专利名称：一种海水鲆鲽鱼类受精卵的组织切片方法
技术领域：
本发明涉及显微组织切片技术，具体的说是一种适用于海水鲆鲽鱼类受精卵的一套胚胎定位包埋连续切片方法。
背景技术：
在已有的针对鱼卵的切片报道中，所用材料均为淡水鱼卵，例如草鱼和鲫鱼，而海水鱼类鱼卵的组织切片尚未见到报道。对淡水鱼卵是将其用Bouin’s固定液或者Smith固定液固定后去膜，按普通生物组织切片方法进行乙醇梯度脱水，经二甲苯透明处理后，做石蜡包埋切片。
但是利用这种方法进行海水鲆鲽类鱼卵的组织切片却很容易切碎，不能得到完整切片。其主要的原因在于鲆鲽类鱼卵与其他大多数淡水鱼卵有所不同，它们与大多数海水鱼卵一样为透明的浮性卵，卵黄十分丰富，外周有韧性较强的卵膜，经过固定处理后的卵与大多数淡水鱼卵相比其卵周隙狭小几乎不可见，很难完整去膜，所以应用去膜再处理的方法在海水鲆鲽类鱼卵切片实验中不具有可行性。

发明内容
针对普通生物和淡水鱼类受精卵组织切片方法不能应用于海水鲆鲽鱼类卵切片的不足之处，本发明经过一系列的实验包括方法的筛选和条件的优化以及重复实验，建立了一整套的适用于海水鲆鲽鱼类卵切片的材料固定、处理和组织切片方法。
本发明的技术方案是1)材料固定鱼卵放入50～100倍体积Bouin’s固定液固定，鱼卵经Bouin’s固定液固定6～12小时后，用70％乙醇反复冲洗，并更换数次，以洗去固定液，在70％乙醇中保存、备用。
2)材料预处理用70％乙醇反复冲洗卵球更换数次后，用解剖针在鱼卵的植物极附近戳破卵膜，注意不能损伤动物极。
3)琼脂定位包埋将卵置于载玻片上，滴上温热琼脂胶，自然冷却成琼脂块，在解剖镜下用解剖针调整好卵的位置，琼脂浓度1～2％。
4)脱水处理经70％、80％、90％、95％、100％梯度酒精脱水处理，每步处理30～60min，95％乙醇中加入伊红将卵球染成红色，以方便后期切片时观察其位置。
5)透明处理用松油醇对琼脂块进行透明处理，将琼脂块浸没于松油醇中，处理时间根据琼脂块的大小和透明情况判断，需要4小时以上，一般在4～12小时，延长时间无不良影响。
6)透蜡处理经松油醇与石蜡等体积混液处理4小时以上，一般在4～12小时，方可放入石蜡中，石蜡渗透共四次，每次处理1小时以上，一般在1～4小时。
7)石蜡包埋透蜡完成后即可进行包埋，作成石蜡块。
8)进行组织切片，将获得的切片经贴片、烤片处理后进行苏木精伊红(HE)染色，染色后显微摄影观察并拍照。
本发明的优点和积极效果在于1.本发明建立了适宜海水鱼类浮性卵固定的方法和条件，针对海水鲆鲽鱼类受精卵为多卵黄浮性卵、含有油球、卵膜韧性强以及卵周隙狭小的特点，探索建立了一套适用于海水鲆鲽鱼类受精卵的有效的组织切片方法。有报道认为用Bouin’s固定液固定多卵黄鱼卵容易造成卵黄的脆硬而导致切片失败，而应该用Smith固定液固定。但我们的固定处理时间梯度实验证明，鱼卵经Bouin’s固定液固定6～12小时，卵黄不会发生脆硬现象，切片正常，可以避免使用Smith固定液带来的繁杂的操作步骤。
2.本发明解决了卵子不能完全脱水的问题。由于卵膜坚韧而致密，使卵子脱水时因渗透压的作用卵膜发生严重皱缩，导致切片失败，一般采用剥除卵膜的方法来解决，但鲆鲽类的卵经Bouin’s固定液固定后卵周隙狭小无法用解剖针除去卵膜，本发明则通过用解剖针在卵膜上打孔解决这个难点。
3.本发明解决了卵的定位问题。用琼脂对卵进行预先包埋定位已有先例，方法是将凝固的琼脂烫出小洞放入卵后再用热琼脂包埋，本发明对此加以改进，将卵直接琼脂包埋，避免了琼脂分层导致切片失败。
4.本发明应用于牙鲆及大菱鲆受精卵的组织切片实验中，都获得了完整的组织切片，效果良好重复性高(见附图1-3)。因此本发明适用于鲆鲽类鱼卵的组织切片。
5、本发明方法简单有效，容易掌握，不但适用于海水鲆鲽鱼类受精卵组织切片，也适用于同属浮性卵、多卵黄的其它海水鱼类的卵组织切片中，其适用范围广泛。


图1本发明用于牙鲆受精卵切片实验中获得的完整切片。
图2应用本发明获得的牙鲆受精卵胚盘部分的切片。
图3应用本发明获得的牙鲆受精卵将要进行第一次分裂的切片。
具体实施例方式
下面结合实例详述本发明。
本发明乙醇浓度均为体积百分比浓度，琼脂浓度1～2％为重量体积比浓度，即每100ml琼脂水溶液中含1～2克琼脂。
实施例1牙鲆受精卵组织切片步骤一将不同发育时期的牙鲆受精卵放入50倍体积的Bouin’s固定液中固定10小时，用70％乙醇洗涤数次后(洗去固定液)保存。
步骤二将保存的卵用70％乙醇冲洗后，用解剖针在植物极方向戳破卵膜。
步骤三将其置于载玻片上，滴上热熔琼脂后在解剖镜下调整好卵的位置和方向。
步骤四包埋好的琼脂块作为一个组织块经70％、80％、90％、95％、100％乙醇脱水，每组处理时间为30min。95％乙醇中加入少量伊红至将卵球染成红色。
步骤五放入松油醇中进行透明处理，处理时间4小时。
步骤六放入松油醇和热熔石蜡等混液中处理，处理时间4小时。
步骤七再将组织块依次放入杯号为I、II、III、IV的热熔石蜡中进行透蜡处理，每次处理时间1小时。
步骤八进行石蜡包埋，做成石蜡块。
步骤九进行组织切片，将获得的切片经贴片、烤片处理后进行苏木精伊红染色，染色后显微摄影观察并拍照。
实施例2大菱鲆受精卵组织切片步骤一将不同发育时期的大菱鲆受精卵放于50倍体积的Bouin’s固定液中固定12小时，用70％乙醇洗涤数次后(洗去固定液)保存。
步骤二将保存的卵用70％乙醇冲洗后，用解剖针在植物极方向上戳破卵膜。
步骤三置于载玻片上，滴上热熔琼脂后在解剖镜下调整好卵的位置和方向。
步骤四包埋好的琼脂块作为一个组织块经70％、80％、90％、95％、100％乙醇脱水，每组处理时间为1小时。95％乙醇中加入少量伊红至将卵球染成红色。
步骤五脱水后的琼脂块放入松油醇中进行透明处理，处理时间6小时。
步骤六放入松油醇和热熔石蜡等混液中处理，处理时间6小时。
步骤七再将组织块依次放入杯号为I、II、III、IV的热熔石蜡中进行透蜡处理，每次处理时间2小时。
步骤八将处理好的组织块进行石蜡包埋，作成石蜡块。
步骤九进行组织切片，将获得的切片经贴片、烤片处理后进行苏木精伊红染色，染色后显微摄影观察并拍照。
实施例3牙鲆受精卵组织切片步骤一将不同发育时期的牙鲆受精卵放于100倍体积的Bouin’s固定液中固定6小时，用70％乙醇洗涤数次后(洗去固定液)保存。
步骤二将保存的卵用70％乙醇冲洗后，用解剖针在植物极方向上戳破卵膜。
步骤三置于载玻片上，滴上热熔琼脂后在解剖镜下调整好卵的位置和方向。
步骤四包埋好的琼脂块作为一个组织块经70％、80％、90％、95％、100％乙醇脱水，每组处理时间为45min。95％乙醇中加入少量伊红至将卵球染成红色。
步骤五脱水后的琼脂块放入松油醇中进行透明处理，处理时间12小时。
步骤六放入松油醇和热熔石蜡等混液中处理，处理时间12小时。
步骤七再将组织块依次放入杯号为I、II、III、IV的热熔石蜡中进行透蜡处理，每次处理时间4小时。
步骤八将处理好的组织块进行石蜡包埋，做成石蜡块。
步骤九进行组织切片，将获得的切片经贴片、烤片处理后进行苏木精伊红染色，染色后显微摄影观察并拍照。
权利要求
1.一种海水鲆鲽鱼类受精卵的组织切片方法，其步骤如下1)材料固定鱼卵经Bouin’s固定液固定6～12小时后，用70％乙醇反复冲洗，并更换数次，以洗去固定液，在70％乙醇中保存、备用；2)材料预处理用70％乙醇冲洗卵球后，用解剖针在鱼卵的植物极附近戳破卵膜；3)琼脂定位包埋将卵置于载玻片上，滴上温热琼脂胶，自然冷却成琼脂块，在解剖镜下用解剖针调整好卵的位置，琼脂浓度1～2％；4)脱水处理经70％、80％、90％、95％、100％梯度酒精脱水处理，每步处理30～60min，95％乙醇中加入伊红将卵球染成红色，以方便后期切片时观察其位置；5)透明处理用松油醇对琼脂块进行透明处理，将琼脂块浸没于松油醇中，处理时间4小时以上；6)透蜡处理经松油醇与石蜡等体积混液处理4小时以上，然后放入石蜡中进行渗透；7)石蜡包埋透蜡完成后即可进行包埋，做成石蜡块；8)进行组织切片。
2.按照权利要求1所述海水鲆鲽鱼类受精卵的组织切片方法，其特征在于所述步骤1)中，鱼卵放入50～100倍体积Bouin’s固定液固定。
3.按照权利要求1所述海水鲆鲽鱼类受精卵的组织切片方法，其特征在于所述步骤5)中，琼脂块浸没于松油醇中，处理时间4～12小时。
4.按照权利要求1所述海水鲆鲽鱼类受精卵的组织切片方法，其特征在于所述步骤6)中，松油醇与石蜡等体积混液处理4～12小时。
5.按照权利要求1所述海水鲆鲽鱼类受精卵的组织切片方法，其特征在于所述步骤6)中，石蜡渗透共四次，每次处理1～4小时。
全文摘要
本发明是一种适用于海水鲆鲽鱼类受精卵的一套胚胎定位包埋连续切片方法，涉及显微组织切片技术。本发明针对海水鲆鲽鱼类受精卵为多卵黄浮性卵、卵膜韧性强以及卵周隙狭小的特点，探索建立了一套针对海水鲆鲽鱼类受精卵的有效的组织切片方法。(1)Bouin’s固定液固定多卵黄浮性卵及处理时间的优化。(2)用解剖针在植物极方向戳破卵膜解决因卵周隙狭小不能剥离卵膜的难点。(3)采用热琼脂直接包埋法定位胚胎。本发明方法简单有效，容易掌握，不但适用于海水鲆鲽鱼类受精卵组织切片，也适用于同属浮性卵、多卵黄的其它海水鱼类卵的组织切片。
文档编号G01N1/06GK1749730SQ20041005043
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月17日 优先权日2004年9月17日
发明者孙威, 尤锋, 张培军, 徐永立 申请人:中国科学院海洋研究所