专利名称：一种制备用于快速检测伤寒的凝集试剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备凝集试剂的方法，该凝集试剂用于快速和早期检测血清中的伤寒沙门氏杆菌。
现有技术伤寒是一种由伤寒沙门氏杆菌引起的地方性发热疾病。伤寒是一种公众健康的主要担心。所述生物通常通过消费污染的食物或水进入机体，并侵入肠壁。然后它增殖并在24-72小时内进入血流，导致肠性发热和菌血症。经过10至14天的培养期间，伤寒的早期症状，如头痛、发热、食欲丧失、心动过缓、脾肿大等出现。通过血液培养或通过检测血液中的其抗原或通过检测血液中的其抗体来诊断伤寒。
用于诊断伤寒热的最适合的方法之一是进行“肥达氏试验”，该试验是一种基于检测血液中抗体的血清学试验。这种试验基于事实针对伤寒的抗体存在于受感染的人的血液中，与所述细菌结合并导致凝块形成，该凝块形成被称作“肥达氏凝集”。
肥达氏试验的局限性之一是，试验不是特异性的，因为它与其它发热的生物和肠杆菌科的许多生物交叉反应。
肥达氏试验的另一个局限性是，由于伤寒是一种地方性疾病，因此在该地方区域总是存在一些背景水平的抗体。因此它成为测定切割(cut-off)值必需的，该切割值用于各区域排除诊断为假阳性的可能性。
肥达氏试验的还另一个局限性是，它只有在发烧开始后一周或两周才产生阳性(position)结果。
肥达氏试验的还另一个局限性是，由于单次肥达氏试验是难以捉摸的和无确定结果的，所以要对以至少一周的间隔采取的成对血清样品进行该试验。
肥达氏试验的进一步局限性是，在感染的早期阶段的抗生素施用，抑制抗体的产生，因此试验可产生假阴性结果。
肥达氏试验的还进一步局限性是，TAB接种的正常健康人由于在人系统中针对疫苗的循环抗体的存在而在肥达氏试验中产生现假阳性反应。
肥达氏试验的另一个局限性是，它提供伤寒感染的间接证据。
肥达氏试验的进一步局限性是，该试验具有低灵敏度和低特异性。
已知用于诊断伤寒的其它技术是基于病原体的分离和鉴定。该方法被认为是金标准。
在这种技术中，从血液中分离并通过显微镜检测和生化检测鉴定伤寒沙门氏杆菌。然而，这种技术具有许多局限性。
上述技术的一个局限性是它耗时，因为它需要3天至14天的长培养期间，而且还需要精密的试验室设施。
上述技术的另一个局限性是，为其进行需要大量的血液样品(10毫升/患者)。
上述技术的还另一个局限性是，它需要大体积的培养基即100毫升(10倍于血液样品)。
上述技术的还另一个局限性是其低灵敏度(40至60％)，由于循环系统中有非常少的生物，低至1/毫升，这导致假阴性结果。
上述技术的进一步局限性是，培养物中的细菌生长被出现在血液中的血清杀细菌剂抑制，这可能导致假阴性结果。
血液培养的还进一步局限性是，在感染的早期阶段的抗生素治疗可能抑制培养物中的细菌生长，这可能产生假阴性结果。
其它已知的技术如放射免疫分析(RIA)，酶联免疫吸附分析等是基于检测体液中的循环抗原，但是这些技术有许多局限性。
这些技术的一个局限性是它们需要复杂和精密的试验室设施。
RIA的另一个局限性是，它需要健康危害的放射性物质，并且还需要受培训人员操作所述放射性物质。
上述技术的还进一步局限性是试剂昂贵。
这些技术的进一步局限性是，进行测试需要最少4-5小时。
发明目的本发明的主要目的是提供一种制备凝集试剂的方法，该凝集试剂用于快速和早期检测可疑伤寒患者血清样品中的伤寒沙门氏杆菌。
本发明的另一个目的是提供一种制备凝集试剂的方法，其中所提出的试剂使得能在收集血清样品后3分钟内诊断伤寒。
本发明的还另一个目的是提供一种制备凝集试剂的方法，其中诊断伤寒疾病所需血清样品小至20微升。
本发明的进一步目的是提供一种制备凝集试剂的方法，其中所述试剂使得能通过简单的乳胶凝集技术检测伤寒细菌。
本发明的还进一步目的是提供一种制备凝集试剂的方法，其中所述试剂使得能特异地鉴定可疑伤寒患者血清样品中的伤寒沙门氏杆菌抗原。
本发明的还进一步目的是提供一种制备凝集试剂的方法，其中所述试剂使得能在感染的早期，甚至在发热开始后的1天或2天内诊断伤寒。
本发明的另一个目的是提供一种制备凝集试剂的方法，其中所述试剂是高度灵敏的。
本发明的还另一目的是提供一种制备凝集试剂的方法，因为它不需任何设备或试验室设施，该试剂使得能在野外条件下诊断所述疾病。
本发明的还进一步目的是提供一种制备凝集试剂的方法，该试剂不需任何专门受培训的人员进行测试。
本发明的还进一步目的是提供一种制备凝集试剂的方法，该试剂使得能够诊断被施用抗生素导致血液培养物分离为阴性的那些患者。
方法的描述根据本发明的优选实施方案，通过包括下述步骤的方法制备所述凝集试剂(a)制备抗体(免疫球蛋白)克隆并通过重组DNA技术表达对伤寒沙门氏杆菌特异的鞭毛蛋白基因序列。表达的重组蛋白通过亲和层析纯化。在兔中产生对抗该重组蛋白的超免疫血清。超免疫血清的免疫球蛋白部分通过硫酸盐铵沉淀分离。将沉淀的免疫球蛋白悬浮在50mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)中，透析并测定蛋白质含量。
(b)制备乳胶颗粒悬浮液以优选的比例1∶1取1％0.88至0.90μm大小的羧化乳胶颗粒和40mM 2-N吗啉代乙烷磺酸(2-N Morphilinoethane sulphonic acid，MES)缓冲液(pH5.5-6.0)于管中。在旋涡混合器上将它们混合约60秒并在约4℃10000rpm下离心10-12分钟。乳胶颗粒通过在旋涡混合器上混合约60秒，在pH5.5的20mM的MES缓冲液进一步洗涤两次，接着在约4℃10000rpm下离心10-12分钟。最后洗涤后，将乳胶颗粒悬浮于pH5.5的20mM的MES缓冲液中，并补足体积至与乳胶颗粒的起始体积相等。随后悬浮液用尖头超声仪在约5瓦超声60-120秒，优选90秒。在缓慢旋涡混合所述溶液的同时，将新鲜制备的于20mM的MES缓冲液(pH5.5)中的0.1M 1-乙基-3(3-二甲基-氨基-丙基)碳二亚胺(carbodimide)盐酸盐(EDC)溶液，以1∶1的优选比例取出，滴加到这种悬浮液中。在20-25℃的温度下将的述管慢慢上下(end-over-end)翻转约3小时。然后在约4℃的温度10000rpm下达10-12分钟，用20mM的MES缓冲液(pH5.5)洗涤三次。将乳胶颗粒重悬在MES缓冲液(20mM，pH5.5)中并用尖头超声仪在5瓦超声60-120秒。
(c)用抗体(免疫球蛋白)包被乳胶颗粒将步骤(a)中制备的免疫球蛋白按每毫升悬浮液0.6-1.0mg，优选0.8mg加到步骤(b)中制备的乳胶颗粒悬浮液中。然后在20-25℃的温度下将全混合物上下翻转18-20小时。包被反应通过加入1M甘氨酸(pH11.0)终止，以每毫升免疫球蛋白包被的乳胶颗粒0.06毫升的量取出。继续在20-25℃的温度下旋转约30分钟。包被的乳胶颗粒通过在约4℃的温度10000rpm下离心10-12分钟沉淀出来。沉淀块用洗涤缓冲液(50mM甘氨酸，pH8.5；0.03％曲通(triton)X-100和0.05％叠氮化钠)洗涤三次，在约4℃的温度10000rpm下达10-12分钟。最后将洗涤过的包被的乳胶颗粒重悬在储存缓冲液中(50mM甘氨酸，pH8.5；1.0％牛血清白蛋白；0.03％曲通X-100；0.1％叠氮化钠和0.01％硫柳汞)至终浓度1％，用尖头超声仪在5瓦超声约60秒并在4℃储存。
使用方法(a)取20-40μl(1到2滴)的测试血清，阳性和阴性对照置于载玻片上的三个不同位置(b)加10-2μl(1到2小滴)的乳胶试剂到测试血清中，阳性和阴性对照(c)用单独的木条小心混合反应物以避免置于分开位置的反应物混杂并旋转载玻片1-2分钟。
用试剂与测试样品和阳性对照混合的1-2分钟内出现凝集，清楚显示肉眼可见的颗粒凝块，表示阳性反应。凝集出现的速度和质量取决于存在的抗原的强度，从混合几秒种内出现的大凝块变化到相当慢形成的小凝块。阴性反应中，试剂不凝集，浑浊性或混浊性特征在整个测试过程中本质上仍然没有改变。
快速检测伤寒患者血清中伤寒沙门氏杆菌的所提出的凝集试剂的可靠性的试验室研究，用伤寒沙门氏杆菌试验室菌株；以及从可疑的伤寒病例中收集的被检验的培养和肥达氏阳性血清样品；以及用明显正常的健康个体的血清样品进行。结果表明93.00％的灵敏度和98.00％的特异性。
本发明现在将用工作举例说明，该实施例意思是作为说明性的实例，不是被限制性地采用以对本发明的范围起任何限制作用。
工作实施例用基因特异的引物通过聚合酶链反应(PCR)扩增对伤寒沙门氏杆菌特异的鞭毛蛋白基因序列。将扩增的PCR产物克隆在谷胱甘肽-S-转移酶(GST)载体中，然后表达。表达的蛋白质通过GST亲和柱层析纯化。通过Bradford方法测定纯化产物的蛋白质含量。在兔中产生对抗该蛋白质的超免疫血清。超免疫血清的免疫球蛋白部分通过硫酸铵沉淀分离。将沉淀的免疫球蛋白悬浮在1.0毫升磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.2)中，透析并测定蛋白质含量。取1.0毫升1％羧化乳胶颗粒和1.0毫升40mM MES缓冲液(pH5.5-6.5)置于2.0毫升微量离心管中。然后在旋涡混合器上混合它们60秒并在4℃的温度10000rpm下离心10-12分钟。乳胶颗粒通过在旋涡混合器上混合60秒并在4℃的温度10000rpm下离心10-12分钟，在2.0毫升20mM的MES缓冲液(pH5.5)中进一步洗涤两次。最后洗涤后，将乳胶颗粒悬浮于1.0毫升的MES缓冲液(20mM，pH5.5)中并用尖头超声仪在5瓦超声60-120秒。然后在缓慢涡旋所述溶液的同时，滴加1.0毫升新鲜制备的在MES缓冲液(20mM，pH5.5)中的0.1M 1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液。然后在20-25℃温度下慢慢上下翻转所述管3小时，接下来在4℃的温度10000rpm下10-12分钟用MES缓冲液(20mM，pH5.5)洗涤三次。将乳胶颗粒重悬在0.7毫升MES缓冲液(20mM，pH5.5)中并用尖头超声仪在5瓦超声60-120秒。将0.8mg免疫球蛋白加到乳胶颗粒中，并用MES缓冲液(20mM，pH5.5)将体积补足到1.0毫升。然后在20-25℃温度下将这上下翻转18-20小时。包被反应通过加入0.06毫升的1M甘氨酸(pH11.0)终止。继续在20-25℃的温度下旋转30分钟。包被的乳胶颗粒通过在4℃的温度10000rpm下离心10-12分钟沉淀出来。沉淀块用2.0毫升洗涤缓冲液(50mM甘氨酸，pH8.5；0.03％曲通X-100和0.05％叠氮化钠)在4℃的温度10000rpm下10-12分钟洗涤三次。将洗涤过的包被的乳胶颗粒重悬在储存缓冲液(50mM甘氨酸，pH8.5，1.0％牛血清白蛋白，0.03％曲通X-100，0.1％叠氮化钠和0.01％硫柳汞)中至终浓度1％，用尖头超声仪在5瓦超声60秒并在4℃储存。
应该理解，本发明易被本领域技术人员进行修饰、改变和适应性改变。意指这样的修饰、改变和适应性改变同样在本发明的范围内，所述范围被进一步设定在下面权利要求下。
权利要求
1.一种制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，该方法包括步骤(a)制备伤寒沙门氏杆菌的特异抗体(b)制备乳胶颗粒悬浮液(c)用抗体包被所述乳胶颗粒。
2.根据权利要求1的方法，其中通过重组DNA技术克隆并表达对伤寒沙门氏杆菌特异的鞭毛蛋白基因序列。
3.根据权利要求2的方法，其中通过亲合层析纯化表达的重组蛋白。
4.根据权利要求3的方法，其中在兔中培养针对所述重组蛋白的超免疫血清。
5.根据权利要求4的方法，其中通过硫酸铵沉淀分离所述超免疫血清的免疫球蛋白部分。
6.根据权利要求1的方法，其中，将沉淀的免疫球蛋白悬浮在磷酸盐缓冲液中，透析并测定蛋白质含量。
7.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中以优选比例1∶1取1％羧化的0.88至0.90μm大小的乳胶颗粒和pH 5.6至6.0的40mM 2-N吗啉代乙烷磺酸(MES)缓冲液。
8.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中在旋涡混合器上混合MES缓冲液中的乳胶颗粒悬浮液约60秒并在约4℃10000rpm下离心10至12分钟。
9.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中所述乳胶颗粒用pH 5.5的20mM MES缓冲液在约4℃10000rpm下10至12分钟进一步洗涤两次。
10.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中将洗涤过的乳胶颗粒悬浮于pH 5.5的20mM MES缓冲液中，并将体积补足至与乳胶颗粒的起始体积相等。
11.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中悬浮的乳胶颗粒用尖头超声仪在约5瓦下超声60-120秒，优选90秒。
12.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中在缓慢涡旋所述悬浮液的同时，将新鲜制备的在pH 5.5的20mM MES缓冲液中的0.1M 1-乙基-3(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，以1∶1的优选比例滴加到乳胶颗粒悬浮液中。
13.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中将EDC溶液与乳胶颗粒在20-25℃温度下慢慢上下翻转约3小时，并在约4℃的温度10000rpm下10至12分钟用20mM的MES缓冲液(pH 5.5)洗涤三次。
14.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中将乳胶颗粒重悬在MES缓冲液(20mM，pH 5.5)中并用尖头超声仪在约5瓦下超声60至120秒。
15.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中将步骤(a)中制备的免疫球蛋白按每毫升0.6至1.0mg，优选0.8mg，加到步骤(b)中制备的乳胶颗粒悬浮液中。
16.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中将乳胶颗粒和免疫球蛋白的悬浮液在约20至25℃温度下上下翻转18至20小时。
17.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中包被反应通过以每毫升免疫球蛋白包被的乳胶颗粒的溶液0.06毫升的量取出的1M甘氨酸(pH 11.0)终止。
18.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中所述包被的乳胶颗粒通过在约4℃的温度下10000rpm下离心10-12分钟沉淀出来。
19.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中将包被的乳胶颗粒的沉淀块用包含50mM甘氨酸，pH 8.5；0.03％曲通X-100和0.05％叠氮化钠的洗涤缓冲液；在约4℃的温度下10000rpm下10-12分钟洗涤三次。
20.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中将洗涤过的包被的乳胶颗粒悬浮在包含50mM甘氨酸pH8.5；1.0％牛血清白蛋白；0.03％曲通X-100；0.1％叠氮化钠和0.01％硫柳汞的储存缓冲液中，至1％的终浓度。
21.根据权利要求1的制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，其中将包被的乳胶颗粒的1％悬浮液用尖头超声仪在约5瓦下超声约60秒并在4℃储存。
22.一种制备如本申请中实质上描述并举例说明的凝集试剂的方法。
全文摘要
一种制备用于快速和早期检测伤寒的凝集试剂的方法，该方法包括步骤制备伤寒沙门氏杆菌的特异抗体，(b)制备乳胶颗粒悬浮液，(c)用抗体包被所述乳胶颗粒。
文档编号G01N33/569GK1742096SQ03825732
公开日2006年3月1日 申请日期2003年9月3日 优先权日2002年11月26日
发明者G·P·莱, G·S·阿伽瓦尔, S·K·沙尔玛, D·K·雅斯瓦尔, K·舍克哈尔, K·阿罗拉, V·K·查伍德哈里 申请人:国防科研与发展组织