专利名称：快速检测单纯疱疹病毒i型的荧光定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种引起人类多种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种快速检测 单纯疱疹病毒I型荧光定量PCR试剂盒，适用于单纯疱疹病毒I型的定性定量检测。
背景技术：
单纯疱疹病毒(Herpse simplex virus，HSV)是一类严重危害人类健康、引起人类 多种疾病的常见病原体。HSV有HSVl和HSV2两个亚型，两个亚型的核苷酸同源性达50%， 而感染方式和临床表现却不相同。HSVl主要通过口腔分泌物的接触而感染，人群感染率高达50 90%，最常见的感 染部位是口腔和唇，可引起原发感染，且可造成潜伏感染和复发。HSVl原发感染常引起口 咽部疱疹、疱疹性角膜结膜炎、脑炎和皮肤疱疹性湿疹等；HSVl潜伏感染位于三叉神经节 和颈上神经节部位，潜伏病毒可被激活转为增殖性感染，病毒沿感觉神经纤维轴索下行返 回末梢，在局部上皮细胞内增殖，引起局部复发性疱疹。近年来随着口 -生殖器性行为的增 多，HSVl导致的生殖器疱疹正日益增多。因此，准确及时地诊断HSVl对指导临床治疗、评估疾病的发展和预后具有重大意 义。近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR, FQ-PCR) 技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Incetigationof HSV-I, HSV-2, CMV, HHV-6and HHV-8DNA BY real-time PCR in surgicalresection materials of eplepsy patients with mesial temporal lobesclerosis[J]. Journal of the Neurological Sciences. 2008,264 151-156 ；Assessment of bluetongue viraemia in sheep by real-time PCR andcorrelation with viral infectivity. [J]· Journal of the NeurologicalSciences, Available online IOMay 2010)禾口定量检测 (Quantitativecharacterization of cell transduction by HSV-Iamplicons using flowcytometry and real-time PCR[J]. Journal of the Neurological Sciences2009, 159 :160—166 ；Development of a novel TaqMan real-time PCR assayfordetecting rubella virus RNA. [J]. Journal of the NeurologicalSciences2010,168 :267_271)等 方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量的主要方法，国内目前已有关于丙肝、 乙肝、淋球菌、支原体、衣原体、艾滋病和结核定量检测的试剂盒上市。临床检测上传统的培养法和血清学方法具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费 力等缺点；常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能精确定量和PCR后处理 产生污染导致的假阳性等问题；因此隳待开发一种精确、灵敏、快速和无污染的临床检验方 法。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速检测单纯疱疹病毒I型的荧光定量PCR试剂盒。本发明采用以下技术方案一、PCR 试剂盒该试剂盒包括DNA提取液、荧光定量PCR反应液、HSVl标准阳性模板 PMD18-T-HSV1和阴性质控标准品；1、DNA 提取液配制0. OlM PBS (28. 94g Na2HPO4 · 12H20, 2. 6g KH2PO4 ·2Η20 加入 1000ml 超净水混 勻，调PH到7. 4)；2、荧光定量PCR反应液含有单纯疱疹病毒I型特异性引物对和荧光探针，1)单纯疱疹病毒I型(HSVl)正向引物为5 ‘ -GACGCCATATCCACCACCTTC-3 ‘，反向引物为5' -TGATGTGCGTCGCGTTGTAC-3‘；2)荧光探针序列为 5' -CCACCAACCTGACCGAGTACCCGC-3‘，荧光探针5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记不发光的淬灭基团标记BHQ，可 以大大减少背景噪音的干扰。3,HSVl标准阳性模板PMD18-T-HSV1是含有单纯疱疹病毒I型高度保守基因_糖 蛋白B基因的139个碱基对的核苷酸片段构成的PMD18-T载体，该载体可在大肠杆菌DH5 α
中增殖。4、阴性质控标准品 该阴性质控标准品为无菌双蒸水，用于阴性对照。二、PCR试剂盒的制备和检测方法PCR试剂盒的制备和检测方法包括下列步骤①配制DNA提取液；②配制荧光定量PCR反应液；③配制HSVl标准阳性模板PMD18-T-HSV1 ；④配制阳性定量标准品；⑤配制阴性质控标准品；⑥判断未知样本的阴阳性应用DNA提取液提取未知检测样本得到DNA，后再取HSVl阳性定量标准品和阴性 质控标准品分别加入装有荧光定量PCR反应液的PCR反应管中，然后置于PCR荧光定量仪 中进行反应；其中，以阳性定量标准品反应曲线作为标准对照，阴性质控标准品反应曲线作 为阴性对照，以阳性定量标准品反应曲线判断阳性样本的浓度，从而判断未知样本的阴阳 性及浓度。本试剂盒的工作原理在本发明提供的快速定量检测单纯疱疹病毒I型荧光定量PCR试剂盒中，有标记 了荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5'端 报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3'端淬灭基团淬灭，故体系中没 有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸， Taq DNA聚合酶利用其5' -3'外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的荧光共振能量转移(FRET)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内 的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对单纯疱疹病毒I型的定 量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中， 荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小， 起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成 标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。 在本发明提供的检测单纯疱疹病毒I型荧光定量PCR试剂盒中，针对单纯疱疹病 毒I型检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物和探针浓度、Mg2+浓度、退火 温度等的优化，并将FQ-PCR技术(荧光定量PCR技术)和定量检测系统相结合，将其用于 单纯疱疹病毒I型定量检测。通过优化方案，反复实验，建立了检测单纯疱疹病毒I型荧光 定量PCR方法，并研制出检测单纯疱疹病毒I型荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的灵敏度可 在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速诊断单纯疱疹病毒I型的要求。本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果1、定量准确；2、检测速度快，仅1. 5小时，加上样品DNA的提取制备，共仅需2小时；3、特异性好，灵敏度高；4、可鉴定检测单纯疱疹病毒I型；5、使用步骤简单，可重复性高。本试剂盒可对单纯疱疹病毒I型进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传 统的培养法。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步说明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克 等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社， 2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。一、关于制备和检测方法的实施例1、试剂盒组成与配制①配制DNA提取液DNA提取液组成提取液I 配制 0. OlM PBS (28. 94g Na2HPO4 · 12H20, 2. 6gKH2P04 · 2H20 加入 1000ml 超净水混勻，调pH到7. 4)。提取液II 在 pH7. 4Tris-EDTA 缓冲液(ρΗ7· 610mM Tris. HCL，pH8. OlmMEDTA)中， 按照1 100比例加入NP-40混勻后完成配制。将提取液II分装至5ml冻存管(有盖透 明管)内。分装量5ml/管。②配制荧光定量PCR反应液
a、荧光 PCR IOXBuffer 组成 500mM KClUOOmM Tris-HCl (PH9. 025°C ) U. 0% Triton X-IOO ；
b、荧光定量PCR反应液PCR IOXbuffer 5. 0 μ 1，正向引物和反向引物 各 1. 5μ l(10ymol/L)，荧光探针 1. 0 μ 1 (5 μ mol/L)，MgCl25 μ 1 (25mmol/L)，dNTPs 1· 0 μ 1 (10mmol/L)，Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ 1 (5U/ μ 1)，无菌双蒸水 29. 6 μ 1。③配制HSVl标准阳性模板PMD18-T-HSV浓度为IO9拷贝/ml标准阳性模板PMD18-T-HSV1。④将阳性标准模板系列稀释为IO8拷贝/ml、107拷贝/ml、106拷贝/ml、105拷贝/ ml、IO4 拷贝 /ml、IO3 拷贝 /ml。⑤配制阴性质控标准品该阴性质控标准品为无菌双蒸水。二、关于试剂盒的应用实验1、使用试剂盒快速检测单纯疱疹病毒I型①用DNA提取液从待测标本中提取HSV1DNA，具体过程如下a、将离心管中液体取500 μ 1转移至1. 5ml离心管中，12000rpm离心5min ；b、弃上清，加入500 μ 1提取液I，12000rpm离心5min ；C、弃上清，加入200 μ 1提取液I，12000rpm离心5min ；d、弃上清，加入50 μ 1提取液II ；e、振荡混勻，100°C恒温处理IOmin ；f、12000rpm离心5min，取上清液5 μ 1进行PCR扩增。②对贮存浓度为IO9拷贝/ml标准阳性模板PMD18-T-HSV1进行10倍的系列稀释， 制备阳性标准品，用紫外分光光度计测定A26tl对标准品定量。将阳性标准模板系列稀释为 IO8 拷贝 /ml、IO7 拷贝 /ml、IO6 拷贝 /ml、IO5 拷贝 /ml、IO4 拷贝 /ml、IO3 拷贝 /ml。③分别取荧光定量PCR反应液各45 μ 1，取①步骤所得HSV1DNA和②步骤稀释的 HSVl阳性标准模板各5μ 1，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪 上平行做PCR检测。循环条件为94°C预变性5min ；94°C 30s, 58°C 40s，5个循环；94°C 30s, 58°C40s，35个循环(收集荧光信号)。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时 进行，所用荧光为FAM，其吸收波长494nm，发射波长522nm。④通过比较待测样品和相应标准品的循环域值Ct值，对待测样品的起始拷贝数
进行定量。2、实验结果荧光定量PCR反应结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数。结果为 HSVl标准阳性模板IO8拷贝/ml、IO7拷贝/ml、IO6拷贝/ml、IO5拷贝/ml、IO4拷贝/ml、IO3 拷贝 /ml 的 Ct 值分别为 17. 52，20. 64，24. 43，27. 88，30. 69，34. 42 ；阴性对照为 0 或 40 ；反复重复试验3次，得到Ct值进行统计学分析P > 0. 05，数据差异无显著意义，说 明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。从上述实例可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定 量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需2个小时就能完成，而传统的细胞培养法约需1周左 右才能完成，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间，并且传统方法不能鉴定区别检测单纯 疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型。该试剂盒的操作只需1人即可完成整个定量操作过程，一次可检测32-384个(由定量检测仪的型号决定)样品，这样也减少了人力资源的浪费。
权利要求
一种快速检测单纯疱疹病毒I型的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括DNA提取液、荧光定量PCR反应液、HSV1标准阳性模板PMD18 T HSV1和阴性质控标准品；荧光定量PCR反应液含有单纯疱疹病毒I型特异性引物对和荧光探针；单纯疱疹病毒I型 HSV1正向引物为5′ GACGCCATATCCACCACCTTC 3′，反向引物为5′ TGATGTGCGTCGCGTTGTAC 3′；荧光探针序列为5′ CCACCAACCTGACCGAGTACCCGC 3′，荧光探针5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记BHQ，可以大大减少背景噪音的干扰，标准阳性模板PMD18 T HSV1是含有单纯疱疹病毒I型高度保守基因 糖蛋白B基因的139个碱基对的核苷酸片段构成的PMD18 T载体，该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖。
2.按权利要求1所述的PCR试剂盒的制备方法，其特征在于包括下列步骤①配制DNA提取液；②配制荧光定量PCR反应液；③配制HSVl标准阳性模板PMD18-T-HSV1；④配制阳性定量标准品；⑤配制阴性质控标准品；⑥判断未知样本的阴阳性。
3.按权利要求2所述的PCR试剂盒的制备方法，其特征在于步骤③ HSVl标准阳性模板PMD18-T-HSV1包含的gB基因的核苷酸序列为 GACGCCATATCCACCACCTTCACCACCAACCTGACCGAGTACCCGCTCTCGCGCGTNGACCTGGGGGACTGCATCGGCAAGGACGCCCGCGACGCCATGGACCGCATMTTMGCCCGCAGGTACAACGCGACGCACATMA ； N:G或者T;M:C或者T。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测单纯疱疹病毒I型的荧光定量PCR试剂盒，涉及一种引起人类多种疾病病原体基因检测技术，适用于单纯疱疹病毒I型定性定量检测。本发明由DNA提取液、荧光定量PCR反应液、HSV1标准阳性模板PMD18-T-HSV1、阴性质控标准品组成；荧光定量PCR反应液含有单纯疱疹病毒I型特异性引物对和荧光探针。本发明定量准确；检测速度快；特异性好，灵敏度高；可鉴定检测单纯疱疹病毒I型；使用步骤简单，可重复性高。本试剂盒可对单纯疱疹病毒I型进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法。
文档编号G01N21/64GK101979668SQ20101053396
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者唐景峰, 王业富, 王维旭, 赵友云 申请人:武汉百泰基因工程有限公司