专利名称：一种板蓝根抗流感病毒生物检定试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于医疗器械领域，具体来说是涉及一种板蓝根抗流感病毒生物检定试齐U盒。
背景技术：
流感病毒属正粘病毒科，带有节段、单股负链RNA基因组的包膜病毒，其中甲型流感病毒外膜上镶嵌着3种膜蛋白，分别为神经氨酸酶(NA)、血凝素(HA)和M2蛋白。NA在新复制的子代病毒释放上起重要作用，是重要的抗原；HA在病毒与宿主细胞膜结合时与受体结合，是重要的中和抗原；M2蛋白具有离子通道活性，可调节膜内pH值。专门针对这三种蛋白靶点的药物应运而生。目前市面上研制的抗流感病毒的药物主要是通过上述不同作用途径发挥作用的，但西药往往作用途径单一、易产生耐药性，也存在较大或潜在的副作用。中药为多成分复杂体系，具有多途径、多环节、多靶点的作用特点，在新型抗流感病毒研制中日益受到重视。板蓝根为中药抗流感病毒的典型代表，疗效确切，临床应用广泛；但板蓝根产地繁多、品质参差不齐，而目前的质量控制标准主要是针对板蓝根中的精氨酸进行检测的，精氨酸既不是有效成分，也不是特征性成分，质量控制意义不强。与临床疗效关联紧密的生物检定渐已成为中药特别是有效成分尚不明确的中药质量控制的有效方法，这已成为中药质量标准行业的发展趋势，并已载入《中国药典》2010年版。板蓝根具有抗流感病毒作用，但目前尚未有针对板蓝根抗流感病毒活性快速而全面的检测方法，更缺乏具有全面、高效、便捷且无环境污染等优势，可体现多途径、多环节、多靶点作用特点的板蓝根抗流感病毒生物检定试剂盒。试剂盒作为快速检测药品或生物制品的医疗器械被广泛使用，但大多数试剂盒是专门针对某一类结构的，选择性较差，如Elisa试剂盒，针对的是抗原-抗体反应。目前市面上仅有供西药抗病毒筛选的试剂盒，并没有专门能体现中药板蓝根抗流感病毒多途径、多环节、多靶点的作用特点的检定用试剂盒，也未充分考虑板蓝根供试品溶液有一定背景色泽，进而影响神经氨酸酶活性荧光值的检测等实际情况。
发明内容本实用新型的目的是提供一种全面、高效、便捷且无环境污染的板蓝根抗流感病毒生物检定试剂盒。本实用新型采用如下技术方案本实用新型包括有盒体、顶盖和溶液试剂瓶，盒体内部的底部垫有下缓冲垫，下缓冲垫上开有凹槽，测试液容器镶嵌在凹槽内，在盒体内放置96孔酶标板和96孔微量板。盒内溶液试剂瓶的个数为12个，分别为蒸馏水试剂瓶、神经氨酸酶反应终止液试剂瓶、神经氨酸酶缓冲液试剂瓶、板蓝根生物检定参照物试剂瓶、神经氨酸酶反应底物试剂瓶、三个不同来源的神经氨酸酶溶液试剂瓶、磷酸盐缓冲液试剂瓶、阿氏液试剂瓶、流感病毒Hmi的凝集素HA重组蛋白试剂瓶和植物凝集素PHA试剂瓶。
3[0008]盒体是矩形或圆形聚苯乙烯泡沫盒。顶盖内壁覆盖有上缓冲垫。盒内还放置有一个用于待装血红细胞的离心管和十张显微观察用载玻片。本实用新型的积极效果如下本实用新型试剂盒盒体采用聚苯乙烯泡沫，盒体顶端和底端分别设有上、下橡胶缓冲垫，不仅隔热便于低温保存，而且在储藏运输中能够防压以防损坏，便于携带。本实用新型的下缓冲垫具有与实际容器适宜、大小不一的凹槽，且每个凹槽具有不同颜色，与瓶子的盖子颜色相同，便于实验操作过程中准确无误使用。使用本实用新型进行板蓝根抗流感病毒生物检测涉及两种方法一是基于96孔黑色酶标板荧光分光光度法检测的板蓝根抗流感病毒生物活性检测；二是基于肉眼观察法检测的板蓝根抗流感病毒生物活性检测(必要性辅以显微镜观察法佐证)。它们具有检测原理清晰、操作简单、高效快捷、普适性强、易于推广等优点，还能充分体现中药板蓝根抗流感病毒作用的多途径、多靶点、多环节的作用特点，使检测更为客观可靠、科学合理。基于96孔黑色酶标板荧光分光光度法检测的板蓝根抗流感病毒生物活性检测中，采用不同来源、不同亚型的神经氨酸酶，且均为重组蛋白，无病毒活力，无环境污染，可在普通实验室条件下进行操作；同时，试剂盒中几种不同来源的神经氨酸酶，是经过反复筛选组合成的，并且是对大批量板蓝根进行测定后确定有效的，因此本实用新型试验盒实用性强。板蓝根供试品溶液本身有一定的背景荧光，对检测有一定干扰，这也是一般抗流感病毒试剂盒难以解决的症结。本试剂盒能有效地克服这个问题，因所遴选并有机组合的神经氨酸酶具有较强的活性，可使板蓝根供试品在较低的浓度条件下进行检测，从而大大地减少了背景荧光，符合检测方法学要求。

图1是本实用新型试剂盒内部结构示意图；图2为本实用新型下缓冲垫结构示意图；图3为本实用新型96孔酶标板结构示意图；图4为本实用新型96孔微量板结构示意图。图中，1盒体、2顶盖、3测试液容器、4下缓冲垫、5凹槽、6上缓冲垫、7 96孔酶标板、8 96孔微量板。
具体实施方式
以下结合附图详述本实用新型的技术方案。如图1所示，本实用新型包括有盒体1、顶盖2和溶液试剂瓶3，盒体内部的底部垫有下缓冲垫4，顶盖内壁覆盖有上缓冲垫6。如图2所示，下缓冲垫上开有凹槽5，测试液容器镶嵌在凹槽内。在盒体内放置96孔酶标板7和96孔微量板8，分别如图3、4所示.盒体是矩形或圆形聚苯乙烯泡沫盒。盒内还放置有一个用于待装血红细胞的离心管和十张显微观察用载玻片。盒内溶液试剂瓶的个数为12个，分别为蒸馏水试剂瓶、神经氨酸酶反应终止液试剂瓶、神经氨酸酶缓冲液试剂瓶、板蓝根生物检定参照物试剂瓶、神经氨酸酶反应底物试剂瓶、三个不同来源的神经氨酸酶溶液试剂瓶、磷酸盐缓冲液试剂瓶、阿氏液试剂瓶、流感病毒Hmi的凝集素HA重组蛋白试剂瓶和植物凝集素PHA试剂瓶。本实用新型的下缓冲垫具有与实际容器适宜、大小不一的凹槽，且每个凹槽具有不同颜色，与瓶子的盖子颜色相同，以从瓶盖的色泽与外观尺寸吻合度便于实验操作过程中准确无误使用。本试剂盒保存有效期为3个月。本实用新型12个溶液试剂瓶采用不同颜色的塑料瓶，分别装有蒸馏水、神经氨酸酶反应终止液、神经氨酸酶缓冲液、板蓝根生物检定参照物、神经氨酸酶反应底物、三种不同来源的神经氨酸酶溶液以及磷酸盐缓冲液、阿氏液、凝集素HA重组蛋白，此外还包括预留用离心管。其中，蒸馏水用紫色塑料瓶装，体积为lani，用于稀释神经氨酸酶溶液和板蓝根供试溶液，2-8°C保存；神经氨酸酶反应终止液用蓝色塑料瓶装，体积为20ml，由甘氨酸和脯氨酸加25%乙醇溶解，使两种氨基酸的浓度分别为0. lmol/L,用氢氧化钠调pH至10.7配制而成，2-81保存；神经氨酸酶检测缓冲液用淡蓝色塑料瓶装，体积为6ml，主要成分是3. 25mmol/L 2-吗啉乙磺酸(MES)，4mmol/L氯化钙和4mmol/L氯化镁，三者质量比为1:1:1,为稀释神经氨酸酶底物用溶液，用氢氧化钠调PH至6. 5，2-8°C保存；板蓝根反应参照物用红色塑料瓶装，体积为1ml，成分为奥斯他韦酸，其准确名称为(3R，4R，5S) — 4 一乙酰胺一 5 —氨基一 3(1 —乙基丙氧基)一 1 一环己烯一 1 一羧酸，其浓度为50ng/ml，-2(TC保存；神经氨酸酶反应底物用棕色塑料瓶装，体积为1ml，主要为4MUMUNA(2' -(4-MethylumbelIiferyl)-α -D-N-acetylneuraminic acid)，浓度为 0. 12mmol/L, _20°C保存；三种神经氨酸酶溶液分别为MDCK细胞感染H2N3病毒的神经氨酸酶溶液、霍乱弧菌的神经氨酸酶溶液、重组Hmi病毒的神经氨酸酶溶液。MDCK细胞感染病毒的H2N3神经氨酸酶溶液用黑色塑料瓶装，体积为1ml，-20°C保存；霍乱弧菌的神经氨酸酶溶液用朱红色塑料瓶装，体积为1ml，_20°C保存；重组Hmi病毒的神经氨酸酶溶液用黄色塑料瓶装，体积为1ml，_20°C保存；重组Hmi病毒的凝集素HA用橙色瓶子装，体积为1ml，_20°C保存；植物凝集素PHA用橘黄色瓶子装，体积为1ml，-20°C保存；磷酸盐缓冲液(PBS)用粉色瓶子装，体积为50ml，2-8°C保存；阿氏液用棕红色瓶子装，体积为50ml，2-8°C保存；预留用离心管为黄绿色。使用本实用新型试剂盒进行检定的有如下两种方法方法一抑制神经氨酸酶实验加样在96孔黑色酶标板中，加入样品与酶试液，室温作用15-30分钟。样品量为25-50 μ 1，酶试液为25 μ 1。每个浓度设复孔。孵育在上述孔中加入底物，在25°C恒温30-60分钟。同时设定不加样品组以及不加样品与神经氨酸酶组，每个浓度设复孔。测定每孔加入终止液200-300 μ 1终止反应，在检测温度25°C下，在荧光酶标仪下，激发波长360nm，发生波长460nm下测定其荧光强度值，并计算反应抑制率。方法二 凝集反应测定在〃V〃形、底角呈90°的96孔微量板上，用PBS将供试品溶液做2倍系列稀释，每个浓度做双孔平行，每孔加入50 μ 1，最后1孔加入PBS 50 μ 1作为阴性对照，同时设立HlNl流感病毒HA组和植物凝集素(PHA)组，作为阳性对照。再向每孔加入1%红细胞混悬液50 μ 1，轻拍微量板30秒混勻，4°C静置2小时后观测结果。[0033]将微量板置于白色背景之上进行肉眼观察，阴性对照孔的红细胞应集中在孔底中央，形成一个小团，边缘光滑，将板倾斜片刻，红细胞如泪滴状滑动。将供试品溶液孔、阳性对照孔与阴性对照孔比较。以红细胞均勻附着在孔壁上，底部仅有少量红细胞者(不超过阴性对照孔的1/4)判为阳性(+)，其余为阴性(一)。以上所述，为本实用新型的较佳实施案例，并非对本实用新型作任何限制，凡是根据本实用新型技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本实用新型技术方案的保护范围内。
权利要求1.一种板蓝根抗流感病毒生物检定试剂盒，包括有盒体(1)、顶盖(2)和溶液试剂瓶 (3)，其特征在于，盒体内部的底部垫有下缓冲垫(4)，下缓冲垫上开有凹槽(5)，测试液容器镶嵌在凹槽内，在盒体内放置96孔酶标板(7 )和96孔微量板(8 )。
2.根据权利要求1所述的板蓝根抗流感病毒生物检定试剂盒，其特征在于，盒内溶液试剂瓶的个数为12个，分别为蒸馏水试剂瓶、神经氨酸酶反应终止液试剂瓶、神经氨酸酶缓冲液试剂瓶、板蓝根生物检定参照物试剂瓶、神经氨酸酶反应底物试剂瓶、三个不同来源的神经氨酸酶溶液试剂瓶、磷酸盐缓冲液试剂瓶、阿氏液试剂瓶、流感病毒Hmi的凝集素 HA重组蛋白试剂瓶和植物凝集素PHA试剂瓶。
3.根据权利要求1所述的板蓝根抗流感病毒生物检定试剂盒，其特征在于，盒体是矩形或圆形聚苯乙烯泡沫盒。
4.根据权利要求1所述的板蓝根抗流感病毒生物检定试剂盒，其特征在于，顶盖内壁覆盖有上缓冲垫(6)。
5.根据权利要求1所述的板蓝根抗流感病毒生物检定试剂盒，其特征在于，盒内还放置有一个用于待装血红细胞的离心管和十张显微观察用载玻片。
专利摘要本实用新型涉及一种板蓝根抗流感病毒生物检定试剂盒，它包括有盒体、顶盖和溶液试剂瓶，盒体内部的底部垫有下缓冲垫，下缓冲垫上开有凹槽，测试液容器镶嵌在凹槽内，在盒体内放置96孔酶标板和96孔微量板。本实用新型不仅隔热便于低温保存，而且在储藏运输中能够防压以防损坏，便于携带，下缓冲垫上的凹槽与瓶子的盖子颜色相同，便于实验操作过程中准确无误使用。使用本实用新型具有全面、高效、便捷且无环境污染等优势，可体现中药抗流感病毒多途径、多环节、多靶点的作用特点，适宜于作为板蓝根抗流感病毒生物检定试剂盒。
文档编号G01N21/64GK202330286SQ201120472100
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月24日 优先权日2011年11月24日
发明者李寒冰, 肖小河, 谭曼容, 邱玲玲, 鄢丹 申请人:中国人民解放军第三O二医院