专利名称：甘氨酸诊断/测定试剂盒及甘氨酸的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种甘氨酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定甘氨酸 浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
背景技术：
甘氨酸是一种重要的精细化工中间体，广泛应用于农药、医药、食品、化 肥、饲料等行业。根据甘氨酸的制备工艺和产品的纯度可分为食品级、医药 级、饲料级和工业级四种规格产品。
在20多种氨基酸中，甘氨酸是最简单的一种，它是组成蛋白质的一种成 分，为非人体必需氨基酸。《食品添加剂使用卫生标准》规定，甘氨酸允许 使用的范围为调味料和豆奶，最大使用量是lg/kg。国家质检总局日前进行 的一项专项监督检查结果表明，国内部分乳饮料企业为提高产品中蛋白质含 量，在生产加工中违规使用价格低得多的甘氨酸代替奶粉，个别企业问题严 重。据业内人士介绍，使用甘氨酸替代奶粉，可以使产品成本至少减少一半。 人体若摄入甘氨酸的量过多，不仅不能被人体吸收利用，而且会打破人体对 氨基酸的吸收平衡而影响其它氨基酸的吸收，导致营养失衡而影响健康。
目前各地方的检测标准均采用氨基氮测定法测定甘氨酸含量。较新的方 法，采用HPLC法(高效液相色谱柱后衍生法)测定其中的甘氨酸。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及偶联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺 辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定甘氨酸浓度的 方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的甘氨酸诊断/测定试剂盒，采 用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行甘氨 酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明甘氨酸浓度测定方法原理如下
甘氨酸+ 2 A氰化氢合成酶氰化氢+ 二氧化碳+ 2AH2 二氧化碳+丙酮酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化)
L-苹果酸+辅酶
A是电子受体，例如柠檬酸铁(ferric citrate)、焦磷酸铁(ferric pyrophosphate )、 延胡索酸(fUmarate )、 硫酸甲酉旨吩嗪(phenazine methosulphate, PMS)、水合氧化铁(hydrous ferric oxide)、 ferric hydrite 等，但不仅限于上述举例。 这种方法应用氰化氢合成酶(hydrogen cyanide synthase; EC 1.4.99.5)偶 联苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase; EC 1丄1.38; EC 1.1.1.39; EC 1.1.1.40; EC 1丄1.S3)酶促反应连续监测法/终点比色法。氰化氢合成酶酶解甘氨酸反 应产生二氧化碳，再通过偶联苹果酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在 340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定 还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下 降的程度/速度，可以测算甘氨酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无 论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明甘氨酸诊断/测定试剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
氰化氢合成酶 10000 U/L
苹果酸脱氢酶 16000 U/L
硫酸甲酯吩嗪 0.4 mmol/L
丙酮酸 16 mmol/L
硫酸甲酯吩嗪可以用其他电子受体取代。 本发明的甘氨酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氰化氢合成酶、苹果酸脱氢酶、硫酸 甲酯吩嗪、丙酮酸。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、硫酸甲酯吩嗪、丙酮酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、氰化氢合成酶、苹果酸脱氢酶。 还原型辅酶、氰化氢合成酶、苹果酸脱氢酶、硫酸甲酯吩嗪、丙酮酸在试 剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、硫酸甲酯吩嗪、丙酮酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、苹果酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、氰化氢合成酶。
还原型辅酶、氰化氢合成酶、苹果酸脱氢酶、硫酸甲酯吩嗪、丙酮酸在试 剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前 加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定甘氨酸浓度的方法，其还原型辅 酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的甘氨酸诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
氰化氢合成酶 10000 U/L
苹果酸脱氢酶 16000 U/L
硫酸甲酯吩嗪 0.4mmol/L丙酮酸 16mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，
加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度
1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂的
体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，
检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪
下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓度大小。
实施例二
本实施例的甘氨酸诊断/测定试剂为双试剂，包括:
试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
硫酸甲酯吩嗪
丙酮酸
画mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 0.4 mmol/L 16 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
氰化氢合成酶
画mmol/L 500 mmol/L 10000 U/L苹果酸脱氢酶
16000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度
1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂1、
试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约
O分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪
下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓度大
实施例三
本实施例的甘氨酸诊断/测定试剂为三试剂，包括: 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
硫酸甲酯吩嗪
丙酮酸
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂
苹果酸脱氢酶
画mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 0.4 mmol/L 16 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 16000U/L
试剂三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
氰化氢合成酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定甘氨酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间 IO分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被 测甘氨酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为 负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓度大 小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到 本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0015;吸光 度时间反应曲线应呈F降曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围 可达6mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5%;试剂测试的 精密度(重复性)的变异系数(CV)《4%;试剂的灵敏度可达0.1534士0.0542 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广 应用。
权利要求
1. 一种利用酶比色法及酶联法技术的甘氨酸浓度测定方法，其方法原理如下甘氨酸+2A <u>氰化氢合成酶</u> 氰化氢+二氧化碳+2AH2二氧化碳+丙酮酸+还原型辅酶 <u>苹果酸脱氢酶(脱羧化)</u>L-苹果酸+辅酶A是电子受体，例如柠檬酸铁(ferric citrate)、焦磷酸铁(ferricpyrophosphate)、延胡索酸(fumarate)、硫酸甲酯吩嗪(phenazinemethosulphate，PMS)、水合氧化铁(hydrous ferric oxide)、ferric hydrite等，但不仅限于上述举例。将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出甘氨酸的浓度大小测定结果。
2. —种甘氨酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括:缓冲液20--500 mmol/L稳定剂还原型辅酶氰化氢合成酶苹果酸脱氢酶硫酸甲酯吩嗪丙酮酸试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液体试剂，直接使用。硫酸甲酯吩嗪可以用其他电子受体取代。
3. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氰化氢合成酶、苹果酸脱氢酶、硫酸甲 酯吩嗪、丙酮酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氰化氢合成酶、苹果酸脱氢酶、硫酸甲 酯吩嗪、丙酮酸组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、 硫酸甲酯吩嗪、丙酮酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、氰化氢合成酶、 苹果酸脱氢酶组成。还原型辅酶、氰化氢合成酶、苹果酸脱氢酶、硫酸甲 酯吩嗪、丙酮酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氰化氢合成酶、苹果酸脱氢酶、硫酸甲 酯吩嗪、丙酮酸组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、 硫酸甲酯吩嗪、丙酮酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、苹果酸脱氢酶 组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、氰化氢合成酶组成。还原型辅酶、氰 化氢合成酶、苹果酸脱氢酶、硫酸甲酯吩嗪、丙酮酸在试剂l、试剂2或 试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定 剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的甘氨酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定甘氨酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、硫酸甲酯吩嗪、丙酮酸、氰化氢合成酶、苹果酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464273SQ20071019142
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司