专利名称：脉血康胶囊的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种脉血康胶囊的检测方法，属于药品技术的领域。
背景技术：
被成为“富贵病”的“三高症”是心脏血管和脑血管的疾病统称。心脑血管疾病严重威胁人类健康，当今已成为50岁以上中老年人的常见病，具有关调查显示，我国心脑血管疾病患者已超过2.7亿人，尽管现代医学的快速发展，但我国每年死于心脑血管疾病近300万人。现代医学研究表明，引起心脑血管疾病发病原因是血液粘稠、高血压以及不良的生活习惯等等；另外，诸多因素导致的血瘀经闭、跌打损伤所引起的血瘀、疼痛均严重影响现人们的正常生活。脉血康胶囊是一种以水蛭制成的用于血瘀经闭、跌打损伤和心脑血管疾病的胶囊制剂，具有破血、逐瘀、通脉止痛的功效，临床上已经取得良好疗效。脉血康胶囊是维护人类健康的重要药物之一；为此，脉血康胶囊的质量极其重要，尤其是其中有效成分的控制，该环节关系到产品的各个方面乃至患者的健康。目前，脉血康胶囊已有成分控制只限于抗凝血酶活性的测定，存在一定的片面性。为确保临床药效，客观、有效、全面地对脉血康胶囊的质量进行控制，本发明提供了一种脉血康胶囊的检测方法
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种脉血康胶囊的检测方法。所述检测方法准确，重复性好。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现:所述脉血康胶囊由鲜水蛭粉碎后填充胶囊而得。具体地说，由鲜水蛭，在-10°C -15°C下冷冻，取出捣碎，40°C 50°C、-0.1MPa干燥，粉碎，过筛，装入肠溶胶囊，即得。所述脉血康胶囊的检测方法包括包括对氨基酸和多糖的含量测定。其中，氨基酸的含量测定方法为:采用高效液相色谱法测定:色谱条件:0DS色谱柱4.6mmX 250mm, 5 ii m ;流动相A相:0.02mol L4醋酸钾溶液，加四氢呋喃2.85iU ;所述0.02mol L—1的醋酸钾溶液是由三乙醇胺与1.5%冰醋酸溶液调至pH7.2 ；B相:pH7.2的0.1mol L—1醋酸钾溶液:甲醇:乙腈=200: 200: 200 ；梯度洗脱:0 15min，100% A 相，15 16min，40% A 相-60% B 相，16 30minl00% B 相；波长:初始 338nm, 16.5min 时 262nm ;流速:1ml mirf1 ;柱温:20 25°C ；供试品溶液的制备:取4粒脉血康胶囊去壳，精密称取内容物粉末1.0gJp 0.9%生理盐水50ml浸泡24h，匀浆，以3000r - min离心lOmin，收集上清液；所余沉淀再以30ml乙醇60°C回流2次，每次30min，合并提取液，滤过，挥去乙醇至无醇味，放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液；精密量取脉血康胶囊提取液50 Ul置于有盖小瓶，加含I %苯酚的6mol L—1盐酸200iU，冲氮气lmin，压盖后置于恒温反应器中，110°C反应20h，取出后加入40%氢氧化钾溶液120iU，涡旋8 lOmin，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
对照品溶液的制备:精密量取氨基酸标准品2ml，无需做任何处理，直接进样；测定法:分别取待测供试品溶液和对照品溶液各5iU，置于自动进样瓶中，进样测定，即得。所述多糖的含量测定方法为:采用分光光度法测定:供试品溶液的制备:取胶囊内容物粉末2.0g，精密称定，置于索式提取器中，加入60 90°C的石油醚120ml回流提取8h，弃取石油醚，残渣挥干石油醚，再置于圆底烧瓶中，加蒸馏水50ml回流提取3次，每次lh，合并提取液，滤过，滤液浓缩至50ml，加氯仿50ml萃取3次，取上清液置于IOOml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置冰箱内备用；对照品溶液的制备:精密称定葡萄糖对照品0.0035g，加蒸馏水溶解，定容于25ml量瓶中，即得浓度为0.140mg mr1的葡萄糖对照品溶液；测定法:分别量取对照品溶液和样品供试液0.5ml于试管中，加蒸馏水1ml，精密加入苯酹1.0ml,迅速加入浓硫酸5.0ml摇勻,冷却至室温；同法制备空白溶液，置于沸水加A 15min，冷却；在487nm处测定吸收度值，即得。具体地说，所述脉血康胶囊的检测方法为:性状本品为肠溶胶囊 剂，内容物为灰黄色至灰褐色颗粒或粉末；气微腥，味微咸。鉴别取本品内容物2g，加生理盐水10ml，充分搅匀，浸溃30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取水蛭对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各lul，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-乙醇-水(4: I: I: 2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.5%茚三酮溶液，在110°C烘约5分钟。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫色斑点。检查水分称取本品内容物2.0 2.2g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶(40*25mm)中，厚度不超过5_，照水分测定法(《中国药典》一部附录IX H第一法)测定，不得过7.0%。装量差异照胶囊剂装量差异项下(《中国药典》一部附录IL)测定，取供试品10粒，分别精密称定重量，倾出内容物(不得损失囊壳)，硬胶囊囊壳用小刷或其它适宜的用具拭净。分别精密称定囊壳重量。求出每粒内容物的装量。每粒装量与标示量相比较，超出装量差异限度的不得多于2粒，并不得有I粒超出限度一倍。规定本胶囊剂装量差异限度为标示装量的±7.5%。崩解时限照崩解时限检查法(《中国药典》一部附录XD A)测定，在盐酸溶液(9 — 1000)中检查2小时，每粒的囊壳均不得有裂缝或崩解现象；将吊篮取出，用少量水洗涤后，每管加入挡板，依法在人工肠液中检查，40分钟内应全部崩解。如有一粒不能完全崩解，应另取6粒复试，均应符合规定。含量测定
抗凝血酶活性测定取本品装量差异项下的内容物约lg，精密称定，精密加入生理盐水5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100 u 1，置试管中，加入含0.5 %纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.lmol/L盐酸溶液40ml，加水至100ml，即得，pH值7.4。) 200 yl，摇匀，置37°C缓缓滴加每Iml中含40U的凝血酶溶液(每分钟5 V-1,边滴加边轻轻摇勻)至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积数，按下式计算:U = C1V1WZC2V2式中U:每粒含抗凝血酶活性单位；C1:凝血酶溶液的浓度/ml)；C2:供试品溶液的浓度(g/ml)；V1:消耗凝血酶溶液的体积(Ul);V2:供试品溶液的加入量(Ul);W:平均装量； 中和一个国际单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位。本品每粒含抗凝血酶活性应为11.9 16.1U。氨基酸含量测定色谱条件:0DS色谱柱(4.6mmX 250mm, 5 u m);流动相A相:0.02mol吨―1醋酸钾溶液(三乙醇胺与1.5%冰醋酸溶液调至pH7.2)，加四氢呋喃2.85iU，B相:0.1mol.L—1醋酸钾溶液(PH7.2)-甲醇-乙腈(200: 200: 200);梯度洗脱:0 15min，100% A相，15 16min,40% A 相-60% B 相，16 30minl00% B 相；波长:初始 338nm, 16.5min 时 262nm ；流速:lml mirT1 ;柱温:20 25。。。供试品溶液的制备:取4粒脉血康胶囊去壳，精密称取内容物粉末1.0gJP 0.9%生理盐水50ml浸泡24h，匀浆，以3000r - min离心lOmin，收集上清液；所余沉淀再以30ml乙醇60°C回流2次，每次30min，合并提取液，滤过，挥去乙醇至无醇味，放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液；精密量取脉血康胶囊提取液50 Ul置于有盖小瓶，加含I %苯酚的6mol L—1盐酸200iU，冲氮气lmin，压盖后置于恒温反应器中，110°C反应20h，取出后加入40%氢氧化钾溶液120iU，涡旋8 lOmin，滤过，取续滤液作为供试品溶液。对照品溶液的制备:精密量取氨基酸标准品2ml，无需做任何处理，直接进样。测定法:分别取待测供试品溶液和对照品溶液各5iU，置于自动进样瓶中，进样测定，即得。多糖含量测定脉血康胶囊供试品溶液的制备:取胶囊内容物粉末2.0g，精密称定，置于索式提取器中，加入石油醚(60 90°C ) 120ml回流提取8h，弃取石油醚，残渣挥干石油醚，再置于圆底烧瓶中，加蒸馏水50ml回流提取3次，每次lh，合并提取液，滤过，滤液浓缩至50ml，力口氯仿50ml萃取3次，取上清液置于IOOml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置冰箱内备用；对照品溶液的制备:精密称定葡萄糖对照品约0.0035g，加蒸馏水溶解，定容于25ml量瓶中，即得浓度为0.140mg mF1的葡萄糖对照品溶液；测定法:分别量取葡萄糖对照品溶液和样品供试液0.5ml于试管中，加蒸馏水Iml,精密加入苯酹1.0ml,迅速加入浓硫酸5.0ml摇勻,冷却至室温；同法制备空白溶液，置于沸水加入15min,冷却；在487nm处测定吸收度值，即得。以下是本发明所述检测方法的研究实验例1:脉血康胶囊中氨基酸的含量测定研究I仪器与试药1.1仪器:1100型高效液相色谱仪，G1313A紫外检测器和自动进样系统，Agilent工作站(Agilent公司生产)。1.2试药:脉血康胶囊；混合氨基酸标品(Agilent公司，批号114580/1,含量 Mg mr1 分别为 Ser0.10509，Asp0.13311，Glu0.14713，His0.20963，Gly0.07507，Thr0.1192，Arg0.1742，Ala0.0891，Tyr0.018119，Pro0.11513，Cys0.12015，Val0.11715，Phe0.16519，Ile0.13118，Leu0.13118，Lys0.18265，Met0.13921);硼酸缓冲液、邻苯二甲醛、9-芴基甲基氯甲酸酯(色谱纯，Agilent公司)；乙醇、甲醇、乙腈、三乙醇胺(色谱纯，美国天地)。2方法与结果2.1 色谱条件:0DS 色谱柱(4.6mmX 250mm, 5 u m);流动相 A 相:0.02mol *L_1 醋酸钾溶液(三乙醇胺与1.5%冰醋酸溶液调至pH7.2)，加四氢呋喃2.85 u:0.1mol.L—1醋酸钾溶液(pH7.2)-甲醇-乙腈(200: 200: 200);梯度洗脱:0 15min，100% A相，15 16min，40 % A 相-60 % B 相，16 30minl00 % B 相；波长:初始 338nm，16.5min 时262nm ;流速:1ml mirT1 ;柱温:20 25。。。2.2溶液配置脉血康胶囊提取液的制备:取4粒脉血康胶囊去壳，精密称取内容物粉末1.0g,加0.9%生理盐水50ml浸泡24h，匀浆，以3000r -min离心lOmin，收集上清液；所余沉淀再以30ml乙醇60°C回流2次，每次30min，合并提取液，滤过，挥去乙醇至无醇味,放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液。供试品溶液:精密量取脉血康胶囊提取液50iU置于有盖小瓶，加含1%苯酚的6mol -r1盐酸200iU，冲氮气lmin，压盖后置于恒温反应器中，110°C反应20h，取出后加入40%氢氧化钾溶液120iil，涡旋8 lOmin，滤过，取续滤液作为供试品溶液。氨基酸标准品溶液:精密量取氨基酸标准品2ml，无需做任何处理，直接进样。2.3测定法:分别取待测供试品溶液和氨基酸标准品溶液各5 yl，置于自动进样瓶中，进样测定。2.4系统适应性考察:取氨基酸标准品溶液按2.3项下操作后进样，得17种氨基酸的理论塔板数均大于16000，峰的分离度>1.5。

2.5线性关系考察:分别精密吸取氨基酸标准品溶液(0.0210mg/ml)2、4、6、8、10 yl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值(Y)为纵坐标，氨基酸标准品进样量(X)为横坐标，得回归方程为:Y=3*107X-9128.7，r=0.9998，结果见表1、

图1。表I氨基酸标准品峰面积积分值与进样量关系
权利要求
1.一种脉血康胶囊的检测方法，其特征在于:所述脉血康胶囊由鲜水蛭粉碎后填充胶囊而得；所述检测方法包括对氨基酸和多糖的含量测定，其中，氨基酸的含量测定方法为:采用高效液相色谱法测定: 色谱条件:ODS色谱柱4.6mm X 250mm，5um ;流动相A相:0.02mol L—1醋酸钾溶液，加四氢呋喃2.85iU ;所述0.02mol L—1的醋酸钾溶液是由三乙醇胺与1.5%冰醋酸溶液调至pH7.2 ；B相:pH7.2的0.1mol L—1醋酸钾溶液:甲醇:乙腈=200: 200: 200 ;梯度洗脱:0 15min, 100% A 相，15 16min,40% A 相-60% B 相，16 30minl00% B 相；波长:初始 338nm, 16.5min 时 262nm ;流速:Iml mirf1 ;柱温:20 25°C ； 供试品溶液的制备:取4粒脉血康胶囊去壳，精密称取内容物粉末1.0gJP 0.9%生理盐水50ml浸泡24h，匀浆，以3000r min离心lOmin，收集上清液；所余沉淀再以30ml乙醇60°C回流2次，每次30min，合并提取液，滤过，挥去乙醇至无醇味，放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液；精密量取脉血康胶囊提取液50 Ul置于有盖小瓶，加含I %苯酚的6mol -r1盐酸200iU，冲氮气lmin，压盖后置于恒温反应器中，110°C反应20h，取出后加入40%氢氧化钾溶液120iil，涡旋8 lOmin，滤过，取续滤液作为供试品溶液； 对照品溶液的制备:精密量取氨基酸标准品2ml，无需做任何处理，直接进样； 测定法:分别取待测供试品溶液和对照品溶液各5iU，置于自动进样瓶中，进样测定，即得。
2.如权利要求1所述脉血康胶囊的检测方法，其特征在于:所述多糖的含量测定方法为:采用分光光度法测定: 供试品溶液的制备:取胶囊内容物粉末2.0g，精密称定，置于索式提取器中，加入60 900C的石油醚120ml回流提取8h，弃取石油醚，残渣挥干石油醚，再置于圆底烧瓶中，加蒸馏水50ml回流提取3次，每次 lh，合并提取液，滤过，滤液浓缩至50ml，加氯仿50ml萃取3次，取上清液置于IOOml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置冰箱内备用； 对照品溶液的制备:精密称定葡萄糖对照品0.0035g，加蒸馏水溶解，定容于25ml量瓶中，即得浓度为0.140mg mr1的葡萄糖对照品溶液； 测定法:分别量取对照品溶液和样品供试液0.5ml于试管中，加蒸馏水1ml，精密加入苯酹1.0ml,迅速加入浓硫酸5.0ml摇勻，冷却至室温；同法制备空白溶液，置于沸水加入15min，冷却；在487nm处测定吸收度值，即得。
3.如权利要求1或2所述脉血康胶囊的检测方法，其特征在于: 性状
本品为肠溶胶囊剂，内容物为灰黄色至灰褐色颗粒或粉末；气微腥，味微咸； 鉴别
取本品内容物2g，加生理盐水10ml，充分搅匀，浸溃30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取水蛭对照药材2g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各Iu 1，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸:乙醇:水=4: I: I: 2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.5%茚三酮溶液，在110°C烘约5分钟，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫色斑占.检查水分 称取本品内容物2.0 2.2g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶40*25mm中，厚度不超过5mm,照中国药典水分测定法测定,不得过7.0% ; 装量差异 照中国药典胶囊剂装量差异项下测定，取供试品10粒，分别精密称定重量，倾出内容物，硬胶囊囊壳用小刷或其它适宜的用具拭净；分别精密称定囊壳重量；求出每粒内容物的装量；每粒装量与标示量相比较，超出装量差异限度的不得多于2粒,并不得有I粒超出限度一倍；规定本胶囊剂装量差异限度为标示装量的±7.5% ； 崩解时限 照中国药典崩解时限检查法测定，在盐酸溶液9 — 1000中检查2小时，每粒的囊壳均不得有裂缝或崩解现象；将吊篮取出，用少量水洗涤后，每管加入挡板，依法在人工肠液中检查，40分钟内应全部崩解；如有一粒不能完全崩解，应另取6粒复试，均应符合规定；含量测定
抗凝血酶活性测定 取本品装量差异项下的内容物约lg，精密称定，精密加入生理盐水5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100 yl，置试管中，加入含0.5%纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液200 Ul，所述0.5 %纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液是取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.lmol/L盐酸溶液40ml，加水至100ml，即得，pH值7.4 ;摇匀，置37°C缓缓滴加每Iml中含40U的凝血酶溶液，每分钟5 yl，边滴加边轻轻摇匀至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积数，按下式计算:U = C1V1WZc2V2 式中U:每粒含抗凝血酶活性单位； C1:凝血酶溶液的浓度(y/ml)； C2:供试品溶液的浓度(g/ml)； V1:消耗凝血酶溶液的体积(y I); V2:供试品溶液的加入量(ill); W:平均装量； 中和一个国际单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位； 本品每粒含抗凝血酶活性应为11.9 16.1U ； 氨基酸含量测定 色谱条件:0DS色谱柱4.6mmX 250mm, 5um ;流动相A相:0.02mol L—1醋酸钾溶液，加四氢呋喃2.85iU ;所述0.02mol L—1的醋酸钾溶液是由三乙醇胺与1.5%冰醋酸溶液调至pH7.2 ；B相:pH7.2的0.1mol L—1醋酸钾溶液:甲醇:乙腈=200: 200: 200 ;梯度洗脱:0 15min, 100% A 相，15 16min,40% A 相-60% B 相，16 30minl00% B 相；波长:初始 338nm, 16.5min 时 262nm ;流速:Iml mirf1 ;柱温:20 25°C ； 供试品溶液的制备:取4粒脉血康胶囊去壳，精密称取内容物粉末1.0gJP 0.9%生理盐水50ml浸泡24h，匀浆，以3000r min离心lOmin，收集上清液；所余沉淀再以30ml乙醇60°C回流2次，每次30min，合并提取液，滤过，挥去乙醇至无醇味，放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液；精密量取脉血康胶囊提取液50 Ul置于有盖小瓶，加含I %苯酚的6mol -r1盐酸200iU，冲氮气lmin，压盖后置于恒温反应器中，110°C反应20h，取出后加入40%氢氧化钾溶液120iil，涡旋8 lOmin，滤过，取续滤液作为供试品溶液； 对照品溶液的制备:精密量取氨基酸标准品2ml，无需做任何处理，直接进样； 测定法:分别取待测供试品溶液和对照品溶液各5iU，置于自动进样瓶中，进样测定，即得； 多糖含量测定 供试品溶液的制备:取胶囊内容物粉末2.0g，精密称定，置于索式提取器中，加入60 900C的石油醚120ml回流提取8h，弃取石油醚，残渣挥干石油醚，再置于圆底烧瓶中，加蒸馏水50ml回流提取3次，每次lh，合并提取液，滤过，滤液浓缩至50ml，加氯仿50ml萃取3次，取上清液置于IOOml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置冰箱内备用； 对照品溶液的制备:精密称定葡萄糖对照品0.0035g，加蒸馏水溶解，定容于25ml量瓶中，即得浓度为0.140mg mr1的葡萄糖对照品溶液； 测定法:分别量取对照品溶液和样品供试液0.5ml于试管中，加蒸馏水1ml，精密加入苯酹1.0ml,迅速加入浓硫酸5.0ml摇勻，冷却至室温；同法制备空白溶液，置于沸水加入15min，冷却；在48 7nm处测定吸收度值，即得。
全文摘要
本发明公开了一种脉血康胶囊的检测方法，它是由鲜水蛭粉碎后填充胶囊而得；所述检测方法提供了脉血康胶囊中氨基酸和多糖的含量测定方法，弥补了现有技术中单一的抗凝血酶活性测定含量测定方法，所述检测方法准确，灵敏度高，重复性好，能够有效控制脉血康胶囊的质量。
文档编号G01N21/31GK103076405SQ20121054411
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者张观福 申请人:贵州信邦制药股份有限公司