专利名称：苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物技术领域，涉及一种病毒的快速检测器具，具体是苹果褪绿叶斑病毒的检测试剂盒。
背景技术：
苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)是严重危害苹果生产的主要病毒之一，广泛分布于苹果种植区。苹果褪绿叶斑病毒侵染严重影响果树产量，导致果树长势衰退，产量锐减，品质下降。为了控制苹果褪绿叶斑病毒的传播及危害，迫切需要快速、灵敏、稳定的检测技术。血清学方法是检测植物病毒的主要方法。传统抗体的制备一般首先提纯病毒粒子，然后免疫动物，再通过单克隆或多克隆抗体技术制备抗体；其存在较多弊端，如一些病毒在寄主体内含量较低，难以提纯获得足够的抗原；还有一些病毒分离提纯困难，不易得到纯化的病毒粒子。苹果褪绿叶斑病毒在果树植株内病毒含量较低，提纯病毒粒子较困难，所以应用传统的提纯病毒粒子的方法难以制备高效价抗体，且检测灵敏度较差。免疫学最新进展显示,在抗原抗体的结合反应中，抗原表位(Epitope),又称抗原决定簇(Antigenicdeterminant),是关键的免疫学因子,它是存在于抗原分子表面的能够决定抗原特异性的数个氨基酸残基组成的特殊序列及其空间结构，是蛋白质抗原性的基础，根据抗原表位区氨基酸序列直接合成多肽，之后免疫动物，即可制备抗病毒多肽的抗体。由于其受其他与抗原表位无关的序列干扰较少，因而制备的抗体效价较高，特异性较强。因此，研制开发以抗苹果褪绿叶斑病毒多肽抗体为主体设计的检测试剂盒，不仅为应用血清学方法检测苹果褪绿叶斑病毒提供了一种效价较高、特异性较强的抗体，而且可以实现有效、灵敏、快捷、简便的检测苹果褪绿叶斑病毒，对苹果病毒病的预防和控制具有重要意义。
发明内容本实用新型的目的是为了解决目前缺乏检测苹果褪绿叶斑病毒的有效器具的问题，而提供一种以抗苹果褪绿叶斑病毒多肽抗体为主体设计的苹果褪绿叶斑病毒的检测试剂盒，可快速、方便、有效地检测出苹果待测样品是否感染苹果褪绿叶斑病毒。本实用新型的目的是这样实现的本设计的苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒包括一个盒体(15)，盒体(15)内装有密封包装的反应板(14)、A蛋白稀释溶液(I)、抗苹果褪绿叶斑病毒多肽抗体(2)、100倍浓缩的稀释缓冲液(3)、提取缓冲液(4)、100倍浓缩的洗涤缓冲液(5)、酶标抗体(6)、NBT/BCIP底物缓冲液(7)、显色液A (8)、显色液B (9)、终止液(10)、苹果褪绿叶斑病毒阳性样品对照(11)、苹果褪绿叶斑病毒阴性样品对照(12)和操作说明书(13);该试剂盒是以抗苹果褪绿叶斑病毒多肽抗体为主体设计的，该抗体效价高、特异性好，盒体内的液体试剂均以小瓶包装。本实用新型的优点与效果[0008]1、灵敏度高，可对无明显症状植株中的病毒进行有效检测。2、操作简单，普通工作人员经过简单培训即可完成。3、可重复性好，检测结果稳定可靠。4、对仪器要求较低，仅需要普通的恒温水浴锅、酶标仪等。5、本实用新型的抗体制备成本低，只有用重组抗原制备抗体成本的十分之一，并且安全可靠性高于重组抗原制备的抗体。6、本实用新型中的抗苹果褪绿叶斑病毒多肽抗体效价高，特异性好，可与苹果褪绿叶斑病毒的外壳蛋白基因原核表达产物及天然的苹果褪绿叶斑病毒阳性植物材料产生免疫反应，为应用血清学方法检测苹果褪绿叶斑病毒提供了有效、实用的抗体，具有良好的应用前景。

图1是苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒的外观主视图。图2是苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒横截面剖视图，即盒内设置的组成及位置示意图。图中，A蛋白稀释溶液(I)、抗苹果褪绿叶斑病毒多肽抗体(2)、100倍浓缩的稀释缓冲液(3)、提取缓冲液(4)、100倍浓缩的洗涤缓冲液(5)、酶标抗体(6)、NBT/BCIP底物缓冲液(7)、显色液A (8)、显色液B (9)、终止液(10)、苹果褪绿叶斑病毒阳性样品对照(11)、苹果褪绿叶斑病毒阴性样品对照(12)和操作说明书(13)、密封包装的反应板(14)和盒体。
具体实施方式
苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒的使用方法如下1、将I号管中的A蛋白稀释溶液加入反应板中，每孔100μ L，37°C孵育2h，倒掉孔中液体后，用蒸馏水将5号管中的洗涤液稀释100倍，然后用其洗涤反应孔3次，每次3min。2、用蒸馏水将3号管中的稀释缓冲液稀释100倍，然后用其稀释2号管中的抗苹果褪绿叶斑病毒多肽抗体，抗体的工作浓度为1: 1000，每孔100μ ，37 孵育2h，洗涤。3、待检抗原样品用4号管中的提取缓冲液1: 5倍(W/V)研磨，8000rpm离心8min，每孔加上清液100 μ L，同时分别在相应孔中加入苹果褪绿叶斑病毒阳性样品对照和苹果褪绿叶斑病毒阴性样品对照，每孔100μ L，4°C过夜，洗涤。4、2号管中的抗苹果褪绿叶斑病毒多肽抗体用3号管中稀释后的缓冲液稀释，抗体的工作浓度为1: 500，每孔100yL，37°C孵育2h，洗涤。5、6号管中酶标抗体用3号管中稀释后的缓冲液稀释，工作浓度1: 1000，每孔100 μ L，37。。孵育 2h，洗涤。6、将8、9号两管中的显色液均以1: 20的比例加入7号管中的底物缓冲液中，配制成底物溶液，然后加入反应板中，每孔100 μ L,室温下遮光放置30min显色。7、加10号管中的反应终止液,每孔25 μ L,目测比色后,利用酶标仪在405nm波长下测定每孔吸光值(OD405值)。8、结果判定I)试验结果同时符合下列条件方为有效两孔阳性对照OD4tl5值平均值彡O. 6 ;阴性对照平均值< O. 25 ；2)临界值的计算临界值上限=(阳性对照孔OD4tl5均值-阴性对照OD4tl5均值)X0. 20+阴性对照OD4tl5平均值；临界值下限=(阳性对照孔OD405均值-阴性对照OD4tl5均值)X0. 15+阴性对照OD405平均值；3)结果判定被检样品OD4tl5平均值<临界值下限，为苹果褪绿叶斑病毒阴性；被检样品OD4tl5平均值>临界值上限，为苹果褪绿叶斑病毒阳性；介于二者之间，判为可疑，应复检，复检OD4tl5平均值>临界值上限(复检时)，判为苹果褪绿叶斑病毒阳性，反之判为阴性。备注试剂盒不使用时，应于2 8°C避光保存，开封后，应在3个月内用完。
权利要求1.苹果褪绿叶斑病毒的检测试剂盒，其特征在于试剂盒包括一个盒体(15)，盒体(15)内装有密封包装的反应板(14)、A蛋白稀释溶液(I)、抗苹果褪绿叶斑病毒多肽抗体(2)、100倍浓缩的稀释缓冲液(3)、提取缓冲液(4)、100倍浓缩的洗涤缓冲液(5)、酶标抗体(6),NBT/BCIP底物缓冲液(7)、显色液A(8)、显色液B (9)、终止液(10)、苹果褪绿叶斑病毒阳性样品对照(11)、苹果褪绿叶斑病毒阴性样品对照(12)和操作说明书(13)，盒体内的液体试剂均以小瓶包装。
专利摘要苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒，它包括一个盒体，盒体内装有密封包装的反应板、A蛋白稀释溶液、抗苹果褪绿叶斑病毒多肽抗体、100倍浓缩的稀释缓冲液、提取缓冲液、100倍浓缩的洗涤缓冲液、酶标抗体、NBT/BCIP底物缓冲液、显色液A、显色液B、终止液、病毒阳性样品对照、病毒阴性样品对照和操作说明书，使用方法见具体实施方式
。该试剂盒是以抗苹果褪绿叶斑病毒多肽抗体为主体设计的，该抗体效价高、特异性好。操作说明书印制了应用A蛋白酶联免疫吸附试验方法检测苹果褪绿叶斑病毒的操作步骤和判定标准。本试剂盒实现了对苹果褪绿叶斑病毒快速、简便、灵敏的检测，易于大规模应用。
文档编号G01N33/569GK202903797SQ20122061298
公开日2013年4月24日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者李丽丽 申请人:黑龙江省林业科学研究所