专利名称：一种快速检测HER-2 mRNA水平的荧光定量PCR诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测乳腺癌中HER-2 mRNA表达水平的基因诊断试剂盒及应用。
背景技术：
原癌基因HER-2也称为c-erbB-2或HER-2/neu，HER-2基因定位于人类染色体 17q21_22，编码具有酪氨酸激酶活性的细胞膜糖蛋白。HER-2分子在细胞表面以单体形式存在，此时基本无活性，当其与细胞外功能区的配体结合形成稳定的受体二聚体后才能产生活化信号，促使EGFR在细胞膜过表达，从而参与对细胞生长、繁殖和分裂的调控以及控制肿瘤的生长。研究表明HER-2可作为乳腺癌的预后评价指标，临床上HER-2阳性尤其是过表达的乳腺癌患者往往表现为生存率低、肿瘤恶性程度高、病情进展迅速、易发生淋巴结转移、 化疗缓解期缩短。乳腺癌的个体化治疗始于20世纪70年代人们对雌激素受体(ER)的生物学特性的理解，ER(+)是预测内分泌治疗反应性的重要依据。ER(+)患者应用内分泌治疗的有效率为50% 60%，而阴性者有效率仅约10%。随着研究的深入，HER-2基因活化可通过抑制ER的功能与状态导致了激素依赖性消失。HER2(+)者可使ER(+)患者对内分泌治疗的反应率降至20%，ER(-)患者内分泌治疗几乎无效。研究表明HER2(+)的病人临床上往往表现出对TAM耐药甚至加速某些癌细胞的转移，其机制可能是直接干扰雌激素受体 ER作用并影响细胞间信号转导通路过程。目前，HER-2不仅可作为评价乳腺癌预后的重要指标，而且其表达量对辅助化疗疗效的预测亦有指导作用。乳腺癌HER2阳性患者，不仅其预后较差，而且复发的风险显著增加。因此，如何精确的评估HER2状态对目前治疗HER2阳性的乳腺癌患者意义重大。检测HER2的新方法必须与现行的测量标准进行严格的比较。目前美国食品和药物管理局(FDA)已经批准运用免疫组织化学(IHC)和荧光原位杂交(FISH)技术评估HER2水平，但该法检测HER2状态是否为最佳仍然存在较大的争议。免疫组化检测中分析标准不同和评价者主观偏差均可导致 HER-2检测结果不一致；最新研究对荧光定量PCR(qRT-PCR)与FISH技术检测HER-2状态进行了比较，结果表明两者检测HER-2阳性率分别为12%和11%;检出一致性为97%，同时研究发现FISH检测阴性而qRT-PCR检测阳性的肿瘤较常见，提示qRT_PCR技术检测HER-2 状态的特异性和准确性更高。本试剂盒采用qRT-PCR技术，为早期特异性检测HER-2状态提供了一种新方法，为临床HER-2阳性乳腺癌患者合理的选择术后化疗方案提供了强有力的证据。

发明内容
本发明的目的在于提供一种能快速、简便、敏感、特异的检测HER_2mRNA的试剂盒及其应用。本试剂盒包括第一链cDNA合成试剂盒25mmol/L MgCl2 4 μ L，IOX逆转录酶缓冲液 2 μ L，10mmol/L dNTP 2 μ L, RNA 酶抑制剂 0. 5 μ L, Oligo (dT) 15 0. 5 μ g, AMV 逆转录酶 15U, DEPC 水；上述试剂盒还包含HER-2、内参基因引物和I^qman荧光探针的合成HER_2基因引物序列上游5' -GACCGGAGGCTGACCAGT-3‘；下游5' -GGCAAGGCTGGCATGCGG-3‘；荧光探针Taqman 荧光探针FAM 5，-GGCCCGCTGCCCCAGCGGTG-3，TAMRA ；GAPDH 基因引物序列 上游5' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，；下游5' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，；荧光探针F AM5，-ACCACCACGGCCGAGCGG-3‘ TAMRA ；本发明还包含PCR反应液及lightcycler PCR仪。PCR 反应液包含 IXPCR buffer,0. 3-0. 5pmol/y L 的引物、0. 1-0. 3pmol/ μ L 的探针、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、1_2U 的 Taq 酶、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 2-1U 的 UNG 酶、 0. 3-0. 6mMdUTP0本发明首先获取临床癌组织样本，快速提取组织RNA，进行RT-PCR合成第一链 cDNA ；然后配置PCR反应液进行荧光定量PCR，在LightCycler数据分析系统中读出CT值结果。分别计算HER-2及β-actin基因的Ct值，两者之差即为Δ Ct值。荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。本发明的优点和效果(1)敏感荧光PCR检测技术是综合了 PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。(2)特异使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。(4)快速速度快、高通量，可在3-4小时完成。
具体实施例方式下面结合具体实施一例，进一步阐述本发明。本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。(1)本发明试剂盒组成如下① Trizol②第一链cDNA合成试剂盒(RT-PCR)③引物包括目的基因HER-2和内参基因β-actin，具体如下④上游5'-GACCGGAGGCTGACCAGT-3‘；⑤下游5'-GGCAAGGCTGGCATGCGG-3‘；⑥β -actin基因引物序列⑦上游5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'；下游5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，；⑧荧光探针FAM5，-GGCCCGCTGCCCCAGCGGTG-3，TAMRA ；FAM5’ -ACCACCACGGCCGAGCGG-3 ’ TAMRA
⑨PCR 反应液IXPCR buffer,0. 3-0. 5pmol/y L 的引物、0. 1-0. 3pmol/y L 的探针、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、1_2U 的 Taq 酶、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 2-1U 的 UNG 酶、 0. 3-0. 6mMdUTP、通常取2_5 μ L的模板、反应总体积为25 μ L(以上所有的浓度都是指终浓度)⑩PCR扩增程序的设定在Iightcycler上通常是先50°C 2分钟93°C 3分钟，然后93°C 5秒60°C 20秒，循环40次，在60°C时，设定荧光检测点。(2)检测流程首先根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。获取临床癌组织样本，快速提取组织RNA，进行RT-PCR合成第一链cDNA ；配置PCR反应液进行荧光定量PCR。在 LightCycler数据分析系统中读出CT值结果。分别计算HER-2及β -actin基因的Ct值， 两者之差即为Δ Ct值。荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。具体步骤如下①组织总RNA的抽提按RNA抽提纯化的方法抽提癌和癌旁组织总RNA。提取的 RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定^Onm与^Onm光密度值计算RNA的纯度与浓度，用0. 1% DEPC处理的水调节抽提的RNA至相同浓度。②反转录合成cDNA 取2 μ L上述RNA液在70°C保温IOmin随后加入25mmol/ L MgC124y L，IOX 逆转录酶缓冲液 2μ L，10mmol/L dNTP 2 μ L，RNA 酶抑制齐[J 0. 5 μ L， Oligo (dT)15 0. 5μ g, AMV逆转录酶15U，补加DEPC处理水至总体积20 μ L，于42°C保温 15min，进行逆转录反应，合成cDNA第一链。反应结束后，加热至99°C 5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水混勻置冰箱_20°C保存。③荧光定量PCR扩增建立25μ L反应体系5Xreal-time PCR buffer 5 μ L, MgCl2O. 5 μ L, dNTP 0. 75 μ L，前引物 0. 4 μ L，后引物 0. 4 μ L，探针 0. 7 μ L，Taq 酶 0. 25 μ L, 模板2 μ L，加水补足至25 μ L。在(LightCycler)荧光定量PCR扩增仪上完成，反应条件如下变性94°C，5s ；退火和延伸60°C, 30s ；共50个循环。④数据收集处理和分析将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出目的基因相对于内参基因(β-actin)的相对表达量后再进行统计分析。(3)试剂盒检测能力评价前期实验表明，与以往癌组织的免疫组化和荧光原位杂交检测相比，本试剂盒敏感性、特异性及灵敏度更为精确，完全符合目前临床诊疗实用要求①敏感性94.6%;②特异性100%;③灵敏度本发明用于检测HER_2mRNA的最低检出限为2ng ；④重复性多次重复实验结果一致；⑤阳性预测值阳性预测值达到100% ；⑥阴性预测值阴性预测值达到95% ；⑦耗时一份临床标本的检测时间约为4h，耗时短。上述实验可以说明，本试剂盒具有较好的特异性和敏感度，检测的结果更为精确， 其检测结果可为临床乳腺癌的化疗和预后提供更好的依据。
权利要求
1.一种快速检测HER-2mRNA水平的荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于 本试剂盒包括第一链cDNA合成试剂盒25mmol/L MgCl24 μ L，10 X逆转录酶缓冲液2μ L, 10mmol/L dNTP 2 μ L，RNA 酶抑制剂 0. 5 μ L，Oligo (dT) 15 0. 5 μ g，AMV 逆转录酶 15U， DEPC 水；试剂盒还包含HER-2、内参基因引物和Taqman荧光探针的合成，HER-2基因引物序列包含上游引物和下游引物；上游引物5 ‘ -GACCGGAGGCTGACCAGT-3 ‘，下游引物5 ‘ -GGCAAGGCTGGCATGCGG-3 ‘；Taqman 荧光探针FAM 5，-GGCCCGCTGCCCCAGCGGTG-3，TAMRA ；GAPDH基因引物序列包含上游引物和下游引物；上游引物5 ‘ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，，下游引物5' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，；荧光探针FAM5，-ACCACCACGGCCGAGCGG-3，TAMRA。
2.根据权利要求书1所述的PCR试剂盒，其特征是 试剂盒包含PCR反应液及lightcycler PCR仪。PCR 反应液包含 IXPCR buffer、0. 3-0. 5pmol/y L 的引物、0. 1-0. 3pmol/μ L 的探针、 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、1_2U 的 Taq 酶、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 2-1U 的 UNG 酶、0. 3-0. 6mMdUTP。
3.根据权利要求书1所述的PCR试剂盒，其特征是首先获取临床癌组织样本，快速提取组织RNA，进行RT-PCR合成第一链cDNA ；然后配置PCR反应液进行荧光定量PCR，在 LightCycler数据分析系统中读出CT值结果。分别计算HER-2及β -actin基因的Ct值， 两者之差即为Δ Ct值。荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测HER-2 mRNA水平的荧光定量PCR诊断试剂盒，涉及一种癌基因检测技术。本发明由第一链cDNA合成试剂盒、PCR反应液及lightcycler PCR仪组成第一链cDNA合成试剂盒包含MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTP、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)15、AMV逆转录酶和DEPC水，还包含HER-2、内参基因引物和Taqman荧光探针的合成；引物分为上游引物和下游引物。本发明具有较好的特异性，灵敏度和重复性，定量精确，快速简便，适用于HER-2基因的早期特异性地定性定量检测，可为临床乳腺癌的化疗和预后提供更好的依据。
文档编号G01N21/64GK102465176SQ20101054057
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月11日 优先权日2010年11月11日
发明者李艳, 童永清 申请人:武汉康苑生物医药科技有限公司