专利名称：大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法
技术领域：
本发明涉及ー种大型浅水湖泊蓝藻水华的治理方法，具体涉及ー种大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法。
背景技术：
水体富营养化导致淡水资源污染性匮乏。蓝藻的异常繁殖和水华的形成是湖泊富营养化最重要的表征之一。目前许多研究者都认识到，夏季的水华形成与冬季湖泊沉积物中的越冬蓝藻有重要关系。例如太湖中蓝藻秋季下沉到底泥表面越冬，翌年春季蓝藻复苏，从底泥表面上升至水表面，为水华形成提供必须的“种源”。基于这种认识，对夏季蓝藻水华的控制，就不能等到其已经形成巨大生物量，在全湖随风到处漂移扩散后再采取措施，到那时所需要付出的人力物カ将会大大增加，而应该在蓝藻越冬休眠或者春季复苏这些藻类生命过程中最薄弱的环节，即藻类大量繁殖形成水华之前，采取更加有针对性的措施对其进行消減。 根据目前对大型浅水湖泊(如太湖)历年的研究报道，蓝藻水华在春夏之际总是在某些特定湖区首先形成，随后才蔓延致全湖。这是由于湖面风场和湖流的作用，将大面积水华在秋季下沉过程中迁移到特定区域聚集，形成主要越冬种源地。针对蓝藻种源地的底泥疏浚不但极大地消减来年春夏季蓝藻的复苏量，降低夏季水华形成的強度，而且可以使有限的工程处理能力效果最大化，达到事半功倍的效果。目前正在开展的大型湖泊清淤疏浚工程主要是以消减营养盐、去处底泥表层污染物或清除湾区淤泥作为考量，并不适合越冬蓝藻种源疏浚的特点。因此，发展一种针对湖泊越冬蓝藻种源地疏浚的位置判定方法将有助于提高大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚的针对性和科学性。

发明内容
本发明g在提供ー种大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法，综合运用生态学、生物化学检测方法，从蓝藻种源的数量、种类和活性三个方面对大型浅水湖泊底泥表面蓝藻的分布特性进行分析，通过初步筛选和精确筛选，尽可能真实地在疏浚前对底泥表面蓝藻分布格局进行全方位的监测，以确定整个湖泊底泥表层蓝藻的越冬区域，进而为湖泊底泥疏浚确定位点，提高针对湖泊底泥表层特定位置进行蓝藻种源疏浚工程措施的针对性和科学性。本发明的上述目的是这样实现的
ー种大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法，其特征在于在蓝藻越冬复苏期，分布于湖区设定监测点对湖泊底泥表层取样分析；通过分析底泥表层中的色素含量表征越冬蓝藻种源的总生物量及其空间分布，根据色素含量初步筛选蓝藻种源的总生物量分布较高的区域为备选区域；在备选区域增设采样点，通过显微镜观测和流式细胞方法对底泥表层蓝藻种群进行定性定量分析，确定去除越冬蓝藻种源的目标种群和数量；利用细胞光合作用活性和/或酯酶活性表征底泥表层蓝藻细胞的生理活性；对备选区域根据目标种群数量进ー步进行筛选，辅以蓝藻细胞的生理活性进行校正，在备选区域中优先选取目标种群数量和生理活性较高的区域，进行密集采样分析，通过空间网格划分和空间插值，对疏浚区进行评估，确定越冬蓝藻种源疏浚位点。本发明所述的越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法，具体包括以下步骤
I)在蓝藻越冬复苏期，基于湖区水体面积和特征设定监测点，监测期内在各监测点底泥表层取样。选择连续3天静风天气，以减小风场对藻类垂直运动的影响，对全湖底泥表层进行全水域采样。泥样切取最上层2cm左右厚度的表层底泥，并即时測定各项水质參数。在每个采样点采集3份平行样品。2)利用色素分析測定底泥中的藻蓝素含量，表征越冬复苏期底泥表层蓝藻种源的 总生物量及其在湖区的分布格局，以藻蓝素含量较高的区域初步确定为疏浚的备选区域。藻蓝素可采用分光光度法进行測定。底泥样品的处理方法为称取一定量的底泥样品，风干至恒重，计算含水率；称取一定量样品放入研钵中，加入0. 05 M Tris缓冲液(pH7. 0)研磨，于4°C黑暗条件下静置8-10h，离心并将上清液用90%丙酮定容。此待测液用于測定藻蓝素含量。
通过突光分光光度计测定样品突光强度，激发光波长为620nm,发射光波长647nm,标准曲线法定量，即以荧光强度对藻蓝素浓度作出工作曲线，再根据底泥样品重量或水样体积计算出藻蓝素含量。根据底泥中藻蓝素含量，可以确定不同水域的底泥表层中蓝藻的生物量，反映蓝藻种源越冬复苏期在湖区的空间分布格局，进而初歩确定蓝藻的越冬区域，并选取藻蓝素含量最高的若干监测点所在区域作为备选区域进行进一歩分析。3)在备选区域增设采样点，通过流式细胞技术和显微镜观测，进ー步对底泥蓝藻种源的目标种群和数量进行定性定量分析，确定去除越冬蓝藻种源的目标种群和数量，将备选区域按目标种群的数量进行排序。通过对表层泥样稀释和过滤，采用流式细胞技术辅以显微镜镜鉴对底泥表层蓝藻特定种群(如铜绿微囊藻)进行定性定量分析。流式细胞方法为采用流式细胞仪，激光波长分别为488nm和600nm，色素的自发荧光通过FL3 (675/20nm,叶绿素a荧光)和FL4 (660/20nm,藻蓝素荧光)两个检测通道收集。非藻类颗粒或聚集细胞可以通过自发荧光(FL3/FL4)和形态结构參数(FSC/SSC)的差异去除。显微镜镜鉴中细胞计数使用双组分绝对计数微球。4)測定藻细胞的光合作用活性和/或酯酶活性，对备选区域的蓝藻细胞生理活性进行排序。对每个采集的样品分别测定藻细胞的光合作用能力和酯酶活性，其中通过色素荧光分析仪进行藻类光合活性分析，当温度降至I 4°C时，藻蓝素光合作用有可能消失，此时辅以酯酶检测方法分析藻细胞活性。藻类光合作用活性分析的具体操作如下取泥样稀释过滤，适量装入測量杯，暗适应15min先打开测量光(ML)，待初始荧光稳定后得到Fo，打开饱和光强(ST)，得到样品的Fm和光系统II的最大光合效率，并测定快速光响应曲线。
酯酶活性检测方法分析藻细胞活性的具体方法如下取泥样稀释过滤，向藻液中加入适量荧光染料，室温避光染色后，通过流式细胞仪检测酶活的强度。通过光合活性分析得到的Fv/Fm、光系统II的最大光合效率以及快速光响应曲线可以全面表征藻细胞的光合作用能力，而酯酶活性检测通过染色后FLl通道荧光信号的强弱表示酯酶活性大小。两者都从不同角度表征藻细胞的活性状态，从而对备选区域进ー步筛选，优先选取特定目标种群活性较高的区域作为疏浚位点。5)根据备选区域的目标种群生物量和蓝藻细胞生理活性的排序，在备选区域中优先选取目标种群数量和生理活性较高的区域，进行密集采样分析，根据目标种群生物量和蓝藻细胞生理活性，通过空间网格划分和空间插值，对疏浚区域进行计算和评估，从而获得越冬蓝藻种源疏浚位点。 对底泥表面的种源疏浚主要针对底泥表面的2_3cm的蓝藻种源细胞，在方式上应采取低强度疏浚方式，这不但减少对生态环境的破坏，还可避免因底泥内源营养盐释放造成的二次污染。另外，还可根据本专利确定的位点采取湖泊底质改造方法如改性黏土技术、水底耕耘改土技术，水底铧耕改土技术等；或采用稻杆等生物抑藻方法对蓝藻种源进行清除。本发明的优点及效果本发明的大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法紧紧围绕消除底泥越冬蓝藻种源量这一目标，选择和建立了一系列分析指标和方法，通过在湖区布设多处监测点采集泥样，进行多项理化、细胞生物学分析，从蓝藻的总生物量分布进行初筛、备选位点目标种群生物量细筛及细胞生理生态活性校正这三方面，层层递进地对湖泊底泥表层越冬蓝藻种源疏浚位点进行判定，具有较强的精确性和可操作性。本发明方法从不同角度对蓝藻种源量及活性进行分析，通过相关分析的相互验证(如蓝藻总生物量和特定种群生物量；光合作用和酯酶活性等等)，从而提高了判定的准确性。本发明方法可以对大型浅水湖泊底泥表层越冬蓝藻种源疏浚位点进行确定，为湖泊治理工程措施(如冬季疏浚)的可行性和针对性提供科学合理的依据，使有限的工程处理能力效果最大化，达到事半功倍的效果。下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。本发明的保护范围并不以具体实施方式
为限，而是由权利要求加以限定。


图I太湖湖区监测点位分布示意图。图2太湖底泥表面藻蓝素含量空间分布图。图3北太湖疏浚备选区域监测点位分布示意图。图4太湖底泥表面微囊藻区分的流式细胞图。图5疏浚备选区域铜绿微囊藻生物量比较。图6疏浚备选区域铜绿微囊藻酯酶活性比较。图7梅梁湾底泥表面越冬蓝藻种源疏浚位点示意图。
具体实施例方式根据本发明的大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法，应用于太湖种源疏浚工程中确定疏浚位点，在蓝藻越冬复苏期在设定的监测点对湖泊底泥表层取样；通过色素分析、镜鉴和流式细胞技术确定去除越冬蓝藻的目标种群(如铜绿微囊藻)数量；结合蓝藻的生理活性分析，确定太湖底泥表层越冬蓝藻种源疏浚位点。
所述的方法具体包括以下步骤
I.在蓝藻越冬复苏期，基于湖区水体面积和特征设定监测点，监测期内在各监测点底泥表层取样。基于太湖水体面积和特征设定14处监测点(如图I所示)，选择连续3天静风天气，对全湖底泥表层进行全水域采样。用内径为62mm的柱状采泥器采集底泥样品，切取最上层2cm左右厚度的表层底泥移至密封袋中，并即时用多功能水质仪(YSI6600-V2) (YellowSpring Instruments, USA)测定水质參数。在姆个采样点采集3份平行样品。2.利用色素分析构建疏浚前越冬蓝藻在太湖底泥表层的空间分布。采用分光光度法測定各监测点底泥样品中藻蓝素含量。称取一定量解冻后的底泥样品，于室内风干至恒重，并称取干重，计算含水率。称取5g左右研磨好的样品放入研钵中，加入0.05 M Tris缓冲液(pH 7. 0)，仔细研磨2_5min，于4°C黑暗条件下静置8_10h。然后以4000g的转速离心5min，上清液转移至IOmL容量瓶中，最后用90%丙酮定容至10mL，得到底泥样品提取液用于测定底泥中藻蓝素含量。
通过岛津荧光分光光度计RF- 5301测定藻蓝素含量(阎荣，2004)，激发光波长为620nm，发射光波长647nm，扫描速度60nm/min，以荧光强度对藻蓝素浓度作工作曲线。在与标准样品系列相同的条件下測定底泥样品提取液的荧光强度，从而在工作曲线上求得提取液中藻蓝素浓度，再根据底泥样品重量计算出藻蓝素含量。通过上述方法，可以获得在蓝藻越冬期(例如12月)的太湖底泥越冬蓝藻的空间分布格局见图2，由图2可知蓝藻越冬期内太湖北部底泥藻蓝素含量较高，特别是竺山湾、梅梁湾、贡湖湾这三个湾区，另外南太湖的小范围湖边带也略高，而中部湖区底泥表面的藻蓝素含量明显偏少(P〈0. 05)。因此，可以判断此时由于风场及湖流的影响，秋冬季下沉的蓝藻逐渐集中在太湖北部湖区的3个湖湾及南太湖的小范围区域，这四处区域可以作为备选区域为下一步的精确判断提供基础。3.在备选区域增设采样点，通过显微镜观测和流式细胞技术进行定性定量分析，将备选区域按目标种群的数量进行排序。在上述4个备选区域分别各取5个点(图3)进行进一歩定性定量分析。各监测点分别取10 g泥样，以10倍稀释法将泥样冲稀至10_2和10_3的PBS悬液(可以根据泥样性质适当调整)，经300目滤膜过滤后离心(2500 rpm, 7min)至可测浓度，反复三次制成细胞悬液。采用流式细胞技术辅以镜鉴对底泥表层蓝藻特定种群(如铜绿微囊藻)进行定量分析。流式细胞方法采用FACSVantage SE流式细胞仪(Becton Dickinson,USA),第一激光为Coherent水冷氩离子激光器(激发波长为488nm)，产生的荧光信号通过2个检测通道被收集(FLl 530/30nm, FDA 荧光；FL3 675/20nm,叶绿素 a 荧光);第二激光为 Coherent染料激光器(激发波长为600nm)，以Coherent水冷氩离子激光器泵发，检测通道波长为660/20nm (FL4，藻蓝素荧光)。非藻类颗粒或聚集细胞可以通过自发荧光(FL3/FL4)和形态结构(FSC/SSC)的差异去除。样品的分析流速为Iu L/s，单样耗时为20s。显微镜镜鉴进行辅助定性判定，细胞计数使用双组分绝对计数微球(Caltag Laboraties Inc, CA)。如图4所示，通过流式细胞技术的荧光分析(FL3或FL4)和形态结构分析(FSC或SSC)可以对底泥中铜绿微囊藻进行区分，并可通过双组分绝对计数微球(CaltagLaboraties Inc,CA)对悬液中细胞进行计数。如图5所示,根据对悬液中铜绿微囊藻细胞数的定量分析，可以判断此时越冬铜绿微囊藻在底泥表面的生物量排序依次为梅梁湾 > 贡湖湾 > 竺山湾 > 南太湖。其中以梅梁湾西岸的监测点数值为最高。4.通过藻细胞的光合作用活性和/或酯酶活性对备选区域的蓝藻细胞生理活性进行排序。对上述四个备选区域的每个采集样品分别测定藻细胞的光合作用能力和酯酶活性。藻类光合作用活性分析的具体操作如下取刚采回的泥样稀释过滤，适量装入測量杯，暗适应15min先打开测量光(ML)，待初始荧光稳定后得到Fo，打开饱和光强(ST)，得到样品的Fm和光系统II的最大光合效率，并测定快速光响应曲线。由于温度已降至4°，底泥蓝 藻的光合作用活性基本消失或极其微弱，因此数据未列出。酯酶活性检测方法分析藻细胞活性的具体方法如下取10 g泥样，以10倍稀释法将泥样冲稀至10_2和10_3的PBS悬液(可以根据泥样性质适当调整)，经300目滤膜过滤后离心(2500 rpm, 7min)至可测浓度,反复三次制成细胞悬液。取Iml藻液中加入适量突光染料(Fluorescence dieastrate),室温避光染色8min后,通过流式细胞仪FLl通道检测酶活的強度。如图6可知，竺山湾、贡湖湾、梅梁湾铜绿微囊藻的细胞活性差别不大，南太湖明显偏低(P〈0. 05)。加之南太湖沿岸分布的水草较多，对藻类的复苏和活性有一定抑制作用，因此可以从备选区域中去除南太湖。5.综合以上藻蓝素含量、目标种群生物量和蓝藻细胞生理活性的三方面结果，如果此时开展太湖底泥越冬蓝藻种源疏浚，可以优先选择梅梁湾进行密集采样，并结合湖泊底泥物理化学性质的差异及藻体的附着特性，确定该湖区底泥表面活性蓝藻种源的分布。可应用Arcgis软件通过空间网格划分和空间插值，并对疏浚区进行评估，从而获得越冬蓝藻种源疏浚位点。空间网格划分及插值根据水体面积大小设定空间网格数量，网格的布设采用地理信息系统(GIS)布设。针对梅梁湾这一水域采用200X200m的网格。采用Arcgis软件的反距离权重法进行空间插值和数据储存。底泥蓝藻疏浚区评估采用层次分析法和自然断裂法对目标种群生物量和细胞生理活性进行综合计算和评估，将同一类别的水域合并，按照综合评分值从高到低分为4个等级，并通过Arcgis软件作图，见图7。优选选择评分值较高的网格(图7中灰色较深)作为越冬蓝藻种源疏浚位点。如需进一歩提高疏浚位点的精确性，可以增加检测位点或者检测指标，采用同样的方法比较铜绿微囊藻生物量和活性状态，进而做出更科学的判断。从时间上来看，还可采取定期监测的方法，当底泥表面铜绿微囊藻生物量累积最高吋，即水体中藻类最大程度下沉至底泥表面时开展疏浚，这将进一步提高定向疏浚工程的针对性和科学性。另外，在适用性上，本专利除了可以指导底泥蓝藻种源疏浚，还可应用在ー些直接针对湖泊底泥表面越冬蓝藻的去除技术中，为其处理位置提供科学的參考，包括湖泊底质的物理改造方法，如改性黏土技术、水底耕耘改土技术， 水底铧耕改土技术等；硫酸铜、过氧化氢等药剂处理的化学方法；稻杆处理等生物方法。
权利要求
1.ー种大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法，其特征在于在蓝藻越冬复苏期，分布于湖区设定监测点对湖泊底泥表层取样分析；通过分析底泥表层中的色素含量表征越冬蓝藻种源的总生物量及其空间分布，根据色素含量初步筛选蓝藻种源的总生物量分布较高的区域为备选区域；在备选区域增设采样点，通过显微镜观测和流式细胞方法对底泥表层蓝藻种群进行定性定量分析，确定去除越冬蓝藻种源的目标种群和数量；利用细胞光合作用活性和/或酯酶活性表征底泥表层蓝藻细胞的生理活性；对备选区域根据目标种群数量进ー步进行筛选，辅以蓝藻细胞的生理活性进行校正，在备选区域中优先选取目标种群数量和生理活性较高的区域，进行密集采样分析，通过网格化和空间插值的方法，对疏浚区进行评估，确定大型浅水湖泊底泥表层越冬蓝藻种源疏浚位点。
2.根据权利要求I所述的大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤 1)在蓝藻越冬复苏期，基于湖区水体面积和特征，分布于湖区设定监测点，在各监测点对湖泊底泥表层取样； 2)采用色素分析測定底泥表层中的藻蓝素含量，表征底泥表层蓝藻种源的总生物量及其在湖区的空间分布，确定蓝藻种源的越冬区域，以藻蓝素含量较高的区域初步确定为疏浚的备选区域； 3)在备选区域增设采样点，通过流式细胞方法和显微镜观测，确定底泥表层中去除越冬蓝藻种源的目标种群和数量，并将备选区域按目标种群的数量进行排序； 4)測定底泥表层中藻细胞的光合作用活性和/或酯酶活性，利用细胞光合作用活性和/或酯酶活性表征蓝藻细胞的生理活性，并将备选区域按蓝藻细胞生理活性进行排序； 5)根据备选区域的目标种群数量和蓝藻细胞生理活性的排序，在备选区域中优先选取目标种群数量和生理活性较高的区域，进行密集采样分析，根据目标种群生物量和蓝藻细胞生理活性，通过空间网格划分和空间插值，对疏浚区域进行计算和评估，确定湖泊底泥表层越冬蓝藻种源疏浚位点。
3.根据权利要求2所述的大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法，其特征在于 步骤2)中，所述的藻蓝素含量采用分光光度法进行測定，激发光波长为620nm，发射光波长647nm。
4.根据权利要求2所述的大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法，其特征在于，步骤3)中，所述的流式细胞方法为采用流式细胞仪，激光波长分别为488nm和600nm，色素的自发荧光通过波长675/20nm和660/20nm的FL3、FL4两个检测通道收集；非藻类颗粒或聚集细胞通过自发荧光FL3/FL4和形态结构參数FSC/SSC的差异去除。
5.根据权利要求2所述的大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法，其特征在于，步骤4)中，所述的藻细胞的光合作用活性的測定方法为，取底泥表层泥样稀释过滤，适量装入測量杯，暗适应15min先打开测量光ML，待初始荧光稳定后得到Fo，打开饱和光强ST，得到样品的Fm和光系统II的最大光合效率，并测定快速光响应曲线。
6.根据权利要求2所述的大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法，其特征在于，步骤4)中，所述的酯酶活性的检测方法为，取底泥表层泥样稀释过滤，向藻液中加入适量荧光染料，室温避光染色，通过染色后流式细胞仪FLl通道荧光强弱检测酯酶活性。
全文摘要
一种大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法，在越冬复苏期，对湖泊底泥表层取样，分析底泥表层的色素含量表征蓝藻总生物量及其分布，根据色素含量初步筛选蓝藻种源的总生物量较高的区域为备选区域；在备选区域增设采样点，采用镜鉴及流式细胞方法确定目标种群和数量；利用细胞光合作用活性和/或酯酶活性表征蓝藻细胞的生理活性；对备选区域根据目标种群数量进行细筛，辅以蓝藻的生理活性进行校正，在备选区域中优先选取目标种群数量和生理活性较高的区域，通过网格化和空间插值的方法，确定底泥表层越冬蓝藻种源的疏浚位点。本发明方法通过越冬蓝藻种源分布特征确定疏浚位点，为定向开展越冬蓝藻种源疏浚工程提供科学合理的依据。
文档编号G01N21/64GK102735671SQ20121022809
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月2日 优先权日2012年7月2日
发明者于洋, 孔繁翔, 季健, 张民, 阳振, 马荣华 申请人:中国科学院南京地理与湖泊研究所