专利名称：莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条及制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于食品安全检验领域，涉及一种莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条及制备与应用。
背景技术：
莱克多巴胺(RAC)和克伦特罗(CL)同属兴奋剂类药物，能够加强心脏收缩、扩张骨骼肌血管和支气管平滑肌，兽医学和医学上用于治疗休克和支气管痉挛。由于这两种药物能促进动物骨骼肌增生，一些养殖户非法将其用作饲料添加剂，以提高禽畜产品的瘦肉率，增加经济效益。我国已明令禁止生产、销售和使用这两种物质。莱克多巴胺(RAC)和克伦特罗(CL)被动物摄入后会残留于动物的肌肉、肝、肺组织中，人食用这些组织后会出现一系列的毒副反应，如血压升高、血管扩张、心跳加快、呼吸加剧、体温升高、肌肉颤抖，头痛、晕眩、神经过敏、肌肉痛疼、心悸、恶心、呕吐等症状，特别是对高血压、心脏病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，严重的可导致死亡，孕妇中毒可导致癌变、胎儿致畸。 荧光微球标记层析检测技术是继胶体金标记技术以后，在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结合，它与胶体金标记层析技术一样具有快速、稳定、操作简便等优点。突光微球标记层析技术是将不同粒径的突光微球与含有氨基、羧基、轻基、巯基的生物大分子物质结合，当荧光微球标记的蛋白质(抗原/抗体)被包被在硝酸纤维素膜上的抗原/抗体捕获时，荧光微球在相应的区域内聚集，在一定波长范围的激发光照射下，发出特定颜色的可见光，从而被人眼或者仪器识别。目前国内外检测莱克多巴胺(RAC)、克伦特罗(CL)的主要方法有高效液相色谱法(HLCP)、液相色谱-质谱联用法(LC-MC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MC)、酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析技术。这些方法都存在着不同程度的缺陷。高效液相色谱法(HLCP )、液相色谱-质谱联用法(LC-MC)、气相色谱质谱联用法(GC-MC)属理化检测方法，这几种方法灵敏度高、特异性好，但操作复杂、样品前处理过程较长、检测设备昂贵且需要专业的操作人员。酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析技术属免疫学检测技术，ELISA方法检测灵敏度较高，有许多加样和洗涤步骤，流程相对繁琐和耗时，显色所用的底物有致癌性，读值所用的酶标仪价格也相对昂贵；胶体金免疫层析技术操作简便、快速，但灵敏度低，只适合大量样品的初筛且要接触重金属离子。相比上述检测方法，荧光微球标记层析检测技术同时具有检测灵敏度高、操作简便的优点。

发明内容
为了克服以上现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条。本发明的另一目的在于提供所述的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条的制备方法。本发明的再一目的在于提供所述的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条的应用。本发明的目的通过以下技术方案实现一种莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条，包含附着于底板上且依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，结合垫上含有荧光聚苯乙烯微球标记蛋白；层析膜上设置有两条检测线和一条质控线，检测线靠近结合垫，质控线靠近吸水垫；一条检测线上包被有莱克多巴胺蛋白质偶联物，另一条检测线上包被有克伦特罗蛋白质偶联物，质控线上包被有能与荧光聚苯乙烯微球标记蛋白中的蛋白结合且不和莱克多巴胺和克伦特罗结合的蛋白偶联物；荧光聚苯乙烯微球标记蛋白为荧光聚苯乙烯微球标记的莱克多巴胺单克隆抗体和荧光聚苯乙烯微球标记的克伦特罗单克隆抗体；所述的样品吸收垫的材质优选为玻璃纤维膜； 所述的结合垫的材质优选为聚酯膜；所述的层析膜的材质优选为硝酸纤维素膜；所述的吸水垫的材质优选为吸水纸；所述的质控线优选由羊抗鼠免疫球蛋白G溶液制备得到；所述的荧光聚苯乙烯微球标记蛋白优选通过如下方法制备得到(I)荧光聚苯乙烯微球的活化将荧光聚苯乙烯微球分散于吐温-20水溶液中，得到荧光聚苯乙烯微球悬液，离心，收集沉淀；沉淀用4-吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液溶解后，加入I-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混匀后反应30 60min，离心洗涤沉淀，再用MES缓冲液溶解沉淀，得到活化后的荧光聚苯乙烯微球悬液；其中，I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与荧光聚苯乙烯微球按30 50mg/ (I. 5 X IO11个)配比；N_羟基琥珀酰亚胺与荧光聚苯乙烯微球按20 30mg/ (I. 5X IO11 个)配比；(2)荧光聚苯乙烯微球标记蛋白溶液的制备将莱克多巴胺单克隆抗体和克伦特罗单克隆抗体加入到步骤(I)制备的活化后的荧光聚苯乙烯微球悬液中，混匀后搅拌反应I 3h ;接着加入甘氨酸，搅拌反应O. 5 2h，离心洗涤，沉淀用封闭溶液溶解后进行超声处理，得到封闭后的荧光微球标记抗体悬液；步骤(I)中所述的荧光聚苯乙烯微球的直径为50 200nm ;优选的直径为130nm ；步骤(I)中所述的吐温-20水溶液的浓度优选为体积百分比O. 5% ；步骤(I)中所述离心的条件优选为12000 13000rpm离心15 30min ；步骤(I)中所述的4-吗啉乙磺酸缓冲液优选为O. 1Μ、ρΗ值为5. 5的4_吗啉乙磺酸缓冲液；步骤(I)中所述的所述离心洗涤沉淀的次数为2 3次，离心转速为10000 IlOOOrpm,每次离心I 2min ；步骤(2)中所述的莱克多巴胺单克隆抗体与所述的荧光聚苯乙烯微球按质量比20 IOOyg/ (I. 5 X IO11 个)配比，优选为 60 μ g/ (I. 5 X IO11 个)配比;步骤(2)中所述的克伦特罗单克隆抗体与所述的荧光聚苯乙烯微球按质量比20 IOOyg/ (I. 5 X IO11 个)配比，优选为 60 μ g/ (I. 5 X IO11 个)配比;
步骤(2)中所述的甘氨酸的作用为通过甘氨酸的氨基将荧光聚苯乙烯微球上的羧基封闭住；用量优选为每I. 5 X IO11个荧光聚苯乙烯微球使用O. 01 O. 03mol甘氨酸；步骤(2)中所述的离心洗涤的次数为2 3次，离心转速为7000 9000rpm，每次离心I 2min ；步骤(2)中所述的封闭溶液为含40 60% (w/v)鹿糖、I 2% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)和I 2% (v/v)吐温-20 (Tween-20)的磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液的浓度为O. 015M, pH 值为 7. 4 ；步骤(2)中所述的超声处理的条件为100W、2 4min ；所述的莱克多巴胺蛋白质偶联物是将莱克多巴胺偶联到蛋白质得到的，其中的蛋白质不参与反应；优选可通过N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺的作用，将莱克多巴胺偶联到蛋白上；
所述的蛋白优选为牛血清白蛋白；所述的莱克多巴胺蛋白质偶联物更优选通过包含如下步骤的方法得到I)将盐酸莱克多巴胺和琥珀酸酐溶于无水吡啶中，搅拌反应后干燥，得到衍生物；2)将衍生物溶解于N，N’ - 二甲基甲酰胺(DMF)中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)搅拌条件下反应过夜；离心，取上清；3)将步骤2)得到的上清滴加入2 8°C预冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C搅拌反应过夜，2 8°C离心，取上清，将上清置于磷酸盐缓冲液中于2 8°C透析，得到莱克多巴胺蛋白质偶联物；其中，盐酸莱克多巴胺、琥珀酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺和牛血清白蛋白按质量比50 15 11 :20 250进行配比；所述的牛血清白蛋白溶液为将牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液得到；所述的磷酸盐缓冲液的浓度为O. 015M，pH值为7. 4 ;步骤I)中所述的搅拌反应的时间优选为24h ；步骤2)中所述的离心的转速优选为IOOOrpm ；步骤3)中所述的磷酸盐缓冲液的浓度为O. 015M，pH值为7. 4 ;步骤3)中所述的透析的时间优选为2 4天；所述的克伦特罗蛋白质偶联物是将克伦特罗偶联到蛋白质得到的，其中的蛋白质不参与反应；所述的克伦特罗蛋白质偶联物更优选通过包含如下步骤的方法得到①将盐酸克伦特罗溶于盐酸溶液中，预冷至2 8°C后加入亚硝酸钠溶液进行反应，一边加入亚硝酸钠溶液，一边用淀粉碘化钾试纸检测，当淀粉碘化钾试纸显示为棕紫色，停止加入亚硝酸钠溶液，加入尿素终止反应，得到淡黄色的溶液A ；②将步骤①制备的溶液A滴加入2 8°C预冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C搅拌反应过夜，得到橙黄色的溶液B ；③将步骤②制备的溶液B置于磷酸盐缓冲液中于2 8°C透析，得到克伦特罗蛋白质偶联物；盐酸克伦特罗与牛血清白蛋白按质量比1:4 1:6进行配比，更优选为按质量比1:5配比；步骤①中所述的盐酸溶液的浓度优选为O. 28 O. 29mol/L ；步骤②中所述的牛血清白蛋白溶液为将牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液得到；所述的磷酸盐缓冲液的浓度为O. 015M，pH值为7. 4 ;步骤③中所述的磷酸盐缓冲液的浓度为O. 015M，pH值为7. 4 ；一种莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试卡，含有上述莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条和外壳；外壳包裹住所述的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条，其中在外壳上开有加样孔和观察孔，加样孔正对着莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条的样品吸收垫，观察孔正对着莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条的检测线Tl、检测线T2和质控线C所在区域；
所述的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条的制备方法，包括以下操作步骤I、莱克多巴胺蛋白质偶联物的制备将盐酸莱克多巴胺和琥珀酸酐溶于无水吡啶中，搅拌反应后干燥，得到衍生物；将衍生物溶解于N，N’ - 二甲基甲酰胺(DMF)中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)搅拌条件下反应过夜；离心，取上清A ；将上清A滴加入2 8°C预冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C搅拌反应过夜，2 8°C离心，取上清B，将上清B置于磷酸盐缓冲液中于2 8°C透析，得到莱克多巴胺蛋白质偶联物；其中，盐酸莱克多巴胺、琥珀酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺和牛血清白蛋白按质量比50 15 11 :20 250进行配比；II、克伦特罗蛋白质偶联物的制备将盐酸克伦特罗溶于盐酸溶液中，预冷至2 8°C后加入亚硝酸钠溶液进行反应，一边加入亚硝酸钠溶液，一边用淀粉碘化钾试纸检测，当淀粉碘化钾试纸显示为棕紫色，停止加入亚硝酸钠溶液，加入尿素终止反应，得到淡黄色的溶液A ;将溶液A滴加入2 8°C预冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C搅拌反应过夜，得到橙黄色的溶液B ;将溶液B置于磷酸盐缓冲液中于2 8°C透析，得到克伦特罗蛋白质偶联物；其中，盐酸克伦特罗与牛血清白蛋白按质量比1:4 1:6进行配比；III、荧光聚苯乙烯微球标记蛋白的制备(I)荧光聚苯乙烯微球的活化将荧光聚苯乙烯微球分散于吐温-20水溶液中，得到荧光聚苯乙烯微球悬液，离心，收集沉淀；沉淀用4-吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液溶解后，加入I-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混匀后反应30 60min，离心洗涤沉淀，再用MES缓冲液溶解沉淀，得到活化后的荧光聚苯乙烯微球悬液；其中，I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与荧光聚苯乙烯微球按30 50mg/ (I. 5 X IO11个)配比；N_羟基琥珀酰亚胺与荧光聚苯乙烯微球按20 30mg/ (I. 5X IO11 个)配比；(2)荧光聚苯乙烯微球标记蛋白溶液的制备将莱克多巴胺单克隆抗体和克伦特罗单克隆抗体加入到步骤(I)制备的活化后的荧光聚苯乙烯微球悬液中，混匀后搅拌反应I 3h ;接着加入甘氨酸，搅拌反应O. 5 2h，离心洗涤，沉淀用封闭溶液溶解后进行超声处理，得到封闭后的荧光微球标记抗体悬液；IV、含有荧光微球标记蛋白的聚酯膜的制备在聚酯膜上均匀喷涂步骤III制备的封闭后的荧光微球标记抗体悬液，烘干，得到涂抹荧光微球标记蛋白的聚酯膜；
V、包被抗原或抗体的硝酸纤维素膜的制备将步骤I制备的莱克多巴胺蛋白质偶联物、步骤II制备的克伦特罗蛋白质偶联物、羊抗鼠免疫球蛋白G分别用包被溶液稀释，得到莱克多巴胺蛋白质偶联物溶液、克伦特罗蛋白质偶联物溶液和羊抗鼠免疫球蛋白G溶液，将以上三种溶液依次喷于硝酸纤维素膜上，分别为检测线Tl、检测线T2和质控线C，检测线Tl、检测线T2和质控线C三线间隔同为3_，烘干，得到包被后的硝酸纤维素膜；包被溶液的组成如下十二水磷酸氢二钠28. 94g、磷酸二氢钾2. 61g、氯化钠8. 0g、氯化钾O. 2g、二乙烯三胺五乙酸O. 06g,蒸懼水定容至IOOOml ；VI、试纸条的制备首先，在底板的中心黏贴上层析膜，即步骤V制备的包被抗原或抗体的硝酸纤维素膜；在层析膜靠近质控线C的一端搭接黏贴上吸水垫；在层析膜的另一端搭接黏贴上结合垫，即步骤IV制备的含有荧光微球标记蛋白的聚酯膜；在结合垫的另一端搭接黏贴上样品吸收垫，得到莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条。步骤I中所述的搅拌反应的时间优选为24h ;所述的离心的转速优选为IOOOrpm ；所述的磷酸盐缓冲液的浓度为O. 015M，pH值为7. 4 ;所述的透析的时间优选为2 4天；
步骤II中所述的盐酸溶液的浓度优选为O. 28 O. 29mol/L ;所述的磷酸盐缓冲液的浓度为O. 015M，pH值为7. 4 ;步骤III (I)中所述的荧光聚苯乙烯微球的直径为50 200nm ;优选的直径为130nm ；步骤III (I)中所述的吐温-20水溶液的浓度优选为体积百分比O. 5% ；步骤III (I)中所述的离心的条件优选为12000 13000rpm离心15 30min ；步骤III (I)中所述的4-吗啉乙磺酸缓冲液优选为O. 1Μ、ρΗ值为5. 5的4_吗啉乙磺酸缓冲液；步骤III (I)中所述的离心洗涤沉淀的次数为2 3次，离心转速为10000 IlOOOrpm,每次离心I 2min ；步骤III (2)中所述的莱克多巴胺单克隆抗体与所述的荧光聚苯乙烯微球按质量比 20 IOOyg/ (I. 5 X IO11 个)配比，优选为 60 μ g/ (I. 5 X IO11 个)配比;步骤III (2)中所述的克伦特罗单克隆抗体与所述的荧光聚苯乙烯微球按质量比20 IOOyg/ (I. 5 X IO11 个)配比，优选为 60 μ g/ (I. 5 X IO11 个)配比;步骤III (2)中所述的甘氨酸的作用为通过甘氨酸的氨基将荧光聚苯乙烯微球上的羧基封闭住；用量优选为每I. 5X1011个荧光聚苯乙烯微球使用O. 01 O. 03mol甘氨酸；步骤III (2)中所述的离心洗涤的次数为2 3次，离心转速为7000 9000rpm，每次离心I 2min ；步骤III (2)中所述的封闭溶液为含40 60% (w/v)蔗糖、I 2% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)和I 2% (v/v)吐温-20 (Tween-20)的磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液的浓度为 O. 015M, pH 值为 7. 4 ；步骤III (2)中所述的超声处理的条件为100W、2 4min ；步骤V中所述的羊抗鼠免疫球蛋白G溶液的浓度为O. 25 lmg/ml包被溶液；步骤V中所述的莱克多巴胺蛋白质偶联物溶液的浓度为O. 05 O. 3mg/ml包被溶液；步骤V中所述的盐酸克伦特罗蛋白质偶联物溶液的浓度为O. 05 O. 3mg/ml包被溶液；步骤V中所述的烘干的条件是37°C干燥72h ；所述的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条的应用，包含以下步骤 (I)当检测样品为液体样品时，直接将样品滴加于样品吸收塾上，IOmin后在450nm激发光照射下判读结果；(2)当检测样品为固体样品时，将固体样品进行消解，再将消解后得到的溶液滴加于样品吸收垫上，IOmin后在450nm激发光照射下判读结果；(3)结果的判断①当检测线Tl、检测线T2和质控线C在450nm激发光照射下同时显现绿色荧光印 迹，表示检测结果为阴性，说明被检测样本中不含克伦特罗和莱克多巴胺或含有克伦特罗和莱克多巴胺的浓度小于2ng/ml ；②当检测线Tl、检测线T2在450nm激发光照射下不显现绿色荧光印迹，只有质控线C在激发光下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阳性，说明被检测样品中同时含克伦特罗和莱克多巴胺且二者的浓度大于2ng/ml ；③当检测线Tl在450nm激发光照射下不显现绿色荧光印迹，检测线T2和质控线C在450nm激发光照射下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阳性，说明被检测样品莱克多巴胺的浓度大于2ng/ml ；④当检测线T2在450nm激发光下不显现绿色荧光印迹，检测线Tl和质控线C在450nm激发光照射下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阳性，说明被检测样品中克伦特罗的浓度大于2ng/ml。所述的检测样品为猪肉时，消解的过程如下A、取脂肪猪肉组织样本于均质机中于IOOOrpm均质lmin，得到均质物；B、在2. 5g均质物加入O. 5ml IM HCl，震荡混匀IOmin ；C、加入 100 μ I 4Μ NaOH,剧烈震荡 30s 后，室温下 4000rmp 离心 15min ；D、取上清，在上清中加入50μ I 4Μ NaOH，震荡混匀，再加入8ml乙酸乙酯，震荡5min ；E、取上层有机相6ml于试管中，65 °C氮气吹干；F、向步骤E吹干后的试管中依次加入O. 3ml正己烷和O. 3ml含体积百分比
O.5%Tween-20的磷酸盐缓冲液，充分溶解试管壁上的残留物，静置分层后，下层溶液即为消解液。本发明的原理是表面带有羧基基团的聚苯乙烯荧光微球在EDC的作用下与含有氨基的抗莱克多巴胺的单克隆抗体和抗克伦特罗的单克隆抗体共价结合形成稳定的酰胺键(-CO-NH-),当待测样品中不含有莱克多巴胺与克伦特罗时，荧光微球标记的莱克多巴胺单克隆抗体和/或克伦特罗单克隆抗体被包被在硝酸纤维素膜上的莱克多巴胺蛋白质偶联物和/或克伦特罗蛋白质偶联物捕获，荧光微球在相应的区域内聚集，在450nm激发光照射下，发出明亮的绿色荧光，从而被人眼或者仪器识别。当待测样品中含有莱克多巴胺和/或克伦特罗时，待测样品中的莱克多巴胺和/或克伦特罗会与被包被在硝酸纤维素膜上的莱克多巴胺蛋白质偶联物和/或克伦特罗蛋白质偶联物竞争性结合荧光微球标记的莱克多巴胺单克隆抗体和/或克伦特罗单克隆抗体，待测样品中莱克多巴胺和/或克伦特罗的浓度越高，与检测抗原结合的荧光微球标记的莱克多巴胺单克隆抗体和/或克伦特罗单克隆抗体越少，检测线(Tl或T2线)上的荧光强度越小甚至消失，因此可根据检测线(Tl或T2线)上的荧光强度判断待测样品中莱克多巴胺和/或克伦特罗的含量。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果(I)本发明所述的荧光微球层析试纸条与高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱质谱联用法和酶联免疫吸附法相比具有操作简单、安全，检测时间短等优点；与胶体金免疫层析试纸条相比，本发明具有避免接触重金属离子、检测灵敏度高等优点。(2)本发明所述的荧光微球层析试纸条使用间接竞争法检测尿液、组织等样本中莱克多巴胺与克伦特罗的残留，具有快速、简单、灵敏等优点，可实现对莱克多巴胺和克伦特罗残留的同时现场监测。



图I为莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条的结构示意图，其中I为PVC底板，2为样品吸收垫，3为结合垫，4为层析膜，5为吸水垫，6为检测线Tl、7为检测线Τ2，8为质控线C。图2是将莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条的检测结果示意图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I(I)莱克多巴胺蛋白质偶联物的制备称取盐酸莱克多巴胺50mg、琥珀酸酐15mg溶于无水吡啶，室温下搅拌反应24h，离心浓缩仪抽干，得到衍生物A ;将衍生物A溶解于N，N’ - 二甲基甲酰胺(DMF)中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) llmg、二环己基碳二亚胺(DCC) 20mg室温搅拌条件下反应过夜；IOOOrpm离心，取上清得到B液；称取250mg牛血清白蛋白溶于O. 015M、pH=7. 4的磷酸盐缓冲液中，4°C预冷；冰浴搅拌条件下将B液逐滴加入到牛血清白蛋溶液中，4°C搅拌反应过夜；4°C，5000rpm离心5min，取上清得到C液；将C液置于4°C，0. 015M、pH=7. 4的磷酸盐缓冲液中透析三天，得到莱克多巴胺蛋白质偶联物。(2)克伦特罗蛋白质偶联物的制备称取25mg克盐酸克伦特罗溶于ImllM盐酸中，再加入2. 5ml蒸馏水，4°C预冷；缓慢加入IM亚硝酸钠溶液，用淀粉碘化钾试纸检测至为棕紫色为止；加固体尿素终止反应，得到淡黄色的A液；称取125mg牛血清白蛋白溶于
O.015M、pH=7. 4的磷酸盐缓冲液中，4°C预冷；将A液逐滴加入牛血清白蛋溶液中，4°C搅拌过夜得橙黄色的BI液；将BI液置于4°C，O. 015M、pH=7. 4的磷酸盐缓冲液透析三天，得克伦特罗蛋白质偶联物。(3)制备莱克多巴胺-盐酸克伦特罗荧光微球检测试纸条，方法如下A.突光聚苯乙烯微球(130nm,购于上海照康生物科技有限公司，最大激发光波长为468nm，最大发射光波长为508nm ;内含有机荧光染料罗丹明B)的活化调整荧光聚苯乙烯微球在Tween-20水溶液(O. 5%v/v)中的浓度为I. 5X IO11个/ml，得到荧光聚苯乙烯微球悬液；取Iml突光聚苯乙烯微球悬液,于12000rpm离心20min,收集沉淀；用4ml O. 1M、pH5. 5的4-吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液溶解沉淀后，加入40mgl-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和25mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混匀，室温放置30min，离心洗涤2次，每次IlOOOrpm离心2min，沉淀用4ml MES缓冲液(O. 1M、ρΗ5· 5)溶解，4°C放置，即得活化后的荧光聚苯乙烯微球悬液；B.荧光聚苯乙烯微球的标记将莱克多巴胺单克隆抗体和克伦特罗单克隆抗体各60 μ g分别加入到步骤A制备的活化后的荧光聚苯乙烯微球溶液中，混匀后室温搅拌反应2h，得到荧光聚苯乙烯微球标记蛋白溶液；C.荧光聚苯乙烯微球的封闭；加入200μ I O. IM甘氨酸溶液到上述步骤B中的荧光聚苯乙烯微球标记蛋白溶液中，室温搅拌反应lh，离心洗涤2次，每次8000rpm、离心2min,沉淀用含60%鹿糖(w/v)、l% (w/v) BSA (牛血清白蛋白)和1% (v/v)吐温-20(tween-20)的O. 015M、pH=7. 4的磷酸盐缓冲液溶解，并用100W超声波处理2min，4°C放置，得到封闭后的荧光聚苯乙烯微球悬液；
D.荧光微球标记蛋白悬液涂抹聚酯膜的制备借助喷金仪在聚酯膜上以2微升/厘米的喷量均匀喷涂上步骤C封闭后的荧光微球标记抗体悬液，37°C烘干，4°C避光干燥保存，得到涂抹荧光微球标记蛋白的聚酯膜。E.包被抗体或抗原的硝酸纤维素膜的制备将步骤(I)、(2)中已制备好的莱克多巴胺蛋白质偶联物、克伦特罗蛋白质偶联物和羊抗鼠免疫球蛋白G分别用包被溶液(将十二水磷酸氢二钠28. 94g、磷酸二氢钾2. 61g、氯化钠8. 0g、氯化钾O. 2g、二乙烯三胺五乙酸O. 06g加入蒸馏水中溶解并定容至IOOOml得到)稀释，分别得到莱克多巴胺蛋白质偶联物溶液(浓度为O. 3mg/ml)、克伦特罗蛋白质偶联物溶液(浓度为O. 3mg/ml)和羊抗鼠免疫球蛋白G溶液(浓度为O. 5mg/ml)，将以上三种溶液依次喷于硝酸纤维素膜上(NC膜)，分别作检测线Tl和T2线及质控线C线，C线、Tl线与T2线三线间隔同为3mm，均匀分布，37°C烘干72h，得到包被后的硝酸纤维素膜。F.莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条的制备如图I所示，在PVC底板I上用不干胶依次粘贴相互搭接的样品吸收垫2 (材质为玻璃纤维膜)、结合垫3 (即步骤D制备的涂抹荧光微球标记蛋白的聚酯膜)、层析膜4 (即步骤E制备的包被抗体或抗原的硝酸纤维素膜)以及吸水垫5 (材质为吸水纸即)，得到莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条。其中，检测线Tl (6)靠近吸收垫2，质控线C (8)靠近吸水垫，检测线T2 (7)位于检测线Tl (6)和质控线C (8)中间。莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条用于一检多项的检测结果如图2所示如果检测线Tl线、T2线和控制线C线在450nm激发光照射下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阴性，说明被检测样本中不含克伦特罗和莱克多巴胺或是含有的克伦特罗和莱克多巴胺的浓度小于2ng/ml，见图2 (a);如果检测线Tl线、T2线在450nm激发光照射下不显现绿色荧光印迹，只有控制线C线在激发光下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阳性，说明被检测样品中同时含克伦特罗和莱克多巴胺且二者的浓度大于Zngml/1，见图2 (b);如果检测线Tl线在450nm激发光照射下不显现绿色荧光印迹，检测线T2线和控制线C线在450nm激发光照射下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阳性，说明被检测样品莱克多巴胺的浓度大于2ng/ml，见图2 (c);如果检测线T2线在450nm激发光下不显现绿色荧光印迹，检测线Tl线和控制线C线在450nm激发光照射下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阳性，说明被检测样品中克伦特罗的浓度大于2ng/ml，见图2 (d);如果控制线C线在450nm激发光下不显现绿色荧光印迹，表示该检测试纸条失效，见图2 (e)。实施例2进行以下试验，验证用本发明制备的检测试纸条的检测特异性a、分别用磷酸缓冲液配制莱克多巴胺(RAC)、克伦特罗(CL)及沙丁胺醇(SAL)的系列梯度的标准溶液(浓度分别为O、O. 5、l、2、3、、5、20ng/ml)。b、用滴管吸取步骤a所得标准溶液各3滴(约100 μ I )，滴加于试纸条的样品吸收垫上，滴加样品后开始计时；c、IOmin后在450nm激发光照射下判读结果；通过对制得的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条进行特异性交叉反应 测试，结果如下表I为莱克多巴胺、克伦特罗与其他类似物的交叉反应结果
权利要求
1.一种莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条，包含附着于底板上且依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其特征在于结合垫上含有荧光聚苯乙烯微球标记蛋白；层析膜上设置有两条检测线和一条质控线，检测线靠近结合垫，质控线靠近吸水垫；一条检测线上包被有莱克多巴胺蛋白质偶联物，另一条检测线上包被有克伦特罗蛋白质偶联物，质控线上包被有能与荧光聚苯乙烯微球标记蛋白中的蛋白结合且不和莱克多巴胺和克伦特罗结合的蛋白偶联物；荧光聚苯乙烯微球标记蛋白为荧光聚苯乙烯微球标记的莱克多巴胺单克隆抗体和荧光聚苯乙烯微球标记的克伦特罗单克隆抗体。
2.根据权利要求I所述的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条，其特征在于 所述的样品吸收垫的材质为玻璃纤维膜； 所述的结合垫的材质为聚酯膜； 所述的层析膜的材质为硝酸纤维素膜； 所述的吸水垫的材质为吸水纸； 所述的质控线由羊抗鼠免疫球蛋白G溶液制备得到。
3.根据权利要求I所述的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条，其特征在于所述的荧光聚苯乙烯微球标记蛋白通过如下方法制备得到 (1)荧光聚苯乙烯微球的活化将荧光聚苯乙烯微球分散于吐温-20水溶液中，得到荧光聚苯乙烯微球悬液，离心，收集沉淀；沉淀用4-吗啉乙磺酸缓冲溶液溶解后，加入I-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，再加入N-羟基琥珀酰亚胺，混匀后反应30 60min,离心洗涤沉淀，再用MES缓冲液溶解沉淀，得到活化后的荧光聚苯乙烯微球悬液；其中，I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与荧光聚苯乙烯微球按30 50mg/(I. 5X IO11个)配比；N-羟基琥珀酰亚胺与荧光聚苯乙烯微球按20 30mg/(l. 5X IO11个)配比； (2)荧光聚苯乙烯微球标记蛋白溶液的制备将莱克多巴胺单克隆抗体和克伦特罗单克隆抗体加入到步骤(I)制备的活化后的荧光聚苯乙烯微球悬液中，混匀后搅拌反应I 3h ;接着加入甘氨酸，搅拌反应O. 5 2h，离心洗涤，沉淀用封闭溶液溶解后进行超声处理，得到封闭后的荧光微球标记抗体悬液。
4.根据权利要求3所述的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条，其特征在于 步骤(I)中所述的荧光聚苯乙烯微球的直径为50 200nm ； 步骤(I)中所述的吐温-20水溶液的浓度为体积百分比O. 5% ； 步骤(I)中所述的离心的条件为12000 13000rpm离心15 30min ； 步骤(I)中所述的4-吗啉乙磺酸缓冲液为O. 1M、pH值为5. 5的4-吗啉乙磺酸缓冲液； 步骤(I)中所述的离心洗涤沉淀的次数为2 3次，离心转速为10000 llOOOrpm，每次离心I 2min ； 步骤(2)中所述的莱克多巴胺单克隆抗体与所述的荧光聚苯乙烯微球按质量比20 .100 μ g/ (I. 5X IO11 个)配比； 步骤(2)中所述的克伦特罗单克隆抗体与所述的荧光聚苯乙烯微球按质量比20 .100 μ g/ (I. 5X IO11 个)配比； 步骤(2)中所述的甘氨酸的用量为每I. 5X1011个荧光聚苯乙烯微球使用O. 01 O.03mol甘氨酸； 步骤(2)中所述的离心洗涤的次数为2 3次，离心转速为7000 9000rpm，每次离心I 2min ； 步骤(2)中所述的封闭溶液为含质量体积比40 60%蔗糖、质量体积比I 2%牛血清白蛋白和体积百分比I 2%吐温-20的磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液的浓度为O. 015M，PH值为7.4； 步骤(2)中所述的超声处理的条件为100W、2 4min。
5.根据权利要求I所述的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条，其特征在于所述的莱克多巴胺蛋白质偶联物通过包含如下步骤的方法得到 1)将盐酸莱克多巴胺和琥珀酸酐溶于无水吡啶中，搅拌反应后干燥，得到衍生物； 2)将衍生物溶解于N，N’-二甲基甲酰胺中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺搅拌条件下反应过夜；离心，取上清； 3)将步骤2)得到的上清滴加入2 8°C预冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C搅拌反应过夜，2 8°C离心，取上清，将上清置于磷酸盐缓冲液中于2 8°C透析，得到莱克多巴胺蛋白质偶联物； 其中，盐酸莱克多巴胺、琥珀酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺和牛血清白蛋白按质量比50 :15:11 20 :250进行配比； 所述的克伦特罗蛋白质偶联物通过包含如下步骤的方法得到 ①将盐酸克伦特罗溶于盐酸溶液中，预冷至2 8°C后加入亚硝酸钠溶液进行反应，一边加入亚硝酸钠溶液，一边用淀粉碘化钾试纸检测，当淀粉碘化钾试纸显示为棕紫色，停止加入亚硝酸钠溶液，加入尿素终止反应，得到淡黄色的溶液A ； ②将步骤①制备的溶液A滴加入2 8°C预冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C搅拌反应过夜，得到橙黄色的溶液B ； ③将步骤②制备的溶液B置于磷酸盐缓冲液中于2 8°C透析，得到克伦特罗蛋白质偶联物； 盐酸克伦特罗与牛血清白蛋白按质量比1:4 1:6进行配比。
6.根据权利要求5所述的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条，其特征在于 步骤I)中所述的搅拌反应的时间为24h ； 步骤2)中所述的离心的转速为IOOOrpm ； 步骤3)中所述的磷酸盐缓冲液的浓度为O. 015M, pH值为7. 4 ; 步骤3)中所述的透析的时间为2 4天； 步骤①中所述的盐酸溶液的浓度为O. 28 O. 29mol/L ； 步骤②中所述的牛血清白蛋白溶液为将牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液得到； 所述的磷酸盐缓冲液的浓度为O. 015M, pH值为7. 4 ; 步骤③中所述的磷酸盐缓冲液的浓度为O. 015M, pH值为7. 4。
7.一种莱克多巴胺-克伦特罗突光微球检测试卡，其特征在于含有权利要求I 6任一项所述的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条和外壳；外壳包裹住所述的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条，其中在外壳上开有加样孔和观察孔，加样孔正对着莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条的样品吸收垫，观察孔正对着莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条的检测线Tl、检测线T2和质控线C所在区域。
8.权利要求I 6任一项所述的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤 I、莱克多巴胺蛋白质偶联物的制备将盐酸莱克多巴胺和琥珀酸酐溶于无水吡啶中，搅拌反应后干燥，得到衍生物；将衍生物溶解于N，N’- 二甲基甲酰胺中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺搅拌条件下反应过夜；离心，取上清A ;将上清A滴加入2 8°C预冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C搅拌反应过夜，2 8°C离心，取上清B，将上清B置于磷 酸盐缓冲液中于2 8°C透析，得到莱克多巴胺蛋白质偶联物；其中，盐酸莱克多巴胺、琥珀酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺和牛血清白蛋白按质量比50 15 11 :20 250进行配比； II、克伦特罗蛋白质偶联物的制备将盐酸克伦特罗溶于盐酸溶液中，预冷至2 8°C后加入亚硝酸钠溶液进行反应，一边加入亚硝酸钠溶液，一边用淀粉碘化钾试纸检测，当淀粉碘化钾试纸显示为棕紫色，停止加入亚硝酸钠溶液，加入尿素终止反应，得到淡黄色的溶液A ;将溶液A滴加入2 8°C预冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C搅拌反应过夜，得到橙黄色的溶液B ;将溶液B置于磷酸盐缓冲液中于2 8°C透析，得到克伦特罗蛋白质偶联物；其中，盐酸克伦特罗与牛血清白蛋白按质量比1:4 1:6进行配比； III、荧光聚苯乙烯微球标记蛋白的制备 (1)荧光聚苯乙烯微球的活化将荧光聚苯乙烯微球分散于吐温-20水溶液中，得到荧光聚苯乙烯微球悬液，离心，收集沉淀；沉淀用4-吗啉乙磺酸缓冲溶液溶解后，加入I-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，再加入N-羟基琥珀酰亚胺，混匀后反应30 60min,离心洗涤沉淀，再用MES缓冲液溶解沉淀，得到活化后的荧光聚苯乙烯微球悬液；其中，I-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与荧光聚苯乙烯微球按30 50mg/(I. 5X IO11个)配比；N-羟基琥珀酰亚胺与荧光聚苯乙烯微球按20 30mg/(l. 5X IO11个)配比； (2)荧光聚苯乙烯微球标记蛋白溶液的制备将莱克多巴胺单克隆抗体和克伦特罗单克隆抗体加入到步骤(I)制备的活化后的荧光聚苯乙烯微球悬液中，混匀后搅拌反应I 3h ;接着加入甘氨酸，搅拌反应O. 5 2h，离心洗涤，沉淀用封闭溶液溶解后进行超声处理，得到封闭后的荧光微球标记抗体悬液； IV、含有荧光微球标记蛋白的聚酯膜的制备在聚酯膜上均匀喷涂步骤III制备的封闭后的荧光微球标记抗体悬液，烘干，得到涂抹荧光微球标记蛋白的聚酯膜； V、包被抗原或抗体的硝酸纤维素膜的制备将步骤I制备的莱克多巴胺蛋白质偶联物、步骤II制备的克伦特罗蛋白质偶联物、羊抗鼠免疫球蛋白G分别用包被溶液稀释，得到莱克多巴胺蛋白质偶联物溶液、克伦特罗蛋白质偶联物溶液和羊抗鼠免疫球蛋白G溶液，将以上三种溶液依次喷于硝酸纤维素膜上，分别为检测线Tl、检测线T2和质控线C，检测线Tl、检测线T2和质控线C三线间隔同为3_，烘干，得到包被后的硝酸纤维素膜；包被溶液的组成如下十二水磷酸氢二钠28. 94g、磷酸二氢钾2. 61g、氯化钠8. 0g、氯化钾O. 2g、二乙烯三胺五乙酸O. 06g,蒸懼水定容至IOOOml ； VI、试纸条的制备首先，在底板的中心黏贴上层析膜，即步骤V制备的包被抗原或抗 体的硝酸纤维素膜；在层析膜靠近质控线C的一端搭接黏贴上吸水垫；在层析膜的另一端搭接黏贴上结合垫，即步骤IV制备的含有荧光微球标记蛋白的聚酯膜；在结合垫的另一端搭接黏贴上样品吸收垫，得到莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于 步骤I中所述的搅拌反应的时间为24h ;所述的离心的转速为IOOOrpm ;所述的磷酸盐缓冲液的浓度为O. 015M，pH值为7. 4 ;所述的透析的时间为2 4天； 步骤II中所述的盐酸溶液的浓度为O. 28 O. 29mol/L ;所述的磷酸盐缓冲液的浓度为 O. 015M, pH 值为 7. 4 ； 步骤III (I)中所述的荧光聚苯乙烯微球的直径为50 200nm ;所述的吐温-20水溶液的浓度为体积百分比O. 5% ;所述的离心的条件为12000 13000rpm离心15 30min ;所述的4-吗啉乙磺酸缓冲液为O. 1Μ、ρΗ值为5. 5的4-吗啉乙磺酸缓冲液；所述离心洗涤沉淀的次数为2 3次,离心转速为10000 IlOOOrpm,每次离心I 2min ； 步骤III (2)中所述的莱克多巴胺单克隆抗体与所述的荧光聚苯乙烯微球按质量比20 100 μ g/ (I. 5X IO11个)配比；所述的克伦特罗单克隆抗体与所述的荧光聚苯乙烯微球按质量比20 100 μ g/(l. 5X IO11个)配比；所述的甘氨酸的用量为每I. 5X IO11个荧光聚苯乙烯微球使用O. 01 O. 03mol甘氨酸；所述的离心洗涤的次数为2 3次，离心转速为7000 9000rpm,每次离心I 2min ;所述的封闭溶液为含质量体积比40 60%鹿糖、质量体积比I 2%牛血清白蛋白和体积百分比I 2%吐温-20的磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液的浓度为O. 015M，pH值为7. 4 ;所述的超声处理的条件为100W、2 4min ； 步骤V中所述的羊抗鼠免疫球蛋白G溶液的浓度为O. 25 lmg/ml包被溶液； 步骤V中所述的莱克多巴胺蛋白质偶联物溶液的浓度为O. 05 O. 3mg/ml包被溶液； 步骤V中所述的盐酸克伦特罗蛋白质偶联物溶液的浓度为O. 05 O. 3mg/ml包被溶液； 步骤V中所述的烘干的条件是37°C干燥72h。
10.权利要求I 6任一项所述的莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条的应用，其特征在于包含以下步骤 Cl)当检测样品为液体样品时，直接将样品滴加于样品吸收垫上，IOmin后在450nm激发光照射下判读结果； (2)当检测样品为固体样品时，将固体样品进行消解，再将消解后得到的溶液滴加于样品吸收垫上，IOmin后在450nm激发光照射下判读结果； (3)结果的判断: ①当检测线Tl、检测线T2和质控线C在450nm激发光照射下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阴性，说明被检测样本中不含克伦特罗和莱克多巴胺或含有克伦特罗和莱克多巴胺的浓度小于2ng/ml ； ②当检测线Tl、检测线T2在450nm激发光照射下不显现绿色荧光印迹，只有质控线C在激发光下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阳性，说明被检测样品中同时含克伦特罗和莱克多巴胺且二者的浓度大于2ng/ml ； ③当检测线Tl在450nm激发光照射下不显现绿色荧光印迹，检测线T2和质控线C在450nm激发光照射下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阳性，说明被检测样品莱克多巴胺的浓度大于2ng/ml ；④当检测 线T2在450nm激发光下不显现绿色突光印迹,检测线Tl和质控线C在450nm激发光照射下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阳性，说明被检测样品中克伦特罗的浓度大于2ng/ml。
全文摘要
本发明公开一种莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条及制备与应用。该试纸条包含附着于底板上且依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，结合垫上含有荧光聚苯乙烯微球标记蛋白；层析膜上设置有两条检测线和一条质控线，检测线靠近结合垫，质控线靠近吸水垫；一条检测线上包被有莱克多巴胺蛋白质偶联物，另一条检测线上包被有克伦特罗蛋白质偶联物，质控线上包被有能与荧光聚苯乙烯微球标记蛋白中的蛋白结合且不和莱克多巴胺和克伦特罗结合的蛋白偶联物；荧光聚苯乙烯微球标记蛋白为荧光聚苯乙烯微球标记的莱克多巴胺单克隆抗体和克伦特罗单克隆抗体。该试纸条能同时检测莱克多巴胺和克伦特罗，快速、简便、灵敏、准确检测。
文档编号G01N33/558GK102830230SQ20121030935
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者唐勇, 崔浩 申请人:暨南大学