专利名称：用于乙型肝炎病毒四色荧光定量pcr检测的试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
发明涉及生物技术领域，具体涉及ー种こ型肝炎病毒核酸定量、分型和YMDD耐药突变四色荧光定量PCR检测试剂盒及其应用方法。
背景技术：
こ型肝炎病毒(Ifepatitis B virus, HBV)在全世界范围内的感染患者超过3亿5千万，是诱发慢性こ肝和肝癌的主要原因。我国更是病毒性肝炎的高发区，HBV感染率高达57.63%，其中，大约80%肝癌由こ肝引起，严重威胁着我国公众的生命健康，所以对肝炎的诊断产品的研究具有重要的社会意义。对人血清样本中HBV总DNA的定量检测，可用于こ型肝炎的临床辅助诊断，确定是否有HBV感染以及病毒载量；并可通过监测患者血清HBV DNA水平的变化，对抗病毒药物的疗效进行辅助观察和判断。HBV根据基因组序列可分为A-H共8种基因型，其中中国较常见的是B型和C型。在长江以南地区，以基因型B型为主，占55%，长江以北C型为主，占81.6%。由于Orito等发现HBV基本核心启动子(BCP)双突变在C型中明显比B型多见，也有研究认为C型HBV患者中DNA阳性率明显高于B型，且C型病毒感染者病毒低度也高于B型，B型感染者早与C型感染者10年发生HBeAg血清转阴，故C型感染者长期高水平的HBV DNA易导致病情加重。因此选取基因型C型为本试剂盒分型鉴定的指标，从而为治疗和预后提供帮助。目前治疗こ型肝炎最常用的核苷类抗病毒药物包括拉米夫定、阿德福韦等，慢性こ肝患者长时间服用后容易发生病毒基因组特定位点变异，从而引发耐药。根据统计变异出现的概率大约为30%以上，大量样本的统计结果显示，常见的拉米夫定耐药突变位点如表I所示。最主要的耐药突变位点是M204，虽然也有173和180、181位点突变，但是这三个位点突变的拉米夫定耐药样本 ， 基本上都同时联合有204位点的变异，因此，204位点是最主要的拉米夫定耐药突变监测位点。一旦检测到病毒变异，需要及时调整治疗策略。表I
权利要求
1.关于乙型肝炎病毒四色荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有两种引物及四种探针，各引物或探针的名称、DNA序列和荧光标记分别为:上游引物:5’ -GCACTTGTATTCCCATCCCATCAT-3’ ；nt645-662, 18bp ； 下游引物:5，-AGCAAAGCCCAAAAGACCCACAAT-3，；nt982-1005, 24bp, antisense ；定量探针 5’ -R0X-TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTT-BHQ2-3’ ；nt768-791, 24bp ；C 型探针 5’ -CY5-TRAACCCTAATAAAACCAAACGTTGG-BHQ2-3’ ；nt836-861, 26bp ；YVDD 探针 5，-VIC- CATCATCCACATARC-MGB-3，；nt751-765, 15bp, antisense ；YIDD 探针 5，-NED-CCACATCATCAATATA-MGB-3’ ；nt754-769, 16bp, antisense。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述各引物、探针与buffer、MgCl2、含dUTP的dNTPs装于一个容器内构成PCR检测混合液mix ;该试剂盒还包括Taq酶、UDG酶、阴性对照样品和阳性对照样品，其中阴性对照为确认HBV DNA阴性血清，阳性对照为含1.0E+06 IU/ml HBV DNA目的基因片段的阳性样本； 在利用所述引物及探针建立的25 μ L PCR反应体系中，各组分的终浓度为:10倍反应缓冲液 buffer, I X ；MgCl2,4.5mM ；dNTPs,各 0.2mM ；dUTP, 0.2mM ；Taq 酶，2.5U ；UDG 酶，0.1U;各条引物，各0.ΙμΜ;各条探针，各0.25μΜ;待测样品模板DNA，5yL。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒为32人份。
4.一种应用权利要求1所述试剂盒检测乙型肝炎病毒DNA总量、C型基因型和YMDD位点耐药突变的方法，其特征在 于，包括利用所述引物、探针建立PCR反应体系；用煮沸法从待测标本中提取DNA，加入前述PCR反应体系；在荧光定量PCR仪上设定反应条件，进行PCR扩增和荧光型号检测；其中， 在利用所述引物及探针建立的25 μ L PCR反应体系中，各组分的终浓度为:10倍反应缓冲液 buffer, I X ；MgCl2,4.5mM ；dNTPs,各 0.2mM ；dUTP, 0.2mM ；Taq 酶，2.5U ；UDG 酶，；各条引物，各0.1411;各条探针，各0.254皿;待测样品模板DNA;5yL; 所述PCR反应的条件为:37°C 2分钟UDG酶作用，消化污染的PCR产物片段；95°C 2分钟热启动并灭活UDG酶；然后进入40个PCR扩增循环，循环温度控制为95°C 10秒，60摄氏度退火70秒。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种用于乙型肝炎病毒四色荧光定量PCR检测的试剂盒及应用。本发明针对病毒S区序列设计扩增引物和4条特异性探针定量探针，对应A-H型的保守区，用来定量总DNA；C型探针，对应C型特有序列，用来检测HBV基因型C型；YVDD探针，对应YVDD(GTG)突变位点；YIDD探针，对应YIDD(ATT)突变位点。试剂盒反应体系包含由特异性引物和探针配制的检测混合液、Taq酶、阴性和阳性对照。本发明用于检测的整个过程小于3小时，效率高，成本低，灵敏度和准确度高，能有效监测乙肝患者病毒载量和服用核苷类药物的疗效。
文档编号G01N21/64GK103088151SQ201210290468
公开日2013年5月8日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者陈智, 符芳芳, 朱海红 申请人:浙江大学