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脉血康胶囊的检测方法

时间:2025-05-17    作者: 管理员

专利名称:脉血康胶囊的检测方法
技术领域
本发明涉及一种脉血康胶囊的检测方法,属于药品技术的领域。
背景技术
被成为“富贵病”的“三高症”是心脏血管和脑血管的疾病统称。心脑血管疾病严重威胁人类健康,当今已成为50岁以上中老年人的常见病,具有关调查显示,我国心脑血管疾病患者已超过2.7亿人,尽管现代医学的快速发展,但我国每年死于心脑血管疾病近300万人。现代医学研究表明,引起心脑血管疾病发病原因是血液粘稠、高血压以及不良的生活习惯等等;另外,诸多因素导致的血瘀经闭、跌打损伤所引起的血瘀、疼痛均严重影响现人们的正常生活。脉血康胶囊是一种以水蛭制成的用于血瘀经闭、跌打损伤和心脑血管疾病的胶囊制剂,具有破血、逐瘀、通脉止痛的功效,临床上已经取得良好疗效。脉血康胶囊是维护人类健康的重要药物之一;为此,脉血康胶囊的质量极其重要,尤其是其中有效成分的控制,该环节关系到产品的各个方面乃至患者的健康。目前,脉血康胶囊已有成分控制只限于抗凝血酶活性的测定,存在一定的片面性。为确保临床药效,客观、有效、全面地对脉血康胶囊的质量进行控制,本发明提供了一种脉血康胶囊的检测方法
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种脉血康胶囊的检测方法。所述检测方法准确,重复性好。为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案实现:所述脉血康胶囊由鲜水蛭粉碎后填充胶囊而得。具体地说,由鲜水蛭,在-10°C -15°C下冷冻,取出捣碎,40°C 50°C、-0.1MPa干燥,粉碎,过筛,装入肠溶胶囊,即得。所述脉血康胶囊的检测方法包括包括对氨基酸和多糖的含量测定。其中,氨基酸的含量测定方法为:采用高效液相色谱法测定:色谱条件:0DS色谱柱4.6mmX 250mm, 5 ii m ;流动相A相:0.02mol L4醋酸钾溶液,加四氢呋喃2.85iU ;所述0.02mol L—1的醋酸钾溶液是由三乙醇胺与1.5%冰醋酸溶液调至pH7.2 ;B相:pH7.2的0.1mol L—1醋酸钾溶液:甲醇:乙腈=200: 200: 200 ;梯度洗脱:0 15min,100% A 相,15 16min,40% A 相-60% B 相,16 30minl00% B 相;波长:初始 338nm, 16.5min 时 262nm ;流速:1ml mirf1 ;柱温:20 25°C ;供试品溶液的制备:取4粒脉血康胶囊去壳,精密称取内容物粉末1.0gJp 0.9%生理盐水50ml浸泡24h,匀浆,以3000r - min离心lOmin,收集上清液;所余沉淀再以30ml乙醇60°C回流2次,每次30min,合并提取液,滤过,挥去乙醇至无醇味,放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液;精密量取脉血康胶囊提取液50 Ul置于有盖小瓶,加含I %苯酚的6mol L—1盐酸200iU,冲氮气lmin,压盖后置于恒温反应器中,110°C反应20h,取出后加入40%氢氧化钾溶液120iU,涡旋8 lOmin,滤过,取续滤液作为供试品溶液;
对照品溶液的制备:精密量取氨基酸标准品2ml,无需做任何处理,直接进样;测定法:分别取待测供试品溶液和对照品溶液各5iU,置于自动进样瓶中,进样测定,即得。所述多糖的含量测定方法为:采用分光光度法测定:供试品溶液的制备:取胶囊内容物粉末2.0g,精密称定,置于索式提取器中,加入60 90°C的石油醚120ml回流提取8h,弃取石油醚,残渣挥干石油醚,再置于圆底烧瓶中,加蒸馏水50ml回流提取3次,每次lh,合并提取液,滤过,滤液浓缩至50ml,加氯仿50ml萃取3次,取上清液置于IOOml量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀,放置冰箱内备用;对照品溶液的制备:精密称定葡萄糖对照品0.0035g,加蒸馏水溶解,定容于25ml量瓶中,即得浓度为0.140mg mr1的葡萄糖对照品溶液;测定法:分别量取对照品溶液和样品供试液0.5ml于试管中,加蒸馏水1ml,精密加入苯酹1.0ml,迅速加入浓硫酸5.0ml摇勻,冷却至室温;同法制备空白溶液,置于沸水加A 15min,冷却;在487nm处测定吸收度值,即得。具体地说,所述脉血康胶囊的检测方法为:性状本品为肠溶胶囊 剂,内容物为灰黄色至灰褐色颗粒或粉末;气微腥,味微咸。鉴别取本品内容物2g,加生理盐水10ml,充分搅匀,浸溃30分钟,滤过,滤液作为供试品溶液;另取水蛭对照药材2g,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》一部附录VI B)试验,吸取上述两种溶液各lul,分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上,以正丁醇-冰醋酸-乙醇-水(4: I: I: 2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以0.5%茚三酮溶液,在110°C烘约5分钟。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的紫色斑点。检查水分称取本品内容物2.0 2.2g,平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶(40*25mm)中,厚度不超过5_,照水分测定法(《中国药典》一部附录IX H第一法)测定,不得过7.0%。装量差异照胶囊剂装量差异项下(《中国药典》一部附录IL)测定,取供试品10粒,分别精密称定重量,倾出内容物(不得损失囊壳),硬胶囊囊壳用小刷或其它适宜的用具拭净。分别精密称定囊壳重量。求出每粒内容物的装量。每粒装量与标示量相比较,超出装量差异限度的不得多于2粒,并不得有I粒超出限度一倍。规定本胶囊剂装量差异限度为标示装量的±7.5%。崩解时限照崩解时限检查法(《中国药典》一部附录XD A)测定,在盐酸溶液(9 — 1000)中检查2小时,每粒的囊壳均不得有裂缝或崩解现象;将吊篮取出,用少量水洗涤后,每管加入挡板,依法在人工肠液中检查,40分钟内应全部崩解。如有一粒不能完全崩解,应另取6粒复试,均应符合规定。含量测定
抗凝血酶活性测定取本品装量差异项下的内容物约lg,精密称定,精密加入生理盐水5ml,充分搅拌,浸提30分钟,并时时振摇,离心,精密量取上清液100 u 1,置试管中,加入含0.5 %纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.lmol/L盐酸溶液40ml,加水至100ml,即得,pH值7.4。) 200 yl,摇匀,置37°C缓缓滴加每Iml中含40U的凝血酶溶液(每分钟5 V-1,边滴加边轻轻摇勻)至凝固,记录消耗凝血酶溶液的体积数,按下式计算:U = C1V1WZC2V2式中U:每粒含抗凝血酶活性单位;C1:凝血酶溶液的浓度/ml);C2:供试品溶液的浓度(g/ml);V1:消耗凝血酶溶液的体积(Ul);V2:供试品溶液的加入量(Ul);W:平均装量; 中和一个国际单位的凝血酶的量,为一个抗凝血酶活性单位。本品每粒含抗凝血酶活性应为11.9 16.1U。氨基酸含量测定色谱条件:0DS色谱柱(4.6mmX 250mm, 5 u m);流动相A相:0.02mol吨―1醋酸钾溶液(三乙醇胺与1.5%冰醋酸溶液调至pH7.2),加四氢呋喃2.85iU,B相:0.1mol.L—1醋酸钾溶液(PH7.2)-甲醇-乙腈(200: 200: 200);梯度洗脱:0 15min,100% A相,15 16min,40% A 相-60% B 相,16 30minl00% B 相;波长:初始 338nm, 16.5min 时 262nm ;流速:lml mirT1 ;柱温:20 25。。。供试品溶液的制备:取4粒脉血康胶囊去壳,精密称取内容物粉末1.0gJP 0.9%生理盐水50ml浸泡24h,匀浆,以3000r - min离心lOmin,收集上清液;所余沉淀再以30ml乙醇60°C回流2次,每次30min,合并提取液,滤过,挥去乙醇至无醇味,放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液;精密量取脉血康胶囊提取液50 Ul置于有盖小瓶,加含I %苯酚的6mol L—1盐酸200iU,冲氮气lmin,压盖后置于恒温反应器中,110°C反应20h,取出后加入40%氢氧化钾溶液120iU,涡旋8 lOmin,滤过,取续滤液作为供试品溶液。对照品溶液的制备:精密量取氨基酸标准品2ml,无需做任何处理,直接进样。测定法:分别取待测供试品溶液和对照品溶液各5iU,置于自动进样瓶中,进样测定,即得。多糖含量测定脉血康胶囊供试品溶液的制备:取胶囊内容物粉末2.0g,精密称定,置于索式提取器中,加入石油醚(60 90°C ) 120ml回流提取8h,弃取石油醚,残渣挥干石油醚,再置于圆底烧瓶中,加蒸馏水50ml回流提取3次,每次lh,合并提取液,滤过,滤液浓缩至50ml,力口氯仿50ml萃取3次,取上清液置于IOOml量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀,放置冰箱内备用;对照品溶液的制备:精密称定葡萄糖对照品约0.0035g,加蒸馏水溶解,定容于25ml量瓶中,即得浓度为0.140mg mF1的葡萄糖对照品溶液;测定法:分别量取葡萄糖对照品溶液和样品供试液0.5ml于试管中,加蒸馏水Iml,精密加入苯酹1.0ml,迅速加入浓硫酸5.0ml摇勻,冷却至室温;同法制备空白溶液,置于沸水加入15min,冷却;在487nm处测定吸收度值,即得。以下是本发明所述检测方法的研究实验例1:脉血康胶囊中氨基酸的含量测定研究I仪器与试药1.1仪器:1100型高效液相色谱仪,G1313A紫外检测器和自动进样系统,Agilent工作站(Agilent公司生产)。1.2试药:脉血康胶囊;混合氨基酸标品(Agilent公司,批号114580/1,含量 Mg mr1 分别为 Ser0.10509,Asp0.13311,Glu0.14713,His0.20963,Gly0.07507,Thr0.1192,Arg0.1742,Ala0.0891,Tyr0.018119,Pro0.11513,Cys0.12015,Val0.11715,Phe0.16519,Ile0.13118,Leu0.13118,Lys0.18265,Met0.13921);硼酸缓冲液、邻苯二甲醛、9-芴基甲基氯甲酸酯(色谱纯,Agilent公司);乙醇、甲醇、乙腈、三乙醇胺(色谱纯,美国天地)。2方法与结果2.1 色谱条件:0DS 色谱柱(4.6mmX 250mm, 5 u m);流动相 A 相:0.02mol *L_1 醋酸钾溶液(三乙醇胺与1.5%冰醋酸溶液调至pH7.2),加四氢呋喃2.85 u:0.1mol.L—1醋酸钾溶液(pH7.2)-甲醇-乙腈(200: 200: 200);梯度洗脱:0 15min,100% A相,15 16min,40 % A 相-60 % B 相,16 30minl00 % B 相;波长:初始 338nm,16.5min 时262nm ;流速:1ml mirT1 ;柱温:20 25。。。2.2溶液配置脉血康胶囊提取液的制备:取4粒脉血康胶囊去壳,精密称取内容物粉末1.0g,加0.9%生理盐水50ml浸泡24h,匀浆,以3000r -min离心lOmin,收集上清液;所余沉淀再以30ml乙醇60°C回流2次,每次30min,合并提取液,滤过,挥去乙醇至无醇味,放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液。供试品溶液:精密量取脉血康胶囊提取液50iU置于有盖小瓶,加含1%苯酚的6mol -r1盐酸200iU,冲氮气lmin,压盖后置于恒温反应器中,110°C反应20h,取出后加入40%氢氧化钾溶液120iil,涡旋8 lOmin,滤过,取续滤液作为供试品溶液。氨基酸标准品溶液:精密量取氨基酸标准品2ml,无需做任何处理,直接进样。2.3测定法:分别取待测供试品溶液和氨基酸标准品溶液各5 yl,置于自动进样瓶中,进样测定。2.4系统适应性考察:取氨基酸标准品溶液按2.3项下操作后进样,得17种氨基酸的理论塔板数均大于16000,峰的分离度>1.5。

2.5线性关系考察:分别精密吸取氨基酸标准品溶液(0.0210mg/ml)2、4、6、8、10 yl,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定,以峰面积积分值(Y)为纵坐标,氨基酸标准品进样量(X)为横坐标,得回归方程为:Y=3*107X-9128.7,r=0.9998,结果见表1、

图1。表I氨基酸标准品峰面积积分值与进样量关系
权利要求
1.一种脉血康胶囊的检测方法,其特征在于:所述脉血康胶囊由鲜水蛭粉碎后填充胶囊而得;所述检测方法包括对氨基酸和多糖的含量测定,其中,氨基酸的含量测定方法为:采用高效液相色谱法测定: 色谱条件:ODS色谱柱4.6mm X 250mm,5um ;流动相A相:0.02mol L—1醋酸钾溶液,加四氢呋喃2.85iU ;所述0.02mol L—1的醋酸钾溶液是由三乙醇胺与1.5%冰醋酸溶液调至pH7.2 ;B相:pH7.2的0.1mol L—1醋酸钾溶液:甲醇:乙腈=200: 200: 200 ;梯度洗脱:0 15min, 100% A 相,15 16min,40% A 相-60% B 相,16 30minl00% B 相;波长:初始 338nm, 16.5min 时 262nm ;流速:Iml mirf1 ;柱温:20 25°C ; 供试品溶液的制备:取4粒脉血康胶囊去壳,精密称取内容物粉末1.0gJP 0.9%生理盐水50ml浸泡24h,匀浆,以3000r min离心lOmin,收集上清液;所余沉淀再以30ml乙醇60°C回流2次,每次30min,合并提取液,滤过,挥去乙醇至无醇味,放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液;精密量取脉血康胶囊提取液50 Ul置于有盖小瓶,加含I %苯酚的6mol -r1盐酸200iU,冲氮气lmin,压盖后置于恒温反应器中,110°C反应20h,取出后加入40%氢氧化钾溶液120iil,涡旋8 lOmin,滤过,取续滤液作为供试品溶液; 对照品溶液的制备:精密量取氨基酸标准品2ml,无需做任何处理,直接进样; 测定法:分别取待测供试品溶液和对照品溶液各5iU,置于自动进样瓶中,进样测定,即得。
2.如权利要求1所述脉血康胶囊的检测方法,其特征在于:所述多糖的含量测定方法为:采用分光光度法测定: 供试品溶液的制备:取胶囊内容物粉末2.0g,精密称定,置于索式提取器中,加入60 900C的石油醚120ml回流提取8h,弃取石油醚,残渣挥干石油醚,再置于圆底烧瓶中,加蒸馏水50ml回流提取3次,每次 lh,合并提取液,滤过,滤液浓缩至50ml,加氯仿50ml萃取3次,取上清液置于IOOml量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀,放置冰箱内备用; 对照品溶液的制备:精密称定葡萄糖对照品0.0035g,加蒸馏水溶解,定容于25ml量瓶中,即得浓度为0.140mg mr1的葡萄糖对照品溶液; 测定法:分别量取对照品溶液和样品供试液0.5ml于试管中,加蒸馏水1ml,精密加入苯酹1.0ml,迅速加入浓硫酸5.0ml摇勻,冷却至室温;同法制备空白溶液,置于沸水加入15min,冷却;在487nm处测定吸收度值,即得。
3.如权利要求1或2所述脉血康胶囊的检测方法,其特征在于: 性状
本品为肠溶胶囊剂,内容物为灰黄色至灰褐色颗粒或粉末;气微腥,味微咸; 鉴别
取本品内容物2g,加生理盐水10ml,充分搅匀,浸溃30分钟,滤过,滤液作为供试品溶液;另取水蛭对照药材2g,同法制成对照药材溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各Iu 1,分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上,以正丁醇-冰醋酸:乙醇:水=4: I: I: 2为展开剂,展开,取出,晾干,喷以0.5%茚三酮溶液,在110°C烘约5分钟,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的紫色斑占.检查水分 称取本品内容物2.0 2.2g,平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶40*25mm中,厚度不超过5mm,照中国药典水分测定法测定,不得过7.0% ; 装量差异 照中国药典胶囊剂装量差异项下测定,取供试品10粒,分别精密称定重量,倾出内容物,硬胶囊囊壳用小刷或其它适宜的用具拭净;分别精密称定囊壳重量;求出每粒内容物的装量;每粒装量与标示量相比较,超出装量差异限度的不得多于2粒,并不得有I粒超出限度一倍;规定本胶囊剂装量差异限度为标示装量的±7.5% ; 崩解时限 照中国药典崩解时限检查法测定,在盐酸溶液9 — 1000中检查2小时,每粒的囊壳均不得有裂缝或崩解现象;将吊篮取出,用少量水洗涤后,每管加入挡板,依法在人工肠液中检查,40分钟内应全部崩解;如有一粒不能完全崩解,应另取6粒复试,均应符合规定;含量测定
抗凝血酶活性测定 取本品装量差异项下的内容物约lg,精密称定,精密加入生理盐水5ml,充分搅拌,浸提30分钟,并时时振摇,离心,精密量取上清液100 yl,置试管中,加入含0.5%纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液200 Ul,所述0.5 %纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液是取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.lmol/L盐酸溶液40ml,加水至100ml,即得,pH值7.4 ;摇匀,置37°C缓缓滴加每Iml中含40U的凝血酶溶液,每分钟5 yl,边滴加边轻轻摇匀至凝固,记录消耗凝血酶溶液的体积数,按下式计算:U = C1V1WZc2V2 式中U:每粒含抗凝血酶活性单位; C1:凝血酶溶液的浓度(y/ml); C2:供试品溶液的浓度(g/ml); V1:消耗凝血酶溶液的体积(y I); V2:供试品溶液的加入量(ill); W:平均装量; 中和一个国际单位的凝血酶的量,为一个抗凝血酶活性单位; 本品每粒含抗凝血酶活性应为11.9 16.1U ; 氨基酸含量测定 色谱条件:0DS色谱柱4.6mmX 250mm, 5um ;流动相A相:0.02mol L—1醋酸钾溶液,加四氢呋喃2.85iU ;所述0.02mol L—1的醋酸钾溶液是由三乙醇胺与1.5%冰醋酸溶液调至pH7.2 ;B相:pH7.2的0.1mol L—1醋酸钾溶液:甲醇:乙腈=200: 200: 200 ;梯度洗脱:0 15min, 100% A 相,15 16min,40% A 相-60% B 相,16 30minl00% B 相;波长:初始 338nm, 16.5min 时 262nm ;流速:Iml mirf1 ;柱温:20 25°C ; 供试品溶液的制备:取4粒脉血康胶囊去壳,精密称取内容物粉末1.0gJP 0.9%生理盐水50ml浸泡24h,匀浆,以3000r min离心lOmin,收集上清液;所余沉淀再以30ml乙醇60°C回流2次,每次30min,合并提取液,滤过,挥去乙醇至无醇味,放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液;精密量取脉血康胶囊提取液50 Ul置于有盖小瓶,加含I %苯酚的6mol -r1盐酸200iU,冲氮气lmin,压盖后置于恒温反应器中,110°C反应20h,取出后加入40%氢氧化钾溶液120iil,涡旋8 lOmin,滤过,取续滤液作为供试品溶液; 对照品溶液的制备:精密量取氨基酸标准品2ml,无需做任何处理,直接进样; 测定法:分别取待测供试品溶液和对照品溶液各5iU,置于自动进样瓶中,进样测定,即得; 多糖含量测定 供试品溶液的制备:取胶囊内容物粉末2.0g,精密称定,置于索式提取器中,加入60 900C的石油醚120ml回流提取8h,弃取石油醚,残渣挥干石油醚,再置于圆底烧瓶中,加蒸馏水50ml回流提取3次,每次lh,合并提取液,滤过,滤液浓缩至50ml,加氯仿50ml萃取3次,取上清液置于IOOml量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀,放置冰箱内备用; 对照品溶液的制备:精密称定葡萄糖对照品0.0035g,加蒸馏水溶解,定容于25ml量瓶中,即得浓度为0.140mg mr1的葡萄糖对照品溶液; 测定法:分别量取对照品溶液和样品供试液0.5ml于试管中,加蒸馏水1ml,精密加入苯酹1.0ml,迅速加入浓硫酸5.0ml摇勻,冷却至室温;同法制备空白溶液,置于沸水加入15min,冷却;在48 7nm处测定吸收度值,即得。
全文摘要
本发明公开了一种脉血康胶囊的检测方法,它是由鲜水蛭粉碎后填充胶囊而得;所述检测方法提供了脉血康胶囊中氨基酸和多糖的含量测定方法,弥补了现有技术中单一的抗凝血酶活性测定含量测定方法,所述检测方法准确,灵敏度高,重复性好,能够有效控制脉血康胶囊的质量。
文档编号G01N21/31GK103076405SQ20121054411
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者张观福 申请人:贵州信邦制药股份有限公司

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