专利名称：一种马铃薯块茎病毒的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种马铃薯块茎病毒的快速检测方法，主要是利用RT-PCR联合核酸免疫胶体金层析试纸条法快速检测马铃薯块茎病毒的方法。
背景技术：
马铃薯是是继小麦、玉米、水稻之后的第四大粮食作物，它分布广泛、适应性强、产量高、营养丰富、具有多种用途。我国马铃薯的播种面积和总产均居世界第一位，但我国马铃薯的单产水平却排名第40位，处于相对落后的地位，其原因主要是由于病毒(类病毒)的危害造成。近年来，以茎尖组培脱毒技术为代表的马铃薯脱毒种薯生产技术已广泛应用，对病毒病害的防治起到了非常显著的作用。马铃薯脱毒苗和脱毒种薯的生产过程中病毒的快速、灵敏的检测是关键技术之一。
目前用于马铃薯病毒的检测方法主要是指示植物法、电镜观察法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、核酸杂交法(NASH)、往复双向聚丙烯酸胶凝胶电泳法等。其中指示植物法需要种植鉴别寄主植物，一些蚜传病毒还需要饲养无毒蚜虫，耗时耗力。电镜观察快速但对仪器的要求较高。核酸杂交法和往复双向聚丙烯酸胶凝胶电泳法步骤繁多、耗时。目前在产生实践中最常用的是ELISA法，该方法简便、快速，但其灵敏度远低于RT-PCR法。RT-PCR法是目前灵敏度最高、最快速的方法。但由于马铃薯块茎中淀粉含量较高，其RNA提取较困难，因此在马铃薯块茎病毒的检测中有一定的应用难度。 另外，PCR产物的检测常规方法是采用琼脂糖凝胶电泳进行，电泳后需要进行溴化乙锭染色后在紫外光下观察，溴化乙锭对人具有中等毒性和致癌性，易造成环境污染，这也严重限制了此方法的推广。

发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术所存在的问题而专门研制的一种马铃薯块茎病毒的快速检测方法，该方法是在优化马铃薯块茎病毒RNA提取方法的前提下，将 RT-PCR技术与核酸胶体金免疫层析技术相结合，建立的适用于马铃薯块茎病毒的快速检测方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
一种马铃薯块茎病毒的快速检测方法，包括马铃薯块茎RNA的提取、RT-PCR反应和PCR 产物的核酸胶体金层析试纸条检测三大步骤，具体如下
(1)取待测马铃薯块茎组织样本，在所研制的马铃薯块茎RNA提取缓冲液中研磨，研磨所得汁液即可作为病毒RNA进行反转录；
(2)取一定量的研磨后的汁液，并加入随机六聚体引物、无RNase的水、反转录酶、缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂等进行反转录；以反转录产物为模板，加入待测马铃薯病毒的特异性引物(上游引物、下游引物分别标记了生物素、荧光素)、缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、 无RNase的水进行PCR扩增；
(3)采用常规方法制备胶体金溶液、胶体金-兔抗生物素多克隆抗体结合物、层析试纸条，在检测点加入荧光素单克隆抗体，在质控点加入羊抗兔多克隆抗体；
(4)将步骤2中所得PCR产物与胶体金-兔抗生物素多克隆抗体结合物混合后插入试纸条，检测点和质控点均显色为阳性，仅质控点显色为阴性。所述待测马铃薯病毒为PVS、PVY或PVA。一次检测只能加一种病毒，仅能检测出携带有该病毒的马铃薯，若需对三种病毒都进行检测，需分别进行三次。在本发明中，所述马铃薯病毒PVS、PVY、PVA的特异性引物分别为 (1)马铃薯S病毒引物对
上游弓I物5 ‘ -aattcaacattgagcaacatctc-3 ‘ 下游弓丨物5' -tgattgcgcacaatctcagc-3‘ 扩增片段长度为680 bp。(2)马铃薯Y病毒引物对
上游弓I物5 ‘ -gcaactcaatcacagtttga-3 ‘ 下游引物5' -gtagagtatgcatacttgga-3‘ 扩增片段长度为532 bp。(3)马铃薯A病毒引物对
上游弓丨物5' -gatgtcgatttaggtactgc-3‘ 下游弓丨物5' -gccttaaagaaggctttgcatg-3‘ 扩增片段长度为376 bp。上游引物的5'端标记生物素，下游引物的5'端标记荧光素。所述胶体金溶液制备方法如下
a)取1%氯金酸0.6 mL,加30 mL超纯水加热煮沸；
b)加37°C预热的1%柠檬酸钠溶液0.9mL，快速一次加入，溶液由蓝逐渐变为紫红色， 煮沸3-5 min，补水至总体积31. 5 mL。c)冷却后，用 0.2 mol/L K2CO3 调 pH 至 8. 0-8. 2，用 0. 45 μ m 滤膜过滤，4°C 保存。所述胶体金-兔抗生物素多克隆抗体结合物的制备方法如下
(1)取纯化好的兔抗生物素多克隆抗体400μ g，在磁力搅拌下缓慢加入胶体金液20 mL,室温搅拌30 min ；
(2)加入10% BSA 0. 8 mL，室温搅拌 5 min ；
(3)加入10% PEG 0. 4 mL，室温搅拌 5 min ；
(4)10,000r/min，离心40 min，去上清，加入2 mL保存液(取四硼酸钠0. 1 g，BSA 0. 25 g，溶于250 mL蒸馏水)悬浮沉淀；
(5)加入8 mL 稀释液(取 Na2HPO4 ·12Η20 6.1 g, NaCl 8.5 g, PVP40 5 g，硼酸 2.1 g, PEG 1 g, 10% BSA 50 mL，溶于1000 mL蒸馏水)，取小量进行检定，其余置4°C保存。上述试剂均可在生物公司购得，生物素、荧光素标记的病毒特异性引物可在生物公司合成。
本发明的优点首先，本发明研制出一种RNA提取液，在马铃薯待测样本研磨后可直接进行RT-PCR检测，省去了现有方法中的RNA提取步骤，解决了由于马铃薯块茎淀粉含量高，其RNA提取困难的问题。其次，本发明所研制的核酸胶体金层析试纸条在IOmin内即可完成PCR产物的检测，不需要电泳和溴化乙锭的染色，更为快速实用，简便、灵敏，且安全无污染。


图1为本发明试纸条组装图。图中1、玻璃纤维素膜；2、硝酸纤维素膜；3、吸水纸；4、双面胶塑料板。图2为试纸条中T点和C点示意图
图3为RT-PCR产物的核酸层析试纸条检测结果示意 a、阴性结果；b、阳性结果
具体实施例方式本发明以下做更为具体的描述一、PCR扩增病毒目的基因
1. PCR引物的设计
从NCBI库中搜索已提交的PVS，PVY, PVA的所有序列，根据CLUSTAL序列分析的结果， 应用引物设计软件，分别设计引物。本发明中所设计的PCR引物为； (1)马铃薯S病毒引物对
上游弓I物5 ‘ -aattcaacattgagcaacatctc-3 ‘ 下游弓丨物5' -tgattgcgcacaatctcagc-3‘ 扩增片段长度为680 bp。(2)马铃薯Y病毒引物对
上游弓I物5 ‘ -gcaactcaatcacagtttga-3 ‘ 下游引物5' -gtagagtatgcatacttgga-3‘ 扩增片段长度为532 bp。(3)马铃薯A病毒引物对
上游弓丨物5' -gatgtcgatttaggtactgc-3‘ 下游弓丨物5' -gccttaaagaaggctttgcatg-3‘ 扩增片段长度为376 bp。上游引物的5'端标记生物素，下游引物的5'端标记荧光素。2.样品总RNA的提取
取待测的马铃薯块茎0. 1 g，加入500 μ L的提取缓冲液[配方DEPC处理过的0. 01 mol/L PBS 缓冲液(pH 7. 4)，含有 2 % PVP-40 (w/v),0. 2 %卵清蛋白(w/v)和 1 % Na2SO3 (w/v)]，在研钵中将其研磨成汁液。3. RNA反转录合成cDNA
取上述马铃薯块茎汁液4 μ L，随机六聚体引物1 μ L，无RNase水4μ L，加入到一个PCR管中混均，70°C保温10 min后，迅速在冰上冷却2 min。再向其中加入5XM-MLV反转录酶缓冲液4 μ L，dNTPs (各10 mmol/L) 1 μ L，RNA酶抑制剂0. 5 μ L, M-MLV反转录酶 0.5 yL，用无RNase水5 μ L。混勻后置于42°C孵育lh，然后于70°C保温10 min后，冰上冷却2 min。4. PCR 检测
PCR 反应体系反转录产物 3 μ LUOXPCR Buffer 2 μ L、dNTP Mix (10 mmol/L each) 1 μ L、待测马铃薯病毒(PVS或PVY或PVA)的上游引物(10 μ mol/L) 1 μ L、下游引物(10 μ mol/L) 1 μ L.Taq DNA聚合酶(5 U/μ L) 0.5 μ L、RNase_free水 11. 5 μ L。PCR 反应程序为94 "C 3 min ；94 "C 30 s，55°C 30 s，72°C 1 min，30 个循环； 72°C 10 min。上述试剂均可在生物公司购得，生物素、荧光素标记的病毒特异性引物可在生物公司合成。二、PCR产物的胶体金核酸免疫层析检测 1、需用的溶液配制
1%氯金酸取氯金酸1 g加2 mL蒸馏水溶解后补加蒸馏水至100 mL。1%柠檬酸钠取柠檬酸三钠1 g加蒸馏水100 mL溶解。0. 2 mol/L K2CO3 取 K2CO3 6 g 加蒸馏水 100 mL 溶解。10% BSA:取 BSA 10 g 溶于 100 mL 蒸溜水中，置 56°C水浴 30 min, 10,000 r/min 离心30 min，4-8°C保存。10% PEG 取 PEG (分子量 20，000) 10 g，加蒸馏水 100 mL 溶解。保存液取四硼酸钠0. 1 g，BSA 0. 25 g，溶于250 mL蒸馏水。稀释液取Na2HPO4 · 12H20 6.1 g，NaCl 8.5 g, PVP40 5 g，硼酸 2.1 g，PEG 1 g, 10% BSA 50 mL，溶于 1000 mL 蒸馏水。2、胶体金溶液的制备
(1) ·取1%氯金酸0. 6 mL,加30 mL超纯水加热煮沸。(2).加37°C预热的1%柠檬酸钠溶液0.9 mL，快速一次加入，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸3-5 min，补水至总体积31. 5 mL。(3) ·冷却后，用 0. 2 mol/L K2CO3 调 pH 至 8. 0 8· 2，用 0. 45 μ m 滤膜过滤，4°C保存。3、胶体金-兔抗生物素多克隆抗体结合物的制备
(1)取纯化好的兔抗生物素多克隆抗体400 μ g，在磁力搅拌下缓慢加入胶体金液20 mL，室温搅拌30 min。(2)加入 10% BSA 0. 8 mL，室温搅拌 5 min。(3)加入 10% PEG 0. 4 mL，室温搅拌 5 min。(4) 10,000 r/min，离心40 min，去上清，加入2 mL保存液悬浮沉淀。(5)加入8 mL稀释液，取小量进行检定，其余置4°C保存。4、空白试纸条的组装
(1).在80 mmX300 mm双面胶塑料板内侧粘附25 mmX300 mm硝酸纤维素膜。(2).在双面胶塑料板粘附20 mmX300 mm玻璃纤维素膜，并与硝酸纤维素膜重合2 mm，再粘贴一层胶带。(3).同样在另一侧粘贴一张39 mmX300 mm的吸水纸，也与硝酸纤维素膜重合2 mm (图 1)。(4).用切条机将组装好的塑料板切成4 mm宽的试纸条。5、核酸胶体金层析试纸条检测PCR产物
在试纸条抗体固相硝酸纤维素层析膜(NC膜)上靠近玻璃纤维素膜的一端点上1 μ L 的荧光素单克隆抗体作为检测点(Τ点)。在NC膜上靠近吸水纸一端点上1 μ L羊抗兔多克隆抗体作为质控点(C点)。在离心管中加入100 PL胶体金-兔抗生物素多克隆抗体溶液、100 μ L PBS缓冲液，然后加入5 μ L的标记生物素和荧光素引物的PCR产物。插入试纸条，15 min内观
察显色结果。T点显色PCR产物两端标记上生物素和荧光素；胶体金上则标记兔抗生物素多克隆抗体；试纸条T点上喷有小鼠抗荧光素单克隆抗体。检测时，将PCR产物加入胶体金中， PCR链上标记的生物素能够和兔抗生物素多克隆抗体结合，形成复合物胶体金-兔抗生物素抗体-PCR产物；而PCR产物链上标记荧光素可以和T点上小鼠抗荧光素单克隆抗体结合，则层析时该复合物可以被T点所捕获，形成胶体金-兔抗生物素抗体-PCR产物-小鼠抗荧光素单克隆抗体的结构而使T点显色。C点显色试纸条的C点上喷上羊抗兔多克隆抗体，则能形成胶体金-兔抗生物素抗体-羊抗兔多克隆抗体或胶体金-兔抗生物素多克隆抗体-(PCR产物)-羊抗兔多克隆抗体的复合物。检测带毒材料时，形成的胶体金-兔抗生物素多克隆抗体-PCR产物先被T 点上荧光素抗体所捕获，多余的复合物或没有完全被T点捕获的，则被随后的C点所捕获形成胶体金-兔抗生物素多克隆抗体-(PCR产物)-羊抗兔多克隆抗体的复合物使C点显色。而检测健康的材料或缓冲液时，C点所捕获的只是胶体金-兔抗生物素多克隆抗体，形成胶体金-兔抗生物素多克隆抗体-羊抗兔多克隆抗体而显色。因此，如果C、T点都显色，结果为阳性；阴性和空白对照应仅C点显色，T点不显色，结果为阴性和空白对照(参见图3)。C，T点都不显色，则试剂条失效，结果不能判定。
权利要求
1.一种马铃薯块茎病毒的快速检测方法，其特征在于包括马铃薯块茎RNA的提取、 RT-PCR反应和PCR产物的核酸胶体金层析试纸条检测步骤，具体如下取待测马铃薯块茎组织样本，在所研制的马铃薯块茎RNA提取缓冲液中研磨，研磨所得汁液即可作为病毒RNA进行反转录；取研磨后的汁液，并加入随机引物、无RNA水解酶(RNase)的水、反转录酶、缓冲液、 dNTPs、RNA酶抑制剂等进行反转录；以反转录产物为模板，加入待测马铃薯病毒的特异性引物(上游引物、下游引物分别标记了生物素、荧光素)、缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、无 RNase的水进行PCR扩增；采用常规方法制备胶体金溶液、胶体金-兔抗生物素多克隆抗体结合物、层析试纸条， 在检测点加入荧光素的单克隆抗体，在质控点加入羊抗兔多克隆抗体；将步骤2所得PCR产物与胶体金-兔抗生物素多克隆抗体结合物混合后插入试纸条， 10 min后，检测点和质控点均显色为阳性，仅质控点显色为阴性。
2.根据权利要求1所述的马铃薯块茎病毒的快速检测方法，其特征在于待测马铃薯病毒为PVS、PVY或PVA。
3.根据权利要求1所述的马铃薯块茎病毒的快速检测方法，其特征在于步骤(1)中的马铃薯块茎RNA提取缓冲液配方为焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的0.01 mol/L pH 7. 4磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)，含有2 %聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40) (w/v),0.2 %卵清蛋白(w/ ν)禾口 1 % Na2SO3 (w/v)。
4.根据权利要求1或2所述的马铃薯块茎病毒的快速检测方法，其特征在于马铃薯病毒PVS、PVY、PVA的特异性引物分别为(1)马铃薯S病毒引物对上游弓I物5‘ -aattcaacattgagcaacatctc-3‘ 下游弓丨物5' -tgattgcgcacaatctcagc-3‘ 扩增片段长度为680 bp ；(2)马铃薯Y病毒引物对上游弓I物5 ‘ -gcaactcaatcacagtttga-3 ‘ 下游引物5' -gtagagtatgcatacttgga-3‘ 扩增片段长度为532 bp ；(3)马铃薯A病毒引物对上游弓丨物5' -gatgtcgatttaggtactgc-3‘ 下游弓丨物5' -gccttaaagaaggctttgcatg-3‘ 扩增片段长度为376 bp ；上游引物的5'端标记生物素，下游引物的5'端标记荧光素。
5.根据权利要求1所述的马铃薯块茎病毒的快速检测方法，其特征在于所述胶体金溶液制备方法如下取1%氯金酸0. 6 mL,加30 mL超纯水加热煮沸；加37°C预热的1%柠檬酸钠溶液0.9 mL，快速一次加入，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸3-5 min，补水至总体积31. 5 mL ；冷却后，用0.2 mol/L K2COJfpH至8. 0-8. 2，用0.45 μ m滤膜过滤，4°C保存。
6.根据权利要求1所述的马铃薯块茎病毒的快速检测方法，其特征在于所述胶体金-兔抗生物素多克隆抗体结合物的制备方法如下取纯化好的兔抗生物素多克隆抗体400 μ g，在磁力搅拌下缓慢加入胶体金液20 mL, 室温搅拌30 min ；加入10%牛血清白蛋白(BSA) 0. 8 mL，室温搅拌5 min ； 加入10%聚乙二醇(PEG) 0. 4 mL，室温搅拌5 min ； 10，000 r/min，离心40 min，去上清，加入2 mL保存液悬浮沉淀; 加入8 mL稀释液，取小量进行检定，其余置4°C保存。
全文摘要
一种马铃薯块茎病毒的快速检测方法，其特征在于包括马铃薯块茎RNA的提取、RT-PCR反应和PCR产物的核酸胶体金层析试纸条检测等步骤。本发明是在优化马铃薯块茎病毒RNA提取方法的前提下，将RT-PCR技术与核酸胶体金免疫层析技术相结合，建立的适用于马铃薯块茎病毒的快速检测方法。其最大特点是首先研制出一种RNA提取液，在马铃薯待测样本研磨后可直接进行RT-PCR检测，省去了现有方法中的RNA提取步骤，解决了由于马铃薯块茎淀粉含量高，其RNA提取困难的问题。其次，所研制的核酸胶体金层析试纸条在10min内即可完成PCR产物的检测，不需要电泳和溴化乙锭的染色，更为快速实用，且安全无污染。
文档编号G01N33/569GK102565408SQ201110446009
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者伊艳杰, 吴兴泉, 张慧聪, 张晓婷, 张海燕, 时妍, 曹健, 曹成, 杨庆东, 陈士华 申请人:河南工业大学