专利名称：甘薯上马铃薯y病毒属病毒的血清学检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物工程技术领域，特别是涉及甘薯上的马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒。
背景技术：
甘薯羽状斑驳病毒potato feathery mottle 口>狀，SPFMV)、甘薯潜隐病: {Sweet potato latent virus, SPLV)^1^ G ^ {Sweet potato virus SPVG)禾口甘薯脉花叶病毒(Sfveet potato vein mosaic virus, SPVMV)是危害甘薯的主要病毒，4种病毒都属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)A种病毒或与其他病毒常常混合侵染甘薯，造成甘薯产量降低，品质变劣和种性退化，对甘薯生产造成严重危害。对甘薯病毒病目前尚无特别有效的化学防治方法，利用茎尖分生组织培养，培育脱毒甘薯是防治病毒病最有效的方法。在脱毒甘薯的培养和脱毒种薯(苗)实现产业化过程中，病毒的快速检测技术是保证脱毒种薯质量以及实现脱毒种薯产业化非常关键的技术。只有利用快速、高效的病毒检测技术，筛选出真正无毒的试管苗并及时淘汰不同级别的感病种苗，才能使真正的脱毒种薯用于生产，确保脱毒种薯的增产效果，进而加快脱毒种薯的推广进程。因此，建立甘薯病毒高效的检测技术是培育脱毒甘薯的前提和基础。目前用于甘薯病毒检测的常用方法是酶联免疫吸附(ELISA)技术，以及在此基础上建立的硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定(NCM-ELISA)技术。由于侵染甘薯的PoiJ^ir皿^病毒种类较多，当不需要确定病毒种类，只需要确定样品中是否含有病毒时(譬如对甘薯脱毒茎尖苗进行检测)，利用上述方法进行检测时需要对各种病毒逐一进行检测，往往费时费力，造成浪费。

实用新型内容本实用新型要解决的技术问题克服背景技术中的问题，提供一种简便、高效和低成本的检测甘薯上四种马铃薯Y病毒属病毒的试剂盒。本实用新型的技术方案甘薯上马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒，所述试剂盒分为上、下两层，上、下两层之间设置有隔板，上层还设有试剂瓶插孔，插孔中放置有试剂瓶，下层为可推拉的抽屉，抽屉中放置有硝酸纤维素膜；不同试剂瓶中分别装有马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体、马铃薯Y病毒属病毒的混合抗体以及碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔IgG、氯化硝基四氮唑蓝、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐和1Tris-HCl溶液。所述试剂瓶为九个，其中一号试剂瓶装有甘薯羽状斑驳病毒SPFMV抗体，二号试剂瓶装有甘薯潜隐病毒SPLV抗体，三号试剂瓶装有甘薯G病毒SPVG抗体，四号试剂瓶装有甘薯脉花叶病毒SPVMV抗体，五号试剂瓶装有上述四种病毒的混合抗体；六号试剂瓶装有工作浓度为1 :1000倍的碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔IgG，七号试剂瓶装有浓度为50mg/ml的氯化硝基四氮唑蓝NBT，八号试剂瓶装有浓度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐BCIP，九号试剂瓶9装有pH为7. 5的2M Tris-HCl溶液。[0007]所述四种马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体均是利用大肠杆菌中表达的病毒外壳蛋白，通过纯化蛋白、免疫家兔的方法制备获得，所述四种马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体和混合抗体的效价均为4096倍，工作浓度为1 :1000倍。本实用新型的积极有益效果(1)本实用新型提供了一种检测甘薯上/^ij^irMM病毒的简便、高效和低成本的试剂盒。检测样品时，当只需要确定样品中是否含有/^ij^ir皿^病毒时使用试剂盒中装有混合抗体的试剂瓶进行检测；当需要确定含有某种特定病毒时，再使用其他试剂瓶中的特异性抗体，检测方便，节省了检测成本。(2)本实用新型检测简单、直观，只需要将NC膜晾干后观察颜色反应，比较检测样品与正负对照的颜色反应，出现紫色颜色反应的样品为阳性，从而判断出是否含有Potyviruses病毒，方便实用。(3)本试剂盒可应用于脱毒甘薯茎尖苗和各级种薯的检测，通过对/^ij^irMM病毒的快速高效检测，可以确保脱毒甘薯的质量和增产效果；也可对甘薯病毒的种类进行特异性检测，可应用于甘薯种薯调运以及病害调查等过程中。(4)本试剂盒特别适用于甘薯脱毒茎尖苗的检测，也可直接推广到基层农技单位开展病害普查和预测预报，或用于脱毒甘薯种薯的质量监测，使真正的脱毒甘薯应用于生产。

图1 本实用新型的试剂盒结构示意图；图2 本实用新型的试剂盒对甘薯样品的检测结果显示图。
具体实施方式
实施例1、甘薯上马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒，参见图1，图中1为试剂盒上层，2为试剂瓶，3为试剂盒下层。试剂盒中含有四种马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体和一种混合抗体，所述的试剂盒分为上、下两层，上、下两层之间设置有隔板，上层还设有试剂瓶插孔，插孔中放置有试剂瓶，下层为可推拉的抽屉，抽屉中放置有硝酸纤维素膜；上层的试剂瓶为九个，分别为一号至九号试剂瓶，其中一号试剂瓶中的甘薯羽状斑驳病毒SPFMV抗体，二号试剂瓶为甘薯潜隐病毒SPLV抗体，三号试剂瓶为甘薯G病毒SPVG抗体，四号试剂瓶为甘薯脉花叶病毒SPVMV抗体，五号试剂瓶为上述四种病毒的混合抗体；六号试剂瓶为工作浓度为1 :1000倍的碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔IgG 二抗，七号试剂瓶为浓度为50mg/ml的氯化硝基四氮唑蓝NBT，八号试剂瓶为浓度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐BCIP，九号试剂瓶9 为 pH 为 7. 5 的 2M Tris-HCl 溶液。SPFMV、SPLV、SPVG、SPVMV 4种病毒的抗体均是利用在大肠杆菌中表达的病毒外壳蛋白，通过纯化蛋白，免疫家兔的方法制备获得，4种病毒的抗体以及混合抗体的效价均为4096倍，工作浓度为1 :1000倍。用试剂盒检测样品时，当只需要确定样品中是否含有马铃薯Y病毒属病毒时，使用混合抗体的五号试剂瓶进行检测；当需要确定含有马铃薯Y病毒属病毒的某种病毒时，则使用一号至四号试剂瓶进行检测。实施例2、甘薯上马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤1、缓冲液的配制(1) TBS 0. 02M Tris+0. 50M NaCl, pH7. 5 ；(2)抽提缓冲液TBS+0. 2%亚硫酸钠；(3)封闭液:TBS+2% 脱脂奶粉 +2% triton X-100 ；(4)抗体缓冲液TBS+^)脱脂奶粉；(5) T-TBS :TBS+0. 05% Tween 20 ；(6)底物缓冲液0. IM Tris+ 0. IM NaCl+5mM MgCl2'6H20, pH=9. 5 ；其中M是指单位mol/L。2、检测步骤(1)准备硝酸纤维素膜(NC膜):剪取合适大小的NC膜，用铅笔在膜上做好标记，以便于点样。(2)样品处理将0. Ig甘薯样品于液氮中速冻并研磨呈粉末，加入ΙΟΟμΙ抽提缓冲液(TBS+ 0. 2%亚硫酸钠)继续研磨至彻底裂解，并转移到1.5ml离心管中，5000rpm离心5min。(3)点样将NC素膜于TBS中浸泡1 min，用滤纸吸去膜表面液体，取上清液5μ1点于膜上，室温晾干。(4)封闭加入IOml封闭液(TBS+觊脱脂奶粉+2%triton X-100)于培养皿中，将NC膜浸入其中，室温孵育60 min。(5)洗膜弃去封闭液，用TBS洗NC膜一次。(6)加一抗(SPFMV、SPLV、SPVG、SPVMV 抗体或混合抗体)将NC膜置于用抗体缓冲液(TBS+洲脱脂奶粉)稀释至工作浓度的抗体(SPFMV、SPLV、SPVG、SPVMV抗体或混合抗体)中，室温下振荡(50rpm/min)孵育过夜，所有抗体的工作浓度均为1 :1000倍。(7)洗膜弃一抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次。(8)加二抗(碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG)用滤纸吸去膜上多余的溶液，然后将NC膜置于用抗体缓冲液(TBS+洲脱脂奶粉)稀释至工作浓度的酶标抗体(碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG)中，室温下振荡(50rpm/min)孵育1 h ；二抗的工作浓度为1 :1000倍。(9)洗膜弃二抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次。(10)显色将NC膜置于NBT/BCIP底物溶液中，每5ml底物缓冲液先加入33μ NBT,再加入16. 5μ1 BCIP室温下摇床振荡(50 rpm/min)避光显色5_30 min (必要时增加显色时间)。(11)终止反应将NC膜从底物溶液中取出，用蒸馏水洗NC膜3次，3-4min/次。(12)阳性判断晾干后观察颜色反应，比较检测样品与正负对照的颜色反应，出现紫色颜色反应的样品为阳性。实施例3、甘薯上/^ij^irMM病毒血清学检测试剂盒的应用[0044]利用本试剂盒，对采自田间的M份田间甘薯样品进行检测。检测步骤按实施例2的步骤。一抗采用混合抗体抗血清(五号试剂瓶)。工作浓度为1 :1000倍。结果表明，对份甘薯样品中有10份甘薯样品呈阳性反应(见图2)，阳性率为41. 7%，说明这些甘薯样品上普M^f ^ Po tyviruses 病毒。图2中，上排1、2、3、4、5、6、7、8，以及下排1、2为阳性样品。
权利要求1.甘薯上马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒分为上、 下两层，上、下两层之间设置有隔板，上层还设有试剂瓶插孔，插孔中设有试剂瓶，下层为可推拉的抽屉，抽屉中设有硝酸纤维素膜。
2.如权利要求1所述的血清学检测试剂盒，其特征在于，所述试剂瓶中分别装有马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体、马铃薯Y病毒属病毒的混合抗体以及碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔IgG、氯化硝基四氮唑蓝、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐和Tris-HCl溶液。
3.如权利要求1所述的血清学检测试剂盒，其特征在于，所述试剂瓶为九个，其中一号试剂瓶装有甘薯羽状斑驳病毒SPFMV抗体，二号试剂瓶装有甘薯潜隐病毒SPLV抗体，三号试剂瓶装有甘薯G病毒SPVG抗体，四号试剂瓶装有甘薯脉花叶病毒SPVMV抗体，五号试剂瓶装有上述四种病毒的混合抗体；六号试剂瓶装有工作浓度为1 :1000倍的碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔IgG，七号试剂瓶装有浓度为50mg/ml的氯化硝基四氮唑蓝NBT，八号试剂瓶装有浓度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐BCIP，九号试剂瓶装有pH为7. 5的 2M Tris-HCl 溶液。
专利摘要本实用新型涉及甘薯上马铃薯Y病毒属病毒的血清学检测试剂盒。试剂盒分为上、下两层，上层放置有试剂瓶，下层为可推拉的抽屉，抽屉中放有硝酸纤维素膜；不同试剂瓶中分别装有马铃薯Y病毒属病毒的特异性抗体、马铃薯Y病毒属病毒的混合抗体以及碱性磷酸脂酶标记的羊抗兔IgG、NBT、BCIP和Tris-HCl溶液。检测样品时，当需要确定样品中是否含有马铃薯Y病毒属病毒时，使用混合抗体试剂瓶检测；当需要确定某种特定病毒时，使用其他特异性抗体检测，检测方便，节省成本，检测方法简单、直观，方便实用。本实用新型可应用于脱毒甘薯茎尖苗和各级种薯的检测，通过对Potyviruses病毒的快速高效检测，可以确保脱毒甘薯的质量和增产效果。
文档编号G01N33/569GK202330434SQ201120460398
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月18日 优先权日2011年11月18日
发明者乔奇, 张德胜, 张振臣, 王永江, 王爽, 田雨婷, 秦艳红 申请人:河南省农业科学院