专利名称：检验鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物鼠疫疫情监测与鼠疫诊断技术领域，尤其是能通过荧光显微镜检 查识别鼠疫菌，是一种检验鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒。
背景技术：
鼠疫是由鼠疫杆菌引起的一种自然疫源性烈性传染病，是我国《传染病防治法》规 定的甲类传染病，啮齿类是鼠疫的主要宿主动物和传染源，可自然感染鼠疫动物近200种。 我国已发现12个类型的鼠疫疫源地，分布于19个省区，面积130多万km2。20世纪90年代 以来，一些静息多年的鼠疫自然疫源地动物间鼠疫持续处于活跃状态，人间鼠疫时有发生， 远距离高速度传播的危险性增加。监测动物间鼠疫的流行状况，是预防控制人间鼠疫的重 要工作内容。实验室检验结果是制定实施鼠疫控制措施的重要依据，鼠疫传播速度快，防控鼠 疫应急反应需要快速的检测鼠疫技术。分离培养鼠疫菌最快要24小时才能出结果；胶体金 纸上色谱法、反相间接血凝试验等检测鼠疫菌及其抗原的免疫学方法，可在3小时内出结 果，最小检出量在IO5个菌体/ml，敏感性较低。显微镜检查鼠疫菌，美兰染色为两端浓染，革 兰氏染色为革兰氏阴性杆菌，显微镜检查美兰染色、革兰氏染色的标本速度快，但鼠疫菌和 肠杆菌科的细菌沒有明显差异，没有鉴别意义。根据应急反应的需要，检查鼠疫菌的准确、 稳定、快速、简便的检验鼠疫菌的方法的研究倍受关注。

发明内容
本发明提供了一种检查动物鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒，克服了现有动物鼠疫 监测与诊断技术中存在的问题。本发明是通过应用荧光免疫染色法显示鼠疫菌夹膜中的Fl 抗原，检查各种动物血液、器官、脏器组织中的鼠疫菌，经多次改进，现已制成具体有效的检 查鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒，可准确、稳定、快速、简便鉴定鼠疫菌，供鼠疫监测和诊断 使用。本发明的技术方案是通过以下措施来实现的一种检验鼠疫菌的荧光免疫染色 试剂盒，其包括冻干荧光素标记抗体1支，荧光抗体保存液2ml X 1支，固定液20ml X 1瓶， 10 X稀释液20ml X 1瓶，鼠疫菌阳性对照2ml X 1支，鼠疫菌阴性对照2ml X 1支，抑制用鼠 疫Fl抗体5ml X 1支，1 %硫柳汞2ml X 1支；所述萤光素标记抗体为异硫氰酸荧光素标记鼠 疫Fl抗体即FITC-FlAb。对上述本发明的技术方案可进一步进行如下的选择或/和优化 上述异硫氰酸荧光素标记鼠疫Fl抗体按下述方法得到
(1)抗鼠疫Fl抗原血清，用硫酸铵沉淀法提取鼠疫Fl抗体；
(2)含鼠疫Fl抗体20mg的生理盐水溶液27ml，加含异硫氰酸荧光素即FITC2mg的 0. 5mol/LpH9. 5碳酸盐缓冲液3ml，混勻；室温持续搅拌2小时；(3)边摇边缓慢加入饱和硫酸铵水溶液30ml，4°C放置1小时，4000X g离心10分钟，弃 上清；沉淀用生理盐水5ml溶解，边摇边缓慢加入饱和硫酸铵水溶液5ml，4°C放置1小时， 4000Xg离心10分钟，弃上清，再用50%饱和度硫酸铵洗涤沉淀2次，洗除游离异硫氰酸荧 光素即FITC，沉淀用生理盐水5ml溶解，即为FITC-FlAb溶液；
(4)将FITC-FlAb溶液装入透析袋，用0.01mol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液即PBS在4°C温 度下透析，每6-8小时换0. 01mol/LpH7. 2PBS液1次；将FITC-FlAb溶液移入试管；
(5)测定FITC-FlAb适用浓度，用浓度按容量/容量含50%新生小牛血清的0.Olmol/ LpH7. 2PBS稀释，分装，冻干，-20°C保存；
在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。本发明的有益效果被测物经过氧乙醇固定，使检测过程安全；突出特点是实验 条件简单，用荧光显微镜观察染色结果，全程60分钟，最小检出量为500个鼠疫菌体/ml ； 抑制试验可提高检测结果的准确性；为动物鼠疫监测和诊断提供了准确、快速、简便的检验 器具。
具体实施例方式本发明不受下述实施例的限制，可依据本发明的技术方案和实际情况来确定具体 的实施方式。下述实施例中，无特别说明均为常规方法；溶液浓度除注明外均为重量/容量。实施例1 检查动物鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒制备
一、检查动物鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒的组成
1.异硫氰酸荧光素标记鼠疫Fl抗体(FITC-FlAb)冻干 1支
2.荧光抗体保存液2ml 1支
3.固定液20ml 1瓶
4.10 X稀释液20ml 1瓶
5.鼠疫菌阳性对照(冻干剂)2ml 1支
6.鼠疫菌阴性对照(冻干剂)2ml 1支
7.抑制用鼠疫Fl抗体(冻干剂)5ml 1支 8.1%硫柳汞 2ml 1支
二、试剂盒各组分的制备方法
1.制备异硫氰酸荧光素标记鼠疫Fl抗体(FITC-FlAb)
(1)抗鼠疫Fl抗原血清，用硫酸铵沉淀法提取鼠疫Fl抗体；
(2)含鼠疫Fl抗体20mg的生理盐水溶液27ml，加含异硫氰酸荧光素(以下简称 FITC) 2mg的0. 5mol/LpH9. 5碳酸盐缓冲液3ml，混勻；室温持续搅拌2小时；
(3)边摇边缓慢加入饱和硫酸铵水溶液30ml，4°C放置lh，4000Xg离心10分钟，弃 上清；沉淀用生理盐水5ml溶解，边摇边缓慢加入饱和硫酸铵水溶液5ml，4°C放置1小时， 4000 Xg离心10分钟，弃上清，再用50%饱和度硫酸铵洗涤沉淀2次，洗除游离FITC，沉淀 用生理盐水5ml溶解，即为FITC-FlAb溶液；
(4)将FITC-FlAb溶液装入透析袋，用0.01mol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液即PBS，4°C透析， 每6-8h换液1次；将FITC-FlAb溶液移入试管；(5)测定FITC-FlAb适用浓度，用含50% (容量/容量)新生小牛血清0. Olmol/ LpH7. 2PBS稀释，分装，冻干，-20°C保存。2.荧光抗体保存液0. lmol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液与等量丙三醇混合，分装，每支 2ml。3.固定液75%(容量/容量)乙醇100ml，30%(容量/容量)H2O2 5ml，分装，每支 20ml。4. IOX稀释液制备0. lmol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液90ml，吐温-205ml，新生小牛血 清IOml，硫柳汞0. 2g，混合溶解分装，每支20ml。5.鼠疫菌阳性对照制备鼠疫菌EV株用0. 01mol/LpH7. 2PBS配制成5% (湿菌重 量/容量)菌液Iml，与含3 % H2O2的95 %酒精5ml混勻，20_37°C室温放置30分钟，4000 X g 离心10分钟，收集菌体，用含30%新生小牛血清0. 01mol/LpH7. 2PBS50ml制成混悬液，分装 每支0. 1ml，冻干。6.鼠疫菌阴性对照制备菌株为大肠杆菌，制备方法与鼠疫菌阳性对照相同。7.抑制用鼠疫Fl抗体0. 01mol/LpH7. 2PBS30ml，加硫柳汞0. Ig,新生小牛血清 10ml，加滴度为1 8000的鼠疫Fl抗体10ml，混勻，分装，每支0. 2ml，冻干。8. 硫柳汞硫柳汞lg，NaCl lg，加蒸馏水至100ml，分装，每支2ml。上述制备好的各种试剂定量分装，装入检查动物鼠疫菌的荧光免疫染色的试剂
品.ο实施例2 检查动物鼠疫菌的荧光免疫染色的试剂盒的应用方法 一、检查动物鼠疫菌的荧光免疫染色的器材与试剂配制
1.稀释液10X稀释液用0. 85%NaCl溶液稀释10倍。2. FITC-FlAb贮存液每支FITC-Fl抗体(冻干剂)加荧光抗体保存液2ml溶解，混 勻，-20°C保存，有效期6个月。FITC-FlAb应用液FITC_FlAb贮存液用稀释液10倍稀释，4°C保存10天。3.鼠疫菌阳性对照每支鼠疫菌阳性对照(冻干剂)用稀释液2ml溶解混勻。4.鼠疫菌阴性对照每支鼠疫菌阴性对照(冻干剂)用稀释液2ml溶解混勻。5.抑制用鼠疫Fl抗体用稀释液5ml溶解混勻。二、标本准备
1.印片用剪刀剪切待检标本，剪切面在吸水纸上轻按吸去过多血液，再将剪切面在 玻片上印片，同步制阳性、阴性对照涂片，自然干燥，火焰固定。2.涂片沾取待检菌液，涂片，同步制阳性、阴性对照涂片，自然干燥，火焰固定。3.富集细菌标本涂片新鲜、腐败或干枯的脏器、肌肉组织块，放入乳钵内剪碎， 研磨成糊状，按组织块重量的2倍加含杀菌剂的生理盐水，继续研磨制成混悬液。骨头用 纱布包裹骨头，用剪刀或骨钳剪断骨头的两端，采取红色骨髓；如骨髓干枯，可剪断骨头的 一端，用注射器注入少量含杀菌剂的生理盐水，浸泡30分钟，反复吹吸数次后吸出，或将另 一端打开，直接冲入试管内；也可用纱布包裹骨头，砸碎骨头红髓丰富的部位，在2倍容量 的含消毒剂的生理盐水中浸泡30分钟，反复冲洗，收集混悬液。混悬液、心血混悬液500 X g 离心3分钟或静置15分钟，弃组织块和细胞沉淀，吸取上清液，4000 Xg离心5分钟，沉淀 用少量生理盐水混悬，按常规法涂片，同步制阳性、阴性对照涂片，自然干燥，火焰固定。
三、检查鼠疫菌的荧光免疫染色
1.待检标本的涂片或印片2张与阳性对照、阴性对照同步进行。2.用火焰固定，滴加固定液覆盖标本或浸泡于固定液中5分钟，标本面的背面流 水冲洗1分钟。3.荧光免疫染色(1)抑制试验标本片，用Fl抗体应用液覆盖待检标本5分钟，流 水冲洗标本面的背面1分钟；
(2)荧光免疫染色片和抑制试验标本片，用FITC-FlAb应用液覆盖玻片上的标本，置湿 盒内28-37°C染色20分钟，流水冲洗标本面的背面1分钟。4.观察记录结果
荧光显微镜油镜1000X镜检，有鼠疫Fl抗原的鼠疫菌菌体呈明亮的黃绿色； 阳性、阴性对照染色结果必须与已知阳性、阴性相符，抑制试验与阴性相同； 按镜检染色清晰的菌体量分级未看到(_)，平均每视野有1-5个(+ )，每视野5个以上 (++),每视野50个以上(+++ )，满视野密布(++++ )。
权利要求
一种检验鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒，其特征在于包括冻干荧光素标记抗体1支，荧光抗体保存液2ml×1支，固定液20ml×1瓶，10×稀释液20ml×1瓶，鼠疫菌阳性对照2ml×1支，鼠疫菌阴性对照2ml×1支，抑制用鼠疫F1抗体5ml×1支，1％硫柳汞 2ml×1支；所述萤光素标记抗体为异硫氰酸荧光素标记鼠疫F1抗体即FITC-F1Ab。
2.根据权利要求1所述的检验鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒，其特征在于异硫氰酸荧 光素标记鼠疫F1抗体按下述方法得到(1)抗鼠疫F1抗原血清，用硫酸铵沉淀法提取鼠疫F1抗体；(2)含鼠疫F1抗体20mg的生理盐水溶液27ml，加含异硫氰酸荧光素即FITC2mg的 0. 5mol/LpH9. 5碳酸盐缓冲液3ml，混勻；室温持续搅拌2小时；(3)边摇边缓慢加入饱和硫酸铵水溶液30ml，4°C放置1小时，4000Xg离心10分钟， 弃上清；沉淀用生理盐水5ml溶解，边摇边缓慢加入饱和硫酸铵水溶液5ml，4°C放置1小 时，4000Xg离心10分钟，弃上清，沉淀再用50%饱和度硫酸铵洗涤沉淀2次，洗除游离的 FITC，沉淀用生理盐水5ml溶解，即为FITC-FlAb溶液；(4)将FITC-FlAb溶液装入透析袋，用0.01mol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液即PBS在4°C温 度下透析，每6至8小时换0. 01mol/LpH7. 2PBS液1次；将FITC-FlAb溶液移入试管；(5)测定FITC-FlAb适用浓度，用浓度按容量/容量含50%新生小牛血清0.Olmol/ LpH7. 2PBS稀释，分装，冻干，-20°C保存；在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。
全文摘要
本发明涉及动物鼠疫疫情监测与鼠疫诊断技术领域，是一种检验鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒，其包括荧光素标记抗体1支，荧光抗体保存液2ml×1支，固定液20ml×1瓶，10×稀释液20ml×1瓶，鼠疫菌阳性对照2ml×1支，鼠疫菌阴性对照2ml×1支，抑制用鼠疫F1抗体5ml×1支，1％硫柳汞5ml×1支；所述萤光素标记抗体为异硫氰酸荧光素标记鼠疫F1抗体。本发明的有益效果被测物经过氧乙醇固定，使检测过程安全；用荧光显微镜观察染色结果，程序简单，全程60分钟，最小检出量为500个鼠疫菌体/ml；抑制试验可提高检测结果的准确性；为动物鼠疫监测和诊断提供了准确、稳定、快速、简便的检验器具。
文档编号G01N33/533GK101839916SQ20101020199
公开日2010年9月22日 申请日期2010年6月17日 优先权日2010年6月17日
发明者丁雄杰, 唐建国, 徐兵, 热娜.吐尔地, 蒋卫, 雷刚 申请人:新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心