专利名称：Dcf1基因和tmem59l基因的特异性相互作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及DCFl基因和TMEM59L基因的特异性相互作用。特别是DCFl基因和TMEM59L基因的相互作用在抑制APP蛋白、⑶11蛋白或⑶12蛋白的运输中的应用。
背景技术：
树突状细胞因子(dendriticcell factor I,DCFl)又名 TMEM59 (transmembraneprotein 59),是I型跨膜蛋白，目前对该蛋白的了解还不是很清楚。2008年Wang, L; etal通过克隆、表达、沉默DCFl基因显示，DCFl的过表达使神经干细胞保持在未分化的状态；沉默DCFl基因，细胞趋于分化成神经元和神经胶质细胞。通过对小鼠神经干细胞的基因芯片分析，揭示了 DCFl的调节网络，推断了 36个基因主要参与DCFl的调节，尤其是ροιι6Π 可能在DCFl的转录和小鼠脑的神经干细胞的分化中起着至关重要的作用，基因网络的分析表明DCFl位于下游的信号转导通路中。最近的研究表明miR-351负调控DCFl的表达，在不同类型的神经相关细胞，说明DCFl的转录调控不仅由传统的转录调控系统如转录因子控制，还可能通过小非编码RNA来调控。迟发性阿尔茨海默氏病(LOAD)的发病机制中存在表观遗传机制的作用，但是从整个基因组的范围来鉴别该疾病位点的研究还很有限。最新的研究表明DCFl在迟发性阿尔茨海默氏病中出现低甲基化现象。而且甲基化参与DCFl的基因转录和蛋白表达。TMEM59L (transmembrane protein 59 like)又称为脑源性特异性膜锚定蛋白，当前关于他的研究十分有限，仅知道它在脑部高特异性表达，参与APP蛋白的糖基化修饰，是一种推测的细胞器定位蛋白。

发明内容
发明目的在于提供DCFl基因和TMEM59L基因的相互作用在抑制APP蛋白、GDIl蛋白或GDI2蛋白的运输中的应用。为达到上述目的，本发明采用的原理为首先构建DCFl、TMEM59L、APP、⑶11、⑶12、BACE2的绿色荧光蛋白标记的表达载体，接着构建DCFl和TMEM59L的pcDNA3. Imyc/hisA(-)表达载体和带有红色荧光标记的表达载体。将DCFl和TMEM59L的绿色荧光蛋白转入U251、C17. 2、4T1、U87、HEK293T等细胞，观察DCFl和TMEM59L的细胞内定位情况。然后将APP、⑶I1、OTI2、BACE2的绿色荧光蛋白标记的融合蛋白表达载体分别和带有DCFl和TMEM59L的pcDNA3. lmyc/hisA (-)表达载体进行共转染实验，通过western blot观察APP、⑶I1、OTI2、BACE2四种蛋白在细胞中的蛋白质水平变化情况。最后通过带有红色荧光标记的DCFl和TMEM59L表达载体分别于APP、⑶II、⑶I2、BACE2的绿色荧光蛋白标记的融合蛋白表达载体进行共转染，观察DCFl和TMEM59L与APP、⑶11、⑶12、BACE2四种蛋白质在细胞中的共定位情况，从而判断DCFl和TMEM59L对蛋白质的特异性作用。本发明旨在发现了 DCFl和TMEM59L过表达情况下，能够高度特异的抑制APP蛋白脱离高尔基体，而部分抑制GDIl和GDI2的运输，对BACE2蛋白的运输没有抑制作用，为诊断和治疗阿尔兹海默症提供了新的药物靶点。


图1为人00 146 融合蛋白转染似51、(17.2、41'1、现7细胞。结果表明，人DCF1-EGFP定位到核周区域和细胞浆中的囊泡状结构。没有发现绿色荧光蛋白在细胞核中。图 2 为鼠 DCFl -EGFP 融合蛋白转染 U251、C17. 2、U87 细胞。在 U251、C17. 2、U87细胞鼠DCF1-EGFP融合蛋白也定位在细胞浆中的泡状结构和核周区域。图3为人TMEM59L在不同细胞内的定位。U251、HEK293T、C17. 2、4T1、U87细胞被瞬时转染pEGFP-N2-hTMEM59L，24小时后，荧光显微镜下观察和照片拍摄。结果显示，hTMEM59L定位在核周区域和细胞浆中，呈圆形囊泡状结构。图4为鼠TMEM59L在不同细胞内的定位。U251、HEK293T、C17. 2、U87细胞被瞬时转染pEGFP-N2-mTMEM59L，mTMEM59L定位在核周区域和细胞浆中，呈圆形囊泡状结构。
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图5为DCFl和TMEM59L在细胞中的共定位。TMEM59L-EGFP和DCFl-DsRed共同表达在U251和C17. 2细胞，结果显示DCFl和TMEM59L能够定位到相同的细胞器结构中。图6为DCFl的亚细胞定位。h-DCFl-EGFP融合蛋白在U251细胞中瞬时表达，用Golgi-Tracker Red和Lyso-Tracker Red细胞器染料分别对U251细胞染色，结果表明DCFl可以和高尔基体及溶酶体重合。h-DCFl-DsRed融合蛋白在U251细胞中瞬时表达，Mito-Tracker Green细胞器染料对U251细胞染色，结果表明DCFl定位的囊泡与线粒体具有明显不同的形态且二者并不重叠在一起。图7为TMEM59L的亚细胞定位。(A)hTMEM59L_EGFP融合蛋白在U251细胞中瞬时表达。用 Golgi-Tracker RecULyso-Tracker RecUand Mito-Tracker Green 三种细胞器染料分别对U251细胞染色。结果表明TMEM59L可以和高尔基体及溶酶体重合，与线粒体具有明显不同的形态。(B)hTMEM59L-EGFP融合蛋白在C17. 2细胞瞬时表达。Lyso-TrackerRed对C17. 2细胞染色，结果表明TMEM59L可以和溶酶体重合。(C) (a_h) C17. 2细胞的活体成像显示hTMEM59L-EGFP形成的绿色荧光颗粒可以在整个细胞中进行往返运输。箭头指细胞突起和包浆中的hTMEM59L，在核周围区域也存在高密度的荧光信号。图8为DCFl和TMEM59L高度抑制APP的运输。(A) HEK293T细胞瞬时转染PEGFP-N2-EGFP-APP 和 pcDNA3. 1-myc/hisA (-)空质粒或 pcDNA3. 1-myc/hisA (-) -DCFI/TMEM59L，结果显示APP和DCF1/TMEM59L共转染时，APP明显被潴留在高尔基体。(B)Westernblot分析表明，DCFl或TMEM59L的过表达明显增加APP蛋白在细胞中水平。(C) APP与DCF1/TMEM59L的共定位被观察通过DCFl/TMEM59L_DsRed和APP-EGFP共转染进HEK293T细胞。hL hTMEM59L ；mL :mTMEM59L。图 9 为 DCFl 和 TMEM59L 增加 GDIl 的蛋白水平。(A) pEGFP_N2-EGFP_GDIl 和pcDNA3. 1-myc/hisA (-)空质粒或 pcDNA3. 1-myc/hisA (-)-DCF1/TMEM59L 瞬时转染 HEK293T细胞，结果显示DCF1/TMEM59L过表达增加⑶11在细胞中的荧光亮度，但⑶11在细胞中的分布并没有发生明显改变，没有出现高尔基体滞留的现象，但是细胞形态趋向收缩变圆。
(B)Westernblotting显示，DCFl或TMEM59L的过表达明显增加⑶Il蛋白在细胞中水平。
(C)⑶11与DCF1/TMEM59L的共定位被观察通过DCFl/TMEM59L_DsRed和OHl-EGFP共转染进 HEK293T 细胞。hL hTMEM59L ；mL :mTMEM59L。图 10 为 DCFl 和 TMEM59L 增加⑶ 12 的蛋白水平。(A) pEGFP-N2_EGFP_GDI2 和pcDNA3. 1-myc/hisA (-)空质粒或 pcDNA3. 1-myc/hisA (-)-DCF1/TMEM59L 瞬时转染 HEK293T细胞，结果显示DCF1/TMEM59L过表达增加⑶12在细胞中的荧光亮度，但⑶12在细胞中的分布并没有发生明显改变，没有出现高尔基体滞留的现象，但是细胞形态趋向变圆。(B)Western blotting显示，DCFl或TMEM59L的过表达明显增加⑶12蛋白在细胞中水平。(C)GDI2与DCF1/TMEM59L的共定位被观察通过DCFl/TMEM59L_DsRed和⑶I2-EGFP共转染进HEK293T 细胞。hL hTMEM59L ；mL :mTMEM59L。图11为DCFl和TMEM59L不影响BACE2的细胞定位和蛋白水平。(A)PEGFP-N2-EGFP-BACE2 和 pcDNA3. 1-myc/hisA (-)空质粒或 pcDNA3. 1-myc/hisA (-)-DCFl/TMEM59L瞬时转染HEK293T细胞，结果显示DCF1/TMEM59L没有改变BACE2在细胞中的定位。(B)Western blotting显示，DCFl或TMEM59L的过表达没有改变BACE2蛋白在细胞中的水平。(C) BACE2 与 DCF1/TMEM59L 的共定位被观察通过 DCFl/TMEM59L_DsRed 和 BACE2-EGFP共转染进 HEK293T 细胞。hL hTMEM59L ；mL :mTMEM59L。
具体实施方式
实施例一载体构建
利用 Olige 6. O 软件分别设计人 DCFMhII DCFUA TMEM59L、鼠 TMEM59L、APP (695)、⑶II、⑶12、BACE2基因的引物，在其上游和下游引物中分别引入酶切位点和保护性碱基，PCR扩增出基因以后，连入各自对应的载体，如表I所示。
权利要求
1.DCFl基因和TMEM59L基因的相互作用在抑制APP蛋白的运输中的应用。
2.DCFl基因和TMEM59L基因的相互作用在抑制⑶11蛋白的运输中的应用。
3.DCFl基因和TMEM59L基因的相互作用在抑制⑶12蛋白的运输中应用。
全文摘要
本发明涉及DCF1基因和TMEM59L基因的特异性相互作用。DCF1和TMEM59L过表达情况下，能够高度特异的抑制APP蛋白脱离高尔基体，而部分抑制GDI1和GDI2的运输，对BACE2蛋白的运输没有抑制作用，为诊断和治疗阿尔兹海默症提供了新的药物靶点。
文档编号G01N33/68GK102776236SQ201210184088
公开日2012年11月14日 申请日期2012年6月6日 优先权日2012年6月6日
发明者文铁桥, 王海烽 申请人:上海大学