 (3)銜鹏交电化雜测将±3*^链目标序列在100 。C7K浴中煮沸10min，然后在冰浴中'鹏y賴瞎到单链目标序列，取100 ^tL单链目标序列的溶^M微孑版中，37 <€孵育过夜，再于60^千燥箱中1 h蒸干，用含有1%吐温 20的磷ma缓冲溶液(PBST)清洗除去未固定的单链目标序列。再取100pL创斜己微序列的纳米CdS-Mf序列iH2^M固定了单链目标序列的微孑版中，45^7乂^^交30min， ^^^t/双链DNA， 然后取出微孔棚PBST、 PBS和水各冲洗5次，每次一併中。^l射L中残留的溶^g拍出，以除去未 固定的feieW靜U，取IOO mL 1.0 mol/L的^^^iA祝L静置5 min，氧化溶解杂^tl双链 DNA上的纳米CdS，然后^A20ML5.0mol/LNaOH调节溶液的pH輕中性。翻同位顿阳极溶出 伏安法检测微孑版中溶解的镉离柳"的糧取150uLpH47含1.8X104mol/L汞离刊Hg^的醋 酸-lM(NaOAoHOAc)加入微孑版中，直接以微孔为^k，以臓电极为工作电极，在-1.4V下沉 积150s，静止5s后从-1.2￥向-0.6￥溶出扫描，在-1.01 V处出现的阳极溶出峰电流即为测量信号， 此信号即为^^^菌属特异性基因的响应信号，荆乍为环介导^W增嶺孑U^^^米电化^^测, 球菌的依据。进行同位^^阳极溶出伏安齒^的电化学工作站的其它皿i^a如下:电位增量0.004 V， 振幅0.05V，脉冲離0.06s，采样宽度0.02s，脉冲周期(X2s。核苷,列表<iio>山东出入境检验^S局检验;j^S技术中心<120>环介导^T增-微孑U^^^米电化^t测^^球菌的方法<160>4<210>1<211>43<212>DNA<213> AX序列<220><221>prim_bind<222>(1)...(43)<400>1屯atctttct tgtcacctgt tccatctgtc cgtatggatg ttc 4310<210>2<211>42<212>DNA<213> AX序列 <221> prim—bind <222>(1> (42) ,0>2acgttggtaa ggaaaccaag gatgatttca acaacagctt ct 42<210>3<211>20<212>DNA<213> AX序列<221>prim_bind々22>(1)...(20)<400>3cgtgcgctta aattdatgc 20<210>4<211>20<212>DNA<213> AI序列<221>prim_bind<222>(1)...(21)<400>4gagaaattcc ttcaccgtac 20<210>5<211>19<212>DNA〈13> AX序列<221>prim_bind<222>(1). (19)<400>5Gatttcaaca acagcttct 19
权利要求
1.一种环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌的方法，其特征在于该方法包括以下步骤以上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物在内的环介导等温扩增反应得到扩增反应物--待测猪链球菌种属特异性基因的双链目标序列，将该双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在微孔板上进行固定，然后将纳米硫化镉对来源于猪链球菌种属特异性基因的探针序列进行标记得到标记探针序列，将该标记探针序列与固定在微孔板上的目标序列进行分子杂交并进行同位镀汞阳极溶出伏安法的电化学测定。
2. 如权利要求1所述的环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌的 方法，其特征在于上述的两对引物为上游内弓l物5,- TGATCTTTCTTGTCACCTGTTCCATCTGTCCGTATGGATGTTC -3，、 下游内引物5'-ACGTTGGTAAGGAAACCAAGGATGATTTCAACAACAGCTTCT -3，、 上游外引物5，- CGTGCGCTTAAATTCTATGC -3，、 下游外引物5，- GAGAAATTCCTTCACCGTAC -3，。
3. 如权利要求1所述的环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌的 方法，其特征在于上述的环介导等温扩增反应液中的试剂包括(1) 10xThermopo1反应缓冲液、300 —500 pmol/L dNTP、 2 — 4 mmol/L硫酸镁、 0.8 — 1.2pmol上游内引物、0.8—1.2 pmol/L下游内引物、0.2 — 0.3 nmol/L上游外引物、 0.2 — 0.3nmol/L下游外引物和1 — 1.5 mol/L甜菜碱；l U/nLUNG酶；其中lOxThermopol 反应缓冲液含有200 mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷一 盐酸、100 mmol/L氯化 钾、100mmol/L硫酸铵、20 mmol/L硫酸镁和1 %曲拉通X—100;(2) BstDNA聚合酶8U L
4. 如权利要求1所述的环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌的 方法，其特征在于上述的环介导等温扩增反应包括下列步骤(1) 待检样品DNA模板的提取提取待检样品DNA作为环介导等温扩增反应的模板，其中提取样品DNA的光密 度值OD26omo在1.6-2.0范围内，浓度在10-100 ng/^L之内;(2) 进行环介导等温扩增反应A.在装有23pLLAMP反应液的反应管中加入l^L上述待检样品模板DNA，和UNG酶，恒温50 。C放置3min后于恒温95 。C放置3_5 min，立即置于冰上l一3min;B. 在反应管中加入1 ^LBstDNA聚合酶；C. 于恒温60 — 65 。C放置45 — 90 min;D. 将温度调到80 — 95 °C，反应3 — 5 min后中止反应得到环介导等温扩增反应 的猪链球菌种属特异性基因的扩增产物的双链目标序列，取出待用。
5. 如权利要求1中所述的环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌 的方法，其特征是上述的双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在微孔板上进 行固定，其步骤如下将扩增产物--待测猪链球菌种属特异性基因的双链目标序列在100 'C水浴中煮沸 IO分钟，然后在冰浴中快速冷却得到待测猪链球菌种属特异性基因的单链目标序列， 取100nL所得单链目标序列的溶液至微孔板中，37 。C孵育过夜，再于60。C干燥箱 中0.5-1.5 h蒸干，用含有1%吐温20的0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液清洗除去未固定的 单链目标序列，即得到固定了单链目标序列的微孔板。
6. 如权利要求1所述的环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌的 方法，其特征在于上述的纳米硫化镉对来源于猪链球菌种属特异性基因的探针序列进 行标记含有标记探针序列的纳米硫化镉-探针序列标记液，其步骤如下将3.84 nL巯基乙酸加到50 mL浓度为0.6-1.4 mmol/L的氯化镉溶液中混合均匀， 用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节混合液的pH值为10.5-11.5，通氮气除氧25-45 min后， 在磁力搅拌下向上述混合液中氮气保护下缓慢滴加1.34 mmol/L的硫化钠溶液25-40 mL，滴加完毕后，继续搅拌24h，混合液逐渐地变成黄色，即得到纳米硫化镉溶胶， 取5.0 mL纳米硫化镉溶胶离心，水洗后分散于2.0 mL水中，加入100 40.0-60.0 mmol/L乙基(3-二甲基氨丙酸)碳二亚胺盐酸盐、100 pL 40.0-60.0 mmol/LN-羟基琥珀 酰亚胺及O.l mmol/L探针序列5'-GATTTCAACAACAGCTTCT-3'，室温下搅拌15-20 h， 该反应物在10000 r/in下离心25-45 min，用磷酸缓冲溶液洗涤多次，再分散于磷酸 缓冲溶液中，得到含有标记探针序列的纳米硫化镉-探针序列标记液，于-2 。C下保存 待用。
7. 如权利要求1中所述的环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌 的方法，其特征是上述纳米硫化镉探针序列标记液中的标记探针序列与固定了单链目标序列的微孔板上的单链目标序列进行分子杂交并进行同位镀汞阳极溶出伏安法的 电化学测定，其步骤如下取100 pL含纳米硫化镉标记探针的杂交缓冲溶液至固定了单链目标序列的微孔 板中，在45。C水浴中杂交20-40 min，得到杂交产物双链DNA,然后取出微孔板，用 含有1%吐温-20的磷酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液和水各冲洗5次，每次一分钟， 除去为杂交的除去未杂交的标记探针序列，将微孔板中残留的溶液轻轻拍出，取100 HL 1.0 mol/L的硝酸溶液注入微孔板各孔中静置5 min，氧化溶解杂交产物双链DNA 上的纳米硫化镉，然后注入20 5.0 mol/L氢氧化钠调节溶液的pH值到中性；取 150jiLpH4.7含1.8xlO—4mol/L汞离子的醋酸缓冲溶液加入微孔板中，直接以微孔板 上的微孔为微型化电解池，采用同位镀汞阳极溶出伏安法检测溶解的镉离子的含量， 以玻碳电极为工作电极，在-1.4V下沉积120-180s，静止5 s后从-1.2 V向-0.6 V溶出 扫描，在-1.01 V处出现的阳极溶出峰电流即为镉离子的含量的测量信号，此信号即 为猪链球菌属特异性基因的响应信号，并作为环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学 检测猪链球菌的依据。
全文摘要
本发明涉及一种环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌的方法，其特征在于该方法包括以下步骤以上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物在内的环介导等温扩增反应得到扩增反应物-待测猪链球菌种属特异性基因的双链目标序列，将该双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在微孔板上进行固定，然后将纳米硫化镉对来源于猪链球菌种属特异性基因的探针序列进行标记得到标记探针序列，将该标记探针序列与固定在微孔板上的目标序列进行分子杂交并进行同位镀汞阳极溶出伏安法的电化学测定，检测出与猪链球菌种属特异性基因相应的镉离子。其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且使用方便。
文档编号G01N27/48GK101324542SQ20081009398
公开日2008年12月17日 申请日期2008年4月25日 优先权日2008年4月25日
发明者伟 孙, 超 林, 奎 焦, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心