专利名称：一种检测水产品中呋喃唑酮代谢物的试剂板的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测水产品中呋喃唑酮代谢物的试剂板，具体涉及一种检测呋喃唑酮代谢物的免疫胶体金快速检测试剂板。
背景技术：
呋喃唑酮，即3-(5-硝基糠醛缩氨基)-2-唑烷酮，又称痢特灵，属硝基呋喃类药物。硝基呋喃类药物是一类人工合成的抗菌药物，主要指呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林以及呋喃它酮，为广谱抗生素，对革兰阳性及阴性菌均有一定抗菌作用。由于呋喃唑酮价格低廉且治疗效果好，因此被广泛应用于家禽、家畜、水产类的痢疾、肠炎、球虫病以及火鸡黑头病的预防和治疗中。但有关研究证明，硝基呋喃类药物及其代谢物具有相当大的毒性，大剂量或长时间使用硝基呋喃类药物均能对养殖动物产生毒性作用和致癌、致畸、致突变作用。 硝基呋喃类化合物是直接致变剂，它不用附加外源性激活系统就可以引起细菌的突变。呋喃它酮为强致癌性药物，呋喃唑酮具中等强度致癌性。繁殖毒性结果表明，呋喃唑酮能减少精子的数量和胚胎的成活率。当含有硝基呋喃类抗生素残留的动物源性食品为人所食用后，这些代谢物就可以在胃酸作用下从蛋白质中释放而被人体吸收，造成严重危害，因而引起了人们的高度重视。 自1995年起欧盟全面规定禁止使用呋喃类抗菌物质，在动物源性食品中呋喃类残留物的检出限为不得检出。2004年美国FDA公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。我国农业部文件农牧发[2002] 1号也规定动物源性食品中呋喃唑酮的检出限为不得检出。近几年因为呋喃唑酮药物残留超标阻碍我国水产品出口贸易的事例也屡见报道。 2005年11月，日本对中国大陆和台湾省的烤鳗分别检测出硝基呋喃类代谢产物AOZ超标。 2006年2月，宁波慈溪某进出口公司的27. 5t冻烤鳗由于被检出硝基呋喃类代谢产物AOZ 超标，被日本方面全部退回，损失达54. 6万美元。呋喃唑酮药物在体内代谢迅速，代谢的部分化合物分子与细胞膜蛋白结合成为结合态，可长期保持稳定，所以在食品安全的检测中主要是检测呋喃唑酮代谢物。目前用于检测此类药物及其代谢物残留的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液-质联用法 (LC-MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)等。HPLC法和LC-MS法是目前国际上最常用来测定呋喃唑酮代谢物的方法，LCMS法可以利用待测分子的结构来定性，可以排除ELISA和HPLC法检测的假阳性结果，用以确证检测结果。但这两种检测方法涉及到大量的有机溶剂处理，过程比较复杂，周期也比较长，操作时需要专门的技术人员，难以满足现代检测快速、简捷、现场化的要求。ELISA测定的基础是抗原抗体反应，该法精确、灵敏，检测时间大大缩短，但是 ELISA法中酶的活性易受反应条件影响，由此易造成测定结果重复性较差。此外ELISA试剂寿命短，因此需要低温保藏。基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学测定方法灵敏度较高，特异性强，试样预处理简单，分析时间短，使用方便。因此，在现场监控和基层的大规模筛选检测中，免疫学检测方法更实际。胶体金免疫层析法是在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，除了具备酶联免疫法的诸多优点外，还克服了酶联免疫法的一些不足。该方法将反应所需要的原料的全部或大部分均已整合到试剂中，反应通常只需数分钟，测试结果以肉眼可见的显色条带来判断。具有简便快速、操作简单、特异性强、不需要额外设备等优点。

实用新型内容本实用新型针对检测需求，研制开发一种检测限符合要求，重现性好，检测时间短，适合现场快速检测，技术产品或仪器设备成本较低，运行费用低的快速检测试剂。本实用新型试剂板应用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标抗体反应显色，特异性检测水产样品中的呋喃唑酮代谢物残留水平。检测样品包括鱼、虾等水产品。如果样品溶液中含有呋喃唑酮代谢物残留，呋喃唑酮代谢物先和胶体金颗粒上的抗体反应， 因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的呋喃唑酮代谢物药物占据而无法与检测线上呋喃唑酮代谢物特异性抗原结合；当样品中的呋喃唑酮代谢物含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色较控制线浅甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中呋喃唑酮代谢物含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与控制线相近或偏深，判定为阴性。本实用新型试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。相邻各部分间有l-2mm的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。胶体金结合垫上包被有抗呋喃唑酮代谢物单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有呋喃唑酮代谢物-载体蛋白偶联物和羊抗鼠工gG，分别作为检测线和控制线。偶联呋喃唑酮代谢物的载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白等。本实用新型试剂板的各部分组成成分和功能如下塑料模板，起固定背衬和标示各功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用。背衬，由一面涂有不干胶的不吸水韧性材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部分的作用。样品垫，由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值的作用。胶体金结合垫，由聚酯膜制成，其上有抗呋喃唑酮代谢物单克隆抗体与胶体金颗粒的结合物，为样品溶液中有效成分和金标抗体反应提供场所。硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。吸水垫，由滤纸制成，将反应过程中多余的溶液吸收。本实用新型试剂板具有如下有益效果(1)特异性好。本实用新型试剂板对呋喃唑酮代谢物的交叉反应率为100%，对如呋喃西林代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃妥因代谢物等抗生素的交叉反应率均低于1%。可见，本实用新型试剂板对呋喃唑酮代谢物反应具有高度专一性。[0023](2)灵敏度高。本实用新型试剂板对水产品中呋喃唑酮代谢物的检出限为 0. 5ppb，在水产品中对呋喃唑酮代谢物的检测达到了较优水平，适用于各类企业及检测机构。(3)操作简单快捷。本实用新型试剂板将反应所需的大部分原料整合到PVC背衬中，滴样后，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检样时间，且样品无需特殊处理， 滴样后5-10分钟即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和控制线的颜色深浅读取结果。检测实施过程不依赖任何实验设备，普通人员均可操作，不需专业培训。(4)成本低，易推广。本实用新型试剂板生产工艺简单，流程成熟。生产成本低廉， 投资少，收效快。

图1为呋喃唑酮代谢物免疫胶体金快速检测试剂板背衬结构示意图，其中1为样品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为控制线，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC底板。图2为呋喃唑酮代谢物免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔， C为控制区，T为检测区。图3为呋喃唑酮代谢物免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中C为控制区，T为检测区。具体实施方法本实用新型试剂板的制备包括载体蛋白偶联物的制备，抗呋喃唑酮代谢物单克隆抗体的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记抗呋喃唑酮代谢物单克隆抗体的制备和呋喃唑酮代谢物免疫胶体金快速检测试剂板的组装。1.半抗原与载体蛋白的偶联呋喃唑酮代谢物对醛基苯甲酸衍生物合成称取3g对醛基苯甲酸于IOmL蒸馏水中，滴加二甲基甲酰胺(DMF)至对醛基苯甲酸完全溶解，搅拌中加入1. Og呋喃唑酮代谢物， 室温反应池，过滤水洗得白色固体即为呋喃唑酮代谢物对醛基苯甲酸衍生物。呋喃唑酮代谢物对醛基苯甲酸衍生物-牛血清蛋白(BSA)的合成称取23. 4mg 呋喃唑酮代谢物对醛基苯甲酸衍生物溶于2mLDMF，搅拌加入27. 5mg的DCC，14. 4mg的 NHS，4°C反应过夜，5000r/min离心lOmin，取上清液标记为A液。取170mg的BSA溶于 IOmLO. lmol/L的PBS (pH 8. 0)缓冲溶液，加入ImL的DMF溶解，标记为B液。将A液逐滴加入到B液中，同时搅拌。4°C下密封反应4h。5000r/min下离心lOmin，取上清液，4°C下 PBS (pH 7. 4)透析3d，每天换液2次。反应产物_20°C冰箱保存备用。用卵清蛋白(OVA)替代BSA，采用同样方法制备硝基呋喃类代谢物对醛基苯甲酸衍生物-卯清蛋白偶联物。2.抗呋喃唑酮代谢物单克隆抗体的制备取6 8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的BSA偶联物与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按100 μ g/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫1次，用不完全佐剂腹腔注射。融合前3d强化免疫1次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37°C，5% CO2培养箱中培养。融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛选择10mg/L BSA包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠 IgG-HRP(l 1000)，0PD显色。筛选出的阳性孔再用卵清蛋白偶联物包被的酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2X10_3mol/L呋喃唑酮代谢物溶液等量混合，37°C感作 lh，加入已包被的酶标板中。另外用PBS (0. 01mol/L、pH7. 4)替代呋喃唑酮代谢物溶液作对照，其余步骤同上。若呋喃唑酮代谢物阻断后的OD值降至对照孔的50%以下，则判为阳性孔。经2 3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。体外培养将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5 X IOVmL时停止换液，细胞全部死亡后收集培养液。体内诱生腹水给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株IO7个细胞，7天后抽取腹水。3.胶体金溶液的制备胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在IOOmL去离子水中加入ImL 1% 柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入ImL 氯金酸，继续煮沸lOmin，冷却后，4°C下保存备用。4.胶体金标记抗呋喃唑酮代谢物单克隆抗体的制备取已制备好的IOOmL胶体金溶液，用0. lmol/L碳酸钾溶液调pH到8. O。边搅拌边加入1. 5mg抗呋喃唑酮代谢物单抗，搅拌20min，再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇 20000 (PEG20000)，搅拌 15min。20，OOOrpm 离心 15min，弃上清液，加入 IOmL pH 7. 4PBS 缓冲液(含0. 4mol/L PEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2% BSA的PBS缓冲液(pH 7. 4)溶解，用0. 22 μ m无菌过滤器过滤后，4°C保存备用。5.呋喃唑酮代谢物免疫胶体金快速检测试剂板的组装参照图1，用点膜机把适当浓度的载体蛋白偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，37°C烘箱干燥他。以同样方法，将制备好的金标记呋喃唑酮代谢物单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。检测试剂组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板， 再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。6.呋喃唑酮代谢物免疫胶体金快速检测试剂板检测实施操作方法6. 1样品制备取一定量的去脂肪组织样本，用剪刀剪碎，称取2g剪碎样本于50mL离心管中，并加入4mL去离子水，0. 5mL lmol/L的盐酸，0. ImL样本衍生化试剂，充分混合!Bmin ；60°C水浴条件下孵育lh，取出后加入5mL 0. lmol/L的磷酸氢二钾，0.4mL lmol/L的氢氧化钠，6mL 提取剂，充分混合lmin，4000r/min，离心5min，移取上层溶液3mL于5mL离心管中，60°C下空气吹干，向吹干的试管中加入ImL净化剂，加盖振荡lmin，然后加入0. 3mL复溶液，充分混勻，4000r/min，离心lmin (或静置至明显分层)，吸取0. 1 μ L下层溶液，待检。6. 2检测步骤从包装袋中取出试剂板，吸取待检样品溶液100 μ L滴加到加样孔中，加样后开始计时；结果应在3 5min读取，其他时间判读无效。观察时，试剂板水平放置于观察者正[0051]6. 3结果判读读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面，如图2右侧所示。阴性㈠T线显色比C线深或一样深，表示样品中呋喃唑酮代谢物残留含量低于 0. 5ppb或不含呋喃唑酮代谢物残留。如图3. a所示。阳性⑴T线显色比C线浅，或T线无显色，表示样品中呋喃唑酮代谢物残留含量高于0. 5ppb ；T线显色比C线越浅，表示样品中呋喃唑酮代谢物残留含量越高。如图3.b所
7J\ ο无效未出现C线，可能是操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。如图3. c所示。
权利要求1.一种检测水产品中呋喃唑酮代谢物的试剂板，其特征在于试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，试剂板背衬上依次紧密粘贴的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻各部分间有l-2mm的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。
2.如权利要求1所说的试剂板，其特征在于试剂板的硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。
3.如权利要求1所说的试剂板，其特征在于胶体金颗粒的平均大小为30nm。
4.如权利要求1所说的试剂板，其特征在于，样品垫由玻璃纤维制成，胶体金结合垫由聚酯膜制成，吸水垫为滤纸。
专利摘要本实用新型涉及一种检测水产品中呋喃唑酮代谢物的试剂板，可用于检测水产品中的呋喃唑酮代谢物。本实用新型试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，可将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。该试剂板可进行半定量直观检测，整个操作过程仅需2小时左右，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛选，适合检验检疫机构、海洋与渔业局、水产质量检测部门等对水产品中非法使用呋喃唑酮药物进行大规模快速检测。
文档编号G01N33/558GK202196069SQ201120302108
公开日2012年4月18日 申请日期2011年8月19日 优先权日2011年8月19日
发明者张少恩, 柳爱春, 桑丽雅, 赵芸 申请人:杭州南开日新生物技术有限公司, 杭州市农业科学研究院