专利名称：一种脂蛋白磷脂酶a2的测定试剂及试剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂及试剂的制备方法，特别是采用乳胶增强免疫比浊法检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。
背景技术：
脂蛋白憐脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2, Lp_PLA2)又被称为血小板活化因子乙酰水解酶(platelet activating factor_AH, PAF-AH),属于磷脂酶家族中PLA2的一种，是丝氨酸依赖的磷脂酶。人血浆Lp-PLA2主要由成熟的巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、肝细胞等分泌生成，并受炎性介质的调节；Lp-PLA2的主要作用是产生二十烷酸类炎性介质、参与磷脂重建及生物膜的稳定平衡、脂蛋白的代谢、细胞信号传递、宿主反应、促进机体坏死组织自体消失等。Lp-PLA2是反映血管炎症的特异性标记物，在低密度脂蛋白的氧化、促进动脉粥样硬化以及冠心病和卒中的形成等方面发挥重要作用。Lp-PLA2水平升高是预测冠心病和卒中风险的一种独立危险因子。其水平的增加被认为是增加患心脏病或脑卒中的机会。目前已经研制出多种Lp-PLA2抑制剂，有试验结果表明服用高剂量的抑制剂患者病灶处Lp-PLA2降低了 80%，服用低剂量的患者Lp-PLA2降低了 52%，提示降低其含量和活性可能会阻断或延缓斑块炎症的进程。从而提供给临床医生预防和治疗心脑血管事件的新靶点，为临床疾病的早期干预、临床应用治疗提供新思路新方向。目前检测Lp-PLA2常用的实验室方法有放射免疫学分析法(RIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、酶联免疫法(ELISA)，放射免疫学分析法(RIA)法检测耗时长(19 22h)，而且有放射性元素的污染，标记物稳定性差，废弃物难以处理而使其受到限制。化学发光免疫分析法(CLIA)是利用化学发光物质经催化剂催化和氧化剂氧化，形成一个激发态的中间体，这种激发态的中间体回到稳定基态时，发出光子，利用发光信号测量仪测量光子数，从而间接测定LP-PLA2的浓度。目前市场上有管式和板式两种试剂盒，但此法存在吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺直接标记抗体的发光效率低，标记物不稳定，这种直接标记法属于瞬间发光型，很难保证测试结果的稳定性和重复性，而且需要特殊的检测仪器。不便于常规实验室开展。而利用生物素-亲和素系统检测LP-PLA2的电化学发光免疫试剂盒，需要配套昂贵的全自动电化学发光检测仪，常规实验室无法开展，而且给患者带来不必要的费用，增加患者负担。酶联免疫法(ELISA)自动化程度不高，且受人为因素影响较大，重复性差，整个反应测定时间也很长(至少需要40分钟)。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足，提供一种脂蛋白磷脂酶A2(Cholyglycine, LP-PLA2)的检测试剂；所提供的试剂应具有准确度高、测定时间短(最多只需要10分钟，甚至更短)、重复性好，操作简单、适用于各种类型的全自动生化分析仪的特点；所提供的试剂制备方法应具有制作方便以及成本不高的特点。
本发明提供的技术方案是一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂，包括以下成份a、脂蛋白憐脂酶A2试剂I
缓冲液10-400mmoWL pH 值为 5-10
电解质 10-400mmol/L
表面活性剂0.01-10g/L
防腐剂2~4mmol/L
稳定剂4-5mmol/L
反应加速剂0.01-50g/L其余是纯化水该试剂I的pH值为7. 0-8. 0 ；b、脂蛋白憐脂酶A2试剂2
抗人LP-PLA2抗沐胶乳颗粒0,0001-0,05ml/ml
缓冲液50mmol./+LpH值为 6.0-8.5
防腐剂1.5-3 mmo 1/L
稳定剂3-5nunol/L其余是纯化水；所述抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒，其中的羧基胶乳微球的粒径为20_500nm ；C、液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品
缓沖植SO-lOOmraol/L pH 值为 7.2-8.0
防腐剂2-3moiol/L
稳定剂130-173nimol/L
脂蛋白磷脂酶A2 适量其余是纯化水；所述液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品包括5份形成LP-PLA2系列浓度的参考校准品；5份参考校准品中的LP-PLA2含量由低到高分别为1. 25ng/ml、2. 5ng/ml、5. 0ng/ml、10. 0ng/ml、20. 0ng/ml ;或者，所述液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品是单点高浓度的LP-PLA2参考校准品。所述缓冲液是磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(M0PS0)缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。
所述试剂I中的缓冲液浓度20-200mmol/L，pH值7. 0-8. O。所述反应加速剂是聚乙二醇或硫酸葡聚糖(DS-50 )。所述反应加速剂浓度优选O. 05_30g/L。所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、氯化钠中的一种或两种以上任意比例的混合。所述电解质是阴离子电解质或阳离子电解质。所述电解质优选阳离子中的氯化钠(NaCl )，浓度为50-200mmol/L。所述表面活性剂是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂。所述非离子表面活性剂是Theist、Tween、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚中的一种或两种以上任意比例的混合。所述表面活性剂浓度优选O. 5-lg/L。所述抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒的浓度为O. 002-0. 01ml/ml。一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂的制备方法，按照以下步骤进行I)脂蛋白憐脂酶A2试剂1:
按配方量将缓冲液、电解质、表面活性剂、反应加速剂、防腐剂、稳定剂以及纯化水混合均匀，调PH值至7. 0-8. O ；2)脂蛋白憐脂酶A2试剂2 (I)取羧基胶乳微球用缓冲液稀释成浓度为O. Olmg/ml的悬浮液；(2)按Iml的羧基胶乳微球悬浮液加20mgl_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDAC羧基活化剂)和40mg的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(NHS)的比例，加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，立即混匀后在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；(3)用缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，并将胶乳微球在纯化水中悬浮得羧基胶乳微球悬浮液，使其浓度为O. Olmg/ml ；(4)将抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体溶于缓冲溶液中，使抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体的蛋白质浓度为O. 25mg/ml ；(5)取步骤(3)中的羧基胶乳微球悬浮液Iml立即加入步骤(4)中的抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体Iml ;使该混合液中羧基胶乳微球、抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体和缓冲溶液的浓度分别为 O. 005mg/ml、0. 125mg/ml、25mmol/L ；(6)将混合物在37°C反应3小时，不断搅拌；(7)按Iml反应混合物加2. 5 μ I的乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应10_30分钟，不断搅拌；(8)离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用缓冲液稀释，使抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒浓度为O. 002-0. Olml/ml，然后加入稳定剂、防腐剂溶解混匀后即得脂蛋白磷脂酶Α2试剂2 ；3 )液体型LP-PLA2参考校准品
先按配方量将防腐剂、稳定剂及缓冲液混合并分成5份混合液，然后按照需要的LP-PLA2参考校准品浓度，将相应量的1000ng/ml的LP-PLA2纯品分别加入上述混合液中，获得形成系列浓度的5份参考校准品；5份参考校准品中的LP-PLA2含量由低到高分别为1.25ng/ml、2. 5ng/ml、5. Ong/ml、10. 0ng/ml、20. Ong/ml ;或者，按配方量将防腐剂、稳定剂及缓冲液混合后得混合液，然后在混合液中加入一定量的1000ng/ml的LP-PLA2纯品，获得单点高浓度的LP-PLA2参考校准品。例如，该参考校准品中的LP-PLA2含量为100. Ong/ml或500. Ong/ml ;使用时再用生理盐水稀释成多个不同浓度的参考校准品；这里没有特别的限制，只要制得的LP-PLA2参考校准品能与样品比较，能够测定样品中LP-PLA2的含量即可。所述离心处理采用离心机，离心机转速为15000转/分。本发明所提供的抗人LP-PLA2测定试剂的反应原理是样品中的抗人LP-PLA2与试剂中的抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒发生抗原-抗体反应，使反应液浊度增加，在一定范围内反应液浊度与样品中抗原的量呈线性关系，可使用生化分析仪或其它光学检测仪器在20-600nm波长处测定反应液吸光度值，反应液吸光度值与所测PCT浓度成正比。本发明的有益效果是所提供的采用乳胶增强免疫比浊法的抗人脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，通过将抗人LP-PLA2抗体与羧基胶乳微球结合，放大了抗人LP-PLA2抗原和抗体反应的表面积，具有准确性高(与化学发光免疫分析法的相关性R2为O. 9935-0. 9997)、重复性好、检测快速(从测定开始到得出结果最多只需要10分钟，甚至更短)的特点，能够在常规生化仪上进行大批量样本测定，大大提高了检测工作效率。该试剂的制备方法操作简便，原料易得(全部选用外购原料)，成本不高，适合各类医学研究单位以及常规实验室应用。


图1显示实施例1中通过本发明方法所得LP-PLA2试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的LP-PLA2测得值的相互关系。经回归分析y=l. 0012x+5. 7593 ；R2=0. 9935，显示出本实施例1与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。图2显示实施例2中通过本发明方法所得LP-PLA2试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的LP-PLA2测得值的相互关系。经回归分析y=0. 9999x+6. 7481 ；R2=0. 9982显示出本实施例2与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。图3显示实施例3中通过本发明方法所得LP-PLA2试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的LP-PLA2测得值的相互关系。经回归分析y=l. 0096x+9. 5773 ；R2=0. 9996显示出本实施例3与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。图4显示实施例4中通过本发明方法所得LP-PLA2试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的LP-PLA2测得值的相互关系。经回归分析y=l. 0037x+2. 8437 ；R2=0. 9997，显示出本实施例4与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。
具体实施例方式本发明检测试剂及校准品所需主要原料1、抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体，有许多商品化的抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体可供选择，如芬兰Dako公司、日本UNF公司；该抗体仅与人脂蛋白磷脂酶A2反应，与其它抗原无免疫交叉反应，可以是多克隆抗体或单克隆抗体，这里没有特别限制，只要能与胶乳微球偶联即可。其抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体可以是羊抗(即羊抗人脂蛋白磷脂酶A2 ;以下同)、也可以是兔抗、鸡抗或鼠抗。只要采用已知的免疫电泳法测定，该抗体只与人LP-PLA2之间呈现单一的沉定线，抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体的滴度大于或等于1. Omg/ml。2、胶乳微球，有许多商品化的纳米微球可供选择，如德国Merck公司、日本UNF公司、日本JSR公司和Thermo公司；其基本材质是聚苯乙烯或共聚苯乙烯，表面用羧基基团(COOH)修饰，也可不用作任何修饰，这里要根据选择抗体和微球的结合方法不同而选择不同的微球。如选择化学交联法(也可以采用物理吸附法)，则用表面经羧基、氨基、醛基等修饰的微球。本法优选羧基基团修饰的胶乳微球(羧基胶乳微球的粒径进一步优选为80nm-300nm)o3、脂蛋白磷脂酶A2 :购自芬兰DaKo公司，用于制备本试剂所需参考校准品，可以是天然脂蛋白磷脂酶A2蛋白，也可以是基因重组脂蛋白磷脂酶A2蛋白。本发明提供的LP-PLA2测定试剂的反应原理是样品中的LP-PLA2与试剂中的抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒发生抗原-抗体反应，使反应液浊度增加，在一定范围内反应液浊度与样品中抗原的量呈线性关系，可使用生化分析仪或其它光学检测仪器在540-600nm波长处测定反应液吸光度值，反应液吸光度值与所测LP-PLA2浓度成正比。下面将结合实施例详细说明本发明试剂，但这些实施例不应认为是限制本发明的定义。

实施例一—)脂蛋白憐脂酶A2试剂I
辚酸鉍二_ (缓冲液)30mmol/L
磷酸.氛钾(缓冲液)20mmol/L
吐温-20(M [M活性剂)1.O g/L
NaCL (电解质)180 OMidZL
PEG-6000(反应促进剂)18 g/L
lit钠(防腐剂)3 mmol/L
乙二胺闕乙酸二 _(稳定剂)5 mmol/L用纯化水800ml将上述原料溶解后，再补加纯化水定容至1000ml，然后用盐酸或氢氧化钠调PH至7. 2。二)脂蛋白磷脂酶A2试剂21.取80nm的羧基胶乳微球用50mmol/L、PH6. O的MES缓冲液稀释成O. Olmg/ml的
悬浮液；2.按Iml的羧基胶乳微球悬浮液加20mg EDAC和40mg的NHS (N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐)的比例，加入EDAC和NHS并立即混匀后在室温将混合物反应15-30分钟，不断搅拌；3.用50mmol/L、PH6. O的MES缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的NHS和EDAC，并将胶乳微球在纯化水中悬浮，得浓度为O. Olmg/ml的羧基胶乳微球悬浮液；4.将羊抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体溶于50mmol/L、PH8. 5的HEPES缓冲溶液中，使羊抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体的蛋白质浓度为O. 25mg/ml ；5.取步骤(3)中羧基胶乳微球悬浮液1ml，立即加入步骤(4)中羊抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体Iml ;此时该混合液中羧基胶乳微球、羊抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体和缓冲溶液的浓度分别为 O. 005mg/ml、0. 125mg/ml、25mmol/L ；6.将混合物在37°C反应3小时，不断搅拌；7.按Iml反应混合物加2. 5 μ I乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应20分钟，不断搅拌；8.用15000转/分离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用50mmol/L、PH7. 2的MOPS缓冲液稀释，使抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒浓度为O. Olml/ml ;然后加入牛血清白蛋白(稳定剂)3mm0l/L、3mm0l/L叠氮钠(防腐剂)溶解混匀后即得脂蛋白磷脂酶A2试剂2。三)液体型LP-PLA2参考校准品
权利要求
1.一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂，包括以下成份a脂蛋白磷脂酶A2试剂I
2.根据权利要求1所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂，其特征在于所述缓冲液是磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(M0PS0)缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。
3.根据权利要求2所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂，其特征在于所述试剂I中的缓冲液浓度20-200mmol/L，pH值7. 0-8. O。
4.根据权利要求3所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂，其特征在于所述反应加速剂是聚乙二醇或硫酸葡聚糖。
5.根据权利要求4所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂，其特征在于所述电解质是阴离子电解质或阳离子电解质。
6.根据权利要求5所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂，其特征在于所述表面活性剂是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂；所述非离子表面活性剂是Theist、Tween、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚中的一种或两种以上任意比例的混合。
7.根据权利要求6所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂，其特征在于所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、氯化钠中的一种或两种以上任意比例的混合。
8.根据权利要求7所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂，其特征在于所述抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒的浓度为O. 002-0. 01ml/ml。
9.权利要求1所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂的制备方法，按照以下步骤进1)脂蛋白磷脂酶A2试剂1:按配方量将缓冲液、电解质、表面活性剂、反应加速剂、防腐剂、稳定剂以及纯化水混合均匀，调pH值至7. 0-8.0 ；2)脂蛋白磷脂酶A2试剂2:(1)取羧基胶乳微球用缓冲液稀释成浓度为O.01mg/ml的悬浮液；(2)按Iml的羧基胶乳微球悬浮液加20mgl-乙基_(3_二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDAC羧基活化剂)和40mg的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(NHS)的比例，加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，立即混匀后在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；(3)用缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，并将胶乳微球在纯化水中悬浮得羧基胶乳微球悬浮液，使其浓度为O. 01mg/ml ；(4)将抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体溶于缓冲溶液中，使抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体的蛋白质浓度为O. 25mg/ml ；(5)取步骤(3)中的羧基胶乳微球悬浮液Iml立即加入步骤(4)中的抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体Iml ;使该混合液中羧基胶乳微球、抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体和缓冲溶液的浓度分别为 O. 005mg/ml、0. 125mg/ml、25mmol/L ；(6)将混合物在37°C反应3小时，不断搅拌；(7)按Iml反应混合物加2.5 μ I的乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应10-30分钟，不断搅拌；(8)离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用缓冲液稀释，使抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒浓度为O. 002-0. 01ml/ml，然后加入稳定剂、防腐剂溶解混匀后即得脂蛋白磷脂酶Α2试剂·2 ；3)液体型LP-PLA2参考校准品先按配方量将防腐剂、稳定剂及缓冲液混合并分成5份混合液，然后按照需要的LP-PLA2参考校准品浓度，将相应量的1000ng/ml的LP-PLA2纯品分别加入上述混合液中，获得形成系列浓度的5份参考校准品；5份参考校准品中的LP-PLA2含量由低到高分别为.1.25ng/ml、2. 5ng/ml、5. Ong/ml、10. 0ng/ml、20. Ong/ml ;或者，按配方量将防腐剂、稳定剂及缓冲液混合后得混合液，然后在混合液中加入一定量的1000ng/ml的LP-PLA2纯品，获得单点高浓度的LP-PLA2参考校准品，其LP-PLA2含量为50. Ong/ml 或 100. Ong/ml。
10.根据权利要求9所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂的制备方法，其特征在于所述离心处理采用离心机，离心机转速为15000转/分。
全文摘要
本发明涉及一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂及其制备方法。目的是提供的提供的试剂具有准确度高的特点；提供的制备方法具有制作方便的特点。技术方案是一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂，包括以下成份a、脂蛋白磷脂酶A2试剂1；b、脂蛋白磷脂酶A2试剂2；c、液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品；其制备方法1)脂蛋白磷脂酶A2试剂1均匀混合；2)脂蛋白磷脂酶A2试剂2(1)取悬浮液；(2)混合物反应；(3)得悬浮液；(4)调整浓度；(5)取(3)中的悬浮液加入(4)中；(6)反应；(7)加入乙醇胺；(8)离心处理；3)液体型LP-PLA2参考校准品按配方量混合，按含量排列或在混合液中加入纯品。
文档编号G01N33/68GK103033629SQ20121055688
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月12日
发明者陈开华, 其他发明人请求不公开姓名 申请人:元升生物科技(上海)有限公司