专利名称：细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置及其制造方法和应用方法
技术领域：
本发明涉及细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置及其制造方法和应用方法，特别适用于细胞电阻抗测量、细胞迁移、癌症检测、药物筛选、微流控及纳米技术应用，属于生物检测技术领域。
背景技术：
细胞电阻抗传感技术是一种测量由于细胞形态变化、细胞移动或者细胞间相互接触而引起检测系统电阻抗变化的技术。该技术具有对体外培养细胞进行长时程、实时、快速、无损、简便分析等优点，已被广泛地应用于细胞形态变化跟踪、药物筛选、生化检测及疾病诊断等领域，成为生物传感器研究的一个重要内容。
细胞的生长、增殖和迁移等过程在生物体胚胎发育、伤口愈合、免疫应答等众多生物过程中起着非常关键的作用。特别是被广为关注的细胞迁移过程在肿瘤转移和炎症反应等多种疾病中都扮演着重要的角色。对于肿瘤细胞而言，其迁移特性已经成为评价抗肿瘤药物的重要指标，能够减缓肿瘤细胞迁移的药物有可能对遏制肿瘤转移起到重要作用。对细胞活性状态变化进行检测便可实现快速、高通量的药物筛选。基于细胞阻抗传感器的药效测试，不仅可以通过细胞的响应来确定药物对细胞的效用，而且还可以确定对药物响应的细胞特异性，能在药物筛选和疾病诊断方面发挥巨大的作用。
目前，用于细胞迁移分析的电阻抗传感技术可分为表面和跨膜迁移两大类。用于细胞跨膜迁移分析的电阻抗测量为博伊登室法，细胞在药物作用下进行跨膜运动，因而引起基底细胞数的变化而改变系统的电阻抗。虽然这种方法也可对细胞跨膜迁移进行实时的监察，但其分辨率是十分有限的，而且药物的导入及药物诱导的时间响应都不是优化的。

发明内容
本发明所提供的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置及其制造方法和应用方法， 其目的是1、实时检测细胞通过集成电阻抗传感技术和微流芯片技术来实现对体外培养细胞跨膜迁移过程进行高分辨、实时和无损伤、可靠跟踪测控、分析；2、提高检测灵敏度实现对单细胞的跨膜迁移追踪；3、通过微流管道精确的确定药物对细胞的效用；4、实时、定量和减小人为误差；5、操作简便、精确度高；6装置制造简单，造价低廉；7、特别用于快速、 高通量的药物筛选和疾病诊断。
本发明的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置技术方案是它包括腔体，该腔体中部有能容纳液体的腔室，该腔室其中部由一个微孔薄膜将腔室隔成上腔室和下腔室，微孔薄膜上部为上腔体，下部为下腔体；上腔体的下部和下腔体的上部靠近微孔薄膜处分别有从外部向内部空腔连通的电极孔；上腔体的电极孔插入的是上腔室电极，下腔体的电极孔插入的是下腔室电极，两电极分别与分析装置联接；下腔体的下部有与外部联通的液体进出通道。
进一步的技术方案是所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，腔体为组合结构，即上腔体与下腔CN 102539485 A体及封闭下腔体底部的底座为三个独立的构件；上腔室和下腔室一次或分别加工而成；微孔薄膜夹在上腔体的下端面与下腔体的上端面之间；上腔体与下腔体结合部密封连接；下腔体的下端面与独立的底座密封连接。
所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，所述的上腔体和下腔体材料为用于微流控领域用的聚合物材料；底座材料选自于玻片，或用于微流控领域的聚合物材料； 上腔体与下腔体结合部密封连接，以及下腔体下端面与独立的底座密封连接均是用高真空氧等离子体法键合。
所述的所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，腔体为整体结构，即上腔体与下腔体及封闭下腔体下端的底座为一个整体构件；下腔室孔径小于上腔室孔径，微孔薄膜套装在微孔薄膜环上嵌入上腔室中。
所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，其整体结构的腔体的上腔体和下腔体及底座为一整体材料加工而成，材料为微流控领域用的聚合物材料。
所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，其上腔室和下腔室的直径小于等于8毫米。
所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，其上腔室为细胞培养基室，上腔室电极为工作电极；下腔室为诱导剂室，下腔室电极为参比电极；所述分析装置为阻抗分析仪，或多用电表，或电化学工作站。
所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，其微孔薄膜的厚度小于等于 200微米，面积小于等于5平方厘米，微孔薄膜上的微孔孔径小于等于8微米；微孔薄膜的材料为微流控领域用的聚合物材料或光胶SU8。
本发明腔体为组合结构的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置的制造方法技术方案是其细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置包括一个组合结构的腔体，即上腔体与下腔体及封闭下腔体底部的底座为三个独立的构件；制造方法包括下述步骤第一步、配制腔体原料将腔体原料配制成液态；第二步、原料固化将液态的腔体原料倒在硅片或玻片上，在烘箱中烘若干时间，使腔体原料固化成腔体坯料；第三步、制作腔体将腔体坯料切割成上腔体和下腔体的形状；然后加工上腔室和下腔室及电极孔和液体进出通道；电极孔一个靠近上腔体的下端面，另一个靠近下腔体的上端面；第四步、组装将微孔薄膜平铺在下腔体的上端面上，然后将上腔体安放在下腔体上端面上的微孔薄膜上，再将下腔体的下端面安放在底座上，最后用高真空氧等离子体法将下腔体的上端面和上腔体的下端面及微孔薄膜键合在一起；再以同样方法将下腔体的下端面与底座键合在一起；第五步、将上腔室电极和下腔室电极分别插入上腔电极孔和下腔电极孔中。
本发明的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置在细胞生物学研究、药物筛选和疾病诊断领域的应用。
本发明的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置应用于细胞跨膜迁移的实时测控方法技术方案是其细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置包括腔体，该腔体中部有能容纳液体的腔室，该腔室其中部由一个微孔薄膜将腔室隔成上腔室和下腔室；实时测控的方法包括下述步骤A、将腔体进行消毒灭菌；B、从上腔室入口处向上腔室足量灌注含有细胞的培养液，其细胞含量为每毫升含有细胞的培养液中具有IO5 IO7个细胞。
C、从下腔室的液体进出通道足量灌注不含细胞的培养液，和/或用于实验的药液；D、待细胞培养一定时间后，注入含适量浓度血小板源生长因子的培养液代替下腔室内的原不含细胞的培养液作为细胞迁移的诱导剂；细胞在诱导剂的作用下，通过微孔薄膜陆续从上腔室迁移到下腔室；E、上腔室电极为工作电极，下腔室为参比电极，分别紧密分布在微孔薄膜的上下两侧， 该两电极与分析装置连接，用于对细胞的迁移过程进行实时测控，包括对单细胞的迁移引起的阻抗变化进行检测。
本发明的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置应用于细胞跨膜迁移的实时测控方法，上述方法的B步骤中，向上腔室足量注入的含有细胞的培养液是每毫升含有 IO5 IO7个癌细胞U-87的含有细胞的培养液。
本发明的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置应用于细胞跨膜迁移的实时测控方法，上述B步骤中，向上腔室足量注入的含有细胞的培养液是每毫升含有IO5 IO7 个癌细胞HCT-116的含有细胞的培养液；还有F、在选定的时间，将迁移到下腔室的细胞用钙黄绿素-AM原液孵育后用倒置光学显微镜进行荧光成像；G、为用于比较，在不同时间，将迁移到下腔室的细胞用光学显微镜观察并计数，并在不同浓度化学诱导剂作用下采集数据，与阻抗测量得到的结果进行比较。
本发明的技术效果显著1、使细胞在贴壁、增殖、迁移的过程所引起系统阻抗的变化能通过分布在薄膜的两侧的电极实时检测；2、提高检测灵敏度实现对单细胞的跨膜迁移追踪；3、通过微流管道精确的定时、定量的导入药物并根据细胞的响应来确定药物对细胞的效用；4、实时、定量和减小人为误差；5、操作简便、精确性高，并且装置制造简单，造价低廉；6、用于快速、高通量的药物筛选和疾病诊断。是方法实现了通过集成电阻抗传感技术和微流芯片技术来对体外培养细胞跨膜迁移过程进行高分辨、实时和无损伤、可靠跟踪测控、 分析。


图1是本发明细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置一个实施例俯视图的A-A 剖视图；本实施例腔体为组合结构；图2是图1的俯视图；图3是本发明细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置另一个实施例俯视图的B-B剖视图；本实施例腔体为整体结构； 图4是图3的俯视图； 图5是微孔薄膜扫描电镜图； 图6是U-87细胞附着在微孔薄膜上的扫描电镜图；图7是U-87细胞迁移通过8微米直径孔所对应的电阻抗变化谱图；该图在化学诱导剂注射后测量，测量频率为80千赫。大图为60分钟内的记录，插图为接下来的120分钟的电阻抗变化；图8是HCT-116细胞跨膜迁移通过8微米直径孔所对应的电阻抗变化谱图。该图在化学诱导剂注射后测量，测量频率为80千赫；大图为60分钟内的记录，插图为接下来的120 分钟的电阻抗变化图；图9是跨膜迁移3小时后下腔室基底上HCT-116细胞的荧光图； 图10是在不同浓度化学诱导剂作用下，下腔室基底上HCT-116细胞密度随时间的变化图。
图中各附图标记的名称为该腔体-1 ；上腔体-1.1;下腔体-1.2 ；底座-1.3 ； 腔室-2;上腔室-2.1;下腔室-2. 2;微孔薄膜-3 ；微孔-3. 1 ；微孔薄膜环-4 ；液体进出通道-5;电极孔-6;上腔室电极-6.1;下腔室电极-6. 2;分析装置-7。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 是本发明的腔体1为组合结构的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置的一个基本实施例，附图1是其中的一个例子。它包括腔体1，该腔体1中部有能容纳液体的腔室2，该腔室2其中部由一个微孔薄膜3将腔室2隔成上腔室2. 1和下腔室2. 2， 微孔薄膜3上部为上腔体1. 1，下部为下腔体1. 2 ；上腔体1. 1的下部和下腔体1. 2的上部靠近微孔薄膜3处分别有从外部向内部空腔连通的电极孔6 ；上腔体1. 1的电极孔6插入的是上腔室电极6. 1，下腔体1.2的电极孔6插入的是下腔室电极6. 2，两电极分别与分析装置7联接；下腔体1. 2的下部有与外部联通的液体进出通道5。
实施例2 如图1、2所示，是本发明的腔体1为组合结构的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置的实施例。所述的腔体1为组合结构，即上腔体1. 1与下腔体1. 2及封闭下腔体1. 2底部的底座1. 3为三个独立的构件；上腔室2. 1和下腔室2. 2 一次或分别加工而成；微孔薄膜3夹在上腔体1. 1的下端面与下腔体1. 2的上端面之间；上腔体1. 1与下腔体1. 2结合部密封连接；下腔体1. 2的下端面与独立的底座1. 3密封连接。所述的上腔体1. 1和下腔体1. 2材料为用于微流控领域用的聚合物材料，选自于PDMS，即聚二甲基硅氧烷，或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，或聚碳酸酯PC，或聚苯乙烯PS，本实施例选为 PDMS，即聚二甲基硅氧烷；底座1. 3材料选自于玻片，或用于微流控领域的聚合物材料，或聚二甲基硅氧烷PDMS，或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，或聚碳酸酯PC，或聚苯乙烯 PS，本实施例选为玻片；上腔体1. 1与下腔体1. 2结合部密封连接，以及下腔体1. 2下端面与独立的底座1. 3密封连接均是用高真空氧等离子体法键合。所述的上腔室2. 1和下腔室 2. 2的直径小于等于8毫米，本实施例选为5毫米。所述的上腔室2. 1为细胞培养基室，上腔室电极6. 1为工作电极，材料选的钼，金，钛，铜，铁金属或合金，或碳纤维，或石墨类碳材料，或相应的化学修饰电极，本实施例选为钼；下腔室2. 2为诱导剂室，下腔室电极6. 2为参比电极，材料选自于银/氯化银，或汞/氧化汞，或汞/硫酸亚汞，或甘汞，或钼，或金，或碳纤维本实施例选为银/氯化银；所述分析装置7为阻抗分析仪，或多用电表，或电化学工作站，本实施例选为阻抗分析仪。所述的微孔薄膜3的厚度小于等于200微米，面积小于等于5平方厘米，微孔薄膜3上的微孔孔径小于等8微米；微孔薄膜3的材料为微流控领域用的聚合物材料，选自于聚碳酸酯膜，或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，或聚苯乙烯PS，或聚合物聚二甲基硅氧烷，或光胶SU8。本实施例选为微孔薄膜3的厚度等于100微米，面积等于1平方厘米，微孔薄膜3上的微孔孔径于等于5微米；微孔薄膜3的材料选自于聚碳酸酯膜，或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，或聚苯乙烯PS，或聚合物聚二甲基硅氧烷， 或光胶SU8，本实施例选为热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA。
实施例3 与上述实施例2不同的是，如图3、4所示，是本发明的腔体1为整体结构的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置的实施例。所述的腔体1为整体结构，即上腔体1. 1与下腔体1. 2及封闭下腔体1. 2下端的底座1. 3为一个整体构件；下腔室2. 2孔径小于上腔室2. 1孔径，微孔薄膜3套装在微孔薄膜环4上嵌入上腔室2. 1中。所述的整体结构的腔体1的上腔体1. 1和下腔体1. 2及底座1. 3为一整体材料加工而成，材料为微流控领域用的聚合物材料，选自于PDMS，即聚二甲基硅氧烷，或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，或聚碳酸酯PC，或聚苯乙烯PS，本实施例选为聚碳酸酯PC。
实施例4 本发明腔体为组合结构的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置的制造方法实施例细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置包括一个组合结构的腔体1， 即上腔体1. 1与下腔体1. 2及封闭下腔体1. 2底部的底座1. 3为三个独立的构件；制造方法包括下述步骤第一步、配制腔体原料将腔体原料PDMS单体/固化剂按10:1的比例混合配制成液态的 PDMS ；第二步、原料固化将液态的腔体原料PDMS倒在硅片或玻片上，在65 90度烘箱中烘若干25 40分钟使腔体原料PDMS固化成腔体坯料；第三步、制作腔体将腔体坯料切割成上腔体1. 1和下腔体1. 2的形状；然后加工上腔室2. 1和下腔室2. 2及电极孔6和液体进出通道5 ；电极孔6 —个靠近上腔体1. 1的下端面，另一个靠近下腔体1. 2的上端面；第四步、组装将微孔薄膜3平铺在下腔体1. 2的上端面上，然后将上腔体1. 1安放在下腔体1. 2上端面上的微孔薄膜3上，再将下腔体1. 2的下端面安放在底座1. 3上，最后用高真空氧等离子体法将下腔体1. 2的上端面和上腔体1. 1的下端面及微孔薄膜3键合在一起；再以同样方法将下腔体1. 2的下端面与底座1. 3键合在一起；第五步、将上腔室电极6. 1和下腔室电极6. 2分别插入上腔电极孔和下腔电极孔中，在使用时两电极分别与分析装置7联接。
实施例5 是本发明本发明的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置在细胞生物学研究、药物筛选和疾病诊断领域的应用。
实施例6 是本发明的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置应用于细胞跨膜迁移的实时测控方法的基本实施例细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置包括腔体 1，该腔体1中部有能容纳液体的腔室2，该腔室2其中部由一个微孔薄膜3将腔室2隔成上腔室2. 1和下腔室2. 2 ；实时测控的方法包括下述步骤A、将腔体1进行消毒灭菌；B、从上腔室2.1入口处向上腔室2. 1足量灌注含有细胞的培养液，其细胞含量为每毫升含有细胞的培养液中具有IO5 IO7个细胞。
C、从下腔室2. 2的液体进出通道5足量灌注不含细胞的培养液，和/或用于实验的药液；D、待细胞培养一定时间后，注入含适量浓度血小板源生长因子的培养液代替下腔室 2.2内的原不含细胞的培养液作为细胞迁移的诱导剂；细胞在诱导剂的作用下，通过微孔薄膜3陆续从上腔室2. 1迁移到下腔室2. 2 ；E、上腔室电极6.1为工作电极，下腔室2. 2为参比电极，分别紧密分布在微孔薄膜3的上下两侧，该两电极与分析装置7连接，用于对细胞的迁移过程进行实时测控，包括对单细胞的迁移引起的阻抗变化进行检测。
实施例7 与上述实施例6不同的是本实施例是本发明的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置应用于细胞跨膜迁移的实时测控方法的一个较优的具体实施例，在实施例6基础上，其中C、从下腔室2.2的液体进出通道5足量灌注不含细胞的培养液；D、待细胞培养12 18个小时后，注入含适量浓度血小板源生长因子的培养液代替下腔室2.2内的原不含细胞的培养液作为细胞迁移的诱导剂；细胞在诱导剂的作用下，通过微孔薄膜3陆续从上腔室2. 1迁移到下腔室2. 2 ；E、上腔室电极6.1为钼工作电极，下腔室2. 2为银/氯化银参比电极，分别紧密分布在微孔薄膜3的上下两侧，该两电极与分析装置7连接，用于对细胞的迁移过程进行实时测控，包括对单细胞的迁移引起的阻抗变化进行检测。
实施例8 与上述实施例6不同的是本实施例是本发明的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置应用于细胞跨膜迁移的实时测控方法的又一个实施例。在上述实施例6 的B步骤中，向上腔室2. 1足量注入的含有细胞的培养液是每毫升含有IO5 IO7个癌细胞 U-87的含有细胞的培养液。
实施例9 与上述实施例6不同的是本实施例是本发明的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置应用于细胞跨膜迁移的实时测控方法的又一个实施例，在上述实施例6 的所述B步骤中，向上腔室2. 1足量注入的含有细胞的培养液是每毫升含有IO5 IO7个癌细胞HCT-116的含有细胞的培养液；还有F、在选定的时间，将迁移到下腔室2. 2的细胞用钙黄绿素-AM原液孵育后用倒置光学显微镜进行荧光成像；G、为用于比较，在不同时间，将迁移到下腔室2. 2的细胞用光学显微镜观察并计数，并在不同浓度化学诱导剂作用下采集数据，与阻抗测量得到的结果进行比较。
结合附图5-10进一步对本发明的技术方案、原理及显著效果说明如下图5是微孔薄膜扫描电镜图，薄膜表面是平整的，有不规则的孔分布其中，其直径大约为8微米；图6是U-87细胞附着在上述微孔薄膜上的扫描电镜图，表明细胞比薄膜上的孔略大，且能粘附铺展在该薄膜上；图7是U-87细胞迁移通过8微米直径孔所对应的电阻抗变化谱图，表明细胞迁移时能引起薄膜两端电阻抗的变化，阻抗减小表明有细胞穿过薄膜微孔，阻抗增加表明有新的细胞迁移到微孔处，可用于实时检测细胞的迁移行为，并计算在特定时间内穿过薄膜微孔的细胞数目。该图在化学诱导剂注射后测量，测量频率为80千赫。大图为60分钟内的记录，插图为接下来的120分钟的电阻抗变化，其中最小的降低约为3欧姆并对应一个细胞穿过薄膜微孔，通过对该阻抗变化的在此时间内的积分可以计算在此时间内的穿过薄膜微孔的细胞总数目；图8是HCT-116细胞跨膜迁移通过8微米直径孔所对应的电阻抗变化谱图，表明细胞迁移时能引起薄膜两端电阻抗的变化，阻抗减小表明有细胞穿过薄膜微孔，阻抗增加表明有新的细胞迁移到微孔处，可用于实时检测细胞的迁移行为，并计算在特定时间内穿过薄膜微孔的细胞数目。该图在化学诱导剂注射后测量， 测量频率为80千赫；大图为60分钟内的记录，插图为接下来的120分钟的电阻抗变化图， 其中最小的降低约为3欧姆并对应一个细胞穿过薄膜微孔，通过对该阻抗变化的在此时间内的积分可以计算在此时间内的穿过薄膜微孔的细胞总数目；图9是跨膜迁移3小时后下腔室基底上HCT-116细胞的荧光图，通过计算细胞数目可以确定在3小时后细胞迁移穿过薄膜的细胞的总数目，该数目与用本专利中描述的检测方法计算出的细胞在3小时中的迁移穿过薄膜的总数目是一致的；图10是在不同浓度化学诱导剂作用下，下腔室基底上 HCT-116细胞密度随时间的变化图，表明在化学诱导剂的浓度大于等于10纳克/毫升时，细胞迁移穿过薄膜微孔的速度不会依赖其浓度而变化，即本发明可以用于监测不同化学诱导剂对细胞迁移行为的定量化研究。
本发明权利要求保护范围不限于上述实施例。
权利要求
1.一种细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，其特征在于，它包括腔体(1)，该腔体(1)中部有能容纳液体的腔室(2)，该腔室(2)其中部由一个微孔薄膜(3)将腔室(2)隔成上腔室(2. 1)和下腔室(2. 2)，微孔薄膜(3)上部为上腔体(1. 1)，下部为下腔体(1.2);上腔体(1. 1)的下部和下腔体(1. 2)的上部靠近微孔薄膜(3)处分别有从外部向内部空腔连通的电极孔(6);上腔体(1. 1)的电极孔(6)插入的是上腔室电极(6. 1)，下腔体(1.2)的电极孔(6)插入的是下腔室电极(6. 2)，两电极分别与分析装置(7)联接；下腔体(1. 2)的下部有与外部联通的液体进出通道(5)。
2.如权利要求1所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，其特征在于，腔体 (1)为组合结构，即上腔体(1. 1)与下腔体(1. 2)及封闭下腔体(1. 2)底部的底座(1. 3)为三个独立的构件；上腔室(2. 1)和下腔室(2. 2)—次或分别加工而成；微孔薄膜(3)夹在上腔体(1.1)的下端面与下腔体(1.2)的上端面之间；上腔体(1.1)与下腔体(1. 2)结合部密封连接；下腔体(1. 2)的下端面与独立的底座(1. 3)密封连接。
3.如权利要求2所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，其特征在于，所述的上腔体(1. 1)和下腔体(1. 2)材料为用于微流控领域用的聚合物材料；底座(1. 3)材料选自于玻片，或用于微流控领域的聚合物材料；上腔体(1.1)与下腔体(1.2)结合部密封连接，以及下腔体(1. 2)下端面与独立的底座(1. 3)密封连接均是用高真空氧等离子体法键I=I O
4.如权利要求1所述的所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，其特征在于，腔体(1)为整体结构，即上腔体(1. 1)与下腔体(1.2)及封闭下腔体(1.2)下端的底座 (1. 3)为一个整体构件；下腔室(2. 2)孔径小于上腔室(2. 1)孔径，微孔薄膜(3)套装在微孔薄膜环(4)上嵌入上腔室(2. 1)中。
5.如权利要求4所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，其特征在于，整体结构的腔体(1)的上腔体(1. 1)和下腔体(1.2)及底座(1.3)为一整体材料加工而成，材料为微流控领域用的聚合物材料。
6.如权利要求1所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，其特征在于，上腔室(2. 1)和下腔室(2. 2)的直径小于等于8毫米。
7.如权利要求1所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，其特征在于，上腔室(2. 1)为细胞培养基室，上腔室电极(6. 1)为工作电极；下腔室(2. 2)为诱导剂室，下腔室电极(6. 2)为参比电极；所述分析装置(7)为阻抗分析仪，或多用电表，或电化学工作站。
8.如权利要求1所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置，其特征在于，微孔薄膜(3)的厚度小于等于200微米，面积小于等于5平方厘米，微孔薄膜(3)上的微孔孔径小于等于8微米；微孔薄膜(3)的材料为微流控领域用的聚合物材料，或光胶SU8。
9.一种权利要求2或3所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置的制造方法， 其特征在于，细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置包括一个组合结构的腔体(1)，即上腔体(1. 1)与下腔体(1.2)及封闭下腔体(1.2)底部的底座(1.3)为三个独立的构件；制造方法包括下述步骤第一步、配制腔体原料将腔体原料配制成液态；第二步、原料固化将液态的腔体原料倒在硅片或玻片上，在烘箱中烘若干时间，使腔体原料固化成腔体坯料；第三步、制作腔体将腔体坯料切割成上腔体(1. 1)和下腔体(1. 2)的形状；然后加工上腔室(2.1)和下腔室(2. 2 )及电极孔(6 )和液体进出通道(5 )；电极孔(6 ) —个靠近上腔体(1. 1)的下端面，另一个靠近下腔体(1. 2)的上端面；第四步、组装将微孔薄膜(3)平铺在下腔体(1.2)的上端面上，然后将上腔体(1. 1) 安放在下腔体(1. 2)上端面上的微孔薄膜(3)上，再将下腔体(1. 2)的下端面安放在底座 (1.3)上，最后用高真空氧等离子体法将下腔体(1.2)的上端面和上腔体(1. 1)的下端面及微孔薄膜(3)键合在一起；再以同样方法将下腔体(1.2)的下端面与底座(1.3)键合在一起；第五步、将上腔室电极(6. 1)和下腔室电极(6. 2)分别插入上腔电极孔和下腔电极孔中。
10.一种权利要求1至8任意一权利要求所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置在细胞生物学研究、药物筛选和疾病诊断领域的应用。
11.一种权利要求1至8任意一权利要求所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置应用于细胞跨膜迁移的实时测控方法，其特征在于，测控装置包括腔体(1 )，该腔体 (1)中部有能容纳液体的腔室(2)，该腔室(2)其中部由一个微孔薄膜(3)将腔室(2)隔成上腔室(2. 1)和下腔室(2. 2)；实时测控的方法包括下述步骤A、将腔体(1)进行消毒灭菌；B、从上腔室(2.1)入口处向上腔室(2.1)足量灌注含有细胞的培养液，其细胞含量为 每毫升含有细胞的培养液中具有IO5 IO7个细胞；C、从下腔室(2.2)的液体进出通道(5)足量灌注不含细胞的培养液，和/或用于实验的药液；D、待细胞培养一定时间后，注入含适量浓度血小板源生长因子的培养液代替下腔室 (2. 2)内的原不含细胞的培养液作为细胞迁移的诱导剂；细胞在诱导剂的作用下，通过微孔薄膜(3)陆续从上腔室(2. 1)迁移到下腔室(2. 2)；E、上腔室电极(6.1)为工作电极，下腔室(2. 2)为参比电极，分别紧密分布在微孔薄膜 (3)的上下两侧，该两电极与分析装置(7)连接，用于对细胞的迁移过程进行实时测控，包括对单细胞的迁移引起的阻抗变化进行检测。
12.如权利要求11所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置应用于细胞跨膜迁移的实时测控方法，其特征在于，所述B步骤中，向上腔室(2. 1)足量注入的含有细胞的培养液是每毫升含有IO5 IO7个癌细胞U-87的含有细胞的培养液。
13.如权利要求11所述的细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置应用于细胞跨膜迁移的实时测控方法，其特征在于，所述B步骤中，向上腔室(2. 1)足量注入的含有细胞的培养液是每毫升含有IO5 IO7个癌细胞HCT-116的含有细胞的培养液；还有F、在选定的时间，将迁移到下腔室(2.2)的细胞用钙黄绿素-AM原液孵育后用倒置光学显微镜进行荧光成像；G、为用于比较，在不同时间，将迁移到下腔室(2.2)的细胞用光学显微镜观察并计数， 并在不同浓度化学诱导剂作用下采集数据，与阻抗测量得到的结果进行比较。
全文摘要
本发明涉及细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置及其制造方法和应用方法，特别适用于细胞电阻抗测量、细胞迁移、癌症检测、药物筛选、微流控及纳米技术应用。跟踪测控装置它包括腔体，其中部有能容纳液体的腔室，该腔室其中部由一个微孔薄膜将腔室隔成上腔室和下腔室；上腔体的电极孔插入的是上腔室电极，下腔体的电极孔插入的是下腔室电极，两电极分别与分析装置联接；下腔体的下部有与外部联通的液体进出通道。本发明的优点是1、实时检测细胞，对体外培养细胞跨膜迁移过程进行高分辨、实时和无损伤、可靠跟踪测控、分析；2、提高检测灵敏度实现对单细胞的跨膜迁移追踪；3、通过微流管道精确的确定药物对细胞的效用；4、减小人为测控误差；5、操作简便、精确度高；6装置制造简单，成本低。
文档编号G01N35/00GK102539485SQ20121001093
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者刘剑淼, 江莲梅, 汪莉, 石剑, 陈勇 申请人:武汉介观生物科技有限责任公司