专利名称：烟草胶基制品中烟碱生物利用度的体外模拟检测方法
技术领域：
本发明涉及一种烟草胶基制品中烟碱生物利用度的体外模拟检测方法，通过该方法可以为烟草胶基制品的安全评价及质量控制提供技术支持。
背景技术：
随着吸烟与健康研究的不断深入，一些科学研究已表明，卷烟中危害人体的物质绝大多数是由烟草燃烧产生，并通过吸食进入人体的，非吸烟人群的被动吸烟也主要是由卷烟燃烧产生的测流烟气造成的，吸烟越来越受到社会各界的批评及限制。采取有效的戒烟方式并加以推广，对公共场所的禁烟、控烟将具有积极的意义。吸烟者对卷烟的依赖性源于对烟碱的依赖，如果单纯靠毅力戒烟，身体会由于突然缺失烟碱，而导致内循环和内分泌的失衡，人会出现易怒、心烦、焦虑、急躁、心慌、注意力无法集中等症状，使得很多人难以坚持下去，这在医学上被称为“戒断综合症”。尼古丁替代递减治疗是目前全球普遍采用的有效戒除吸烟瘾癖的手段，替代方式多种多样，市场常见的有戒烟口香糖、尼古丁透皮贴、尼古丁舌下含片、尼古丁鼻腔喷剂等。其中以口香糖的形式最受消费者欢迎，也是美国卫生组织唯一推荐的戒烟方法，已经在全球60多个国家推行。戒烟口香糖(烟草胶基制品)的包装、外形、色泽均与普通口香糖一致，由于在胶基基质中添加有烟草提取物或纯烟碱，使消费者经口摄取尼古丁而达到如同吸烟的效果。由于人体对烟碱的口腔吸收速度明显慢于吸烟的吸收速度，使咀嚼戒烟口香糖时血液中烟碱浓度的峰值比吸烟时大为降低，因此，使用戒烟口香糖只起戒烟作用，而不会上瘾。目前国内市场销售的戒烟口香糖类产品还比较少，关于该类产品中烟碱的释放研究也不充分，卫生行业多采用志愿者临床对照实验根据吸烟量减少情况、CO呼出量作为疗效评估指标。其质量检测与控制还缺少相关技术方法和统一标准。通过烟碱释放实验了解食用该类产品时烟碱的吸收情况(即生物利用度)，开展戒烟口香糖中烟碱咀嚼释放行为研究显得尤为必要。目前，对烟碱生物利用度的研究主要有两种方式一种是体内实验，检测人体食用戒烟口香糖后血液或尿液中的烟碱变化情况。该方法实验结果易受志愿者个体生理差异及消费烟草制品的习惯影响，实验不易控制且对人体伤害较大。另一种是体外实验，模拟人体咀嚼烟草胶基制品时烟碱的释放情况，自创装置进行研究。体外实验相对较为简单，可控性强，实验周期短，易于实现对烟碱释放的监测。

发明内容
本发明的目的正是针对目前烟草胶基制品中烟碱生物利用度检测方法的缺失或不足，提出了一种检测该类产品烟碱释放情况的方法，利用该方法能够模拟烟草胶基制品中的烟碱在人体口腔咀嚼过程中的释放情况并对释放量进行即时定量，进而检测烟草胶基制品中烟碱的瞬间释放速率以及累积释放程度，为该类产品的安全性评价和质量控制提供技术支持。
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本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
本发明的烟草胶基制品中烟碱生物利用度的体外模拟检测方法，具体步骤如下
1)、体外烟碱释放与收集创建模拟烟草胶基制品在人体口腔中烟碱释放情况的模型， 该模型包括人工唾液和模拟咀嚼机，即模拟人体在使用烟草胶基制品时的情况，使人工唾液在恒温条件下不断注入模拟咀嚼机，模拟咀嚼机通过上下对挤、转动挤压被测样品的方式实现样品和人工唾液的充分接触和咀嚼搅拌，促使样品中的烟碱等成分充分释放，并实时收集咀嚼过程中的烟碱释放液进行分析检测；
2)、收集液及残留样品中烟碱含量定量分析利用高效液相色谱仪实现对收集液及残留样品中烟碱含量的定量分析；
3)、绘制体外烟碱生物利用度曲线由烟碱定量结果计算烟碱累积释放率，由此绘制烟碱生物利用度曲线(利用Origin、SPSS、Excel软件绘制烟碱生物利用度曲线)。在本发明中，所述人工唾液组分包括三类化合物无机盐类化合物(包括氯化钠、 氯化钾、氯化钙、氯化镁等)，有机化合物(包括柠檬酸、葡萄糖等)，生物活性酶蛋白(粘蛋白、溶菌酶、淀粉酶等)。具体配方如下氯化钠0.85 mg/mL;氯化钾0.35 mg/mL ；氯化钙 0. 15 mg/mL ；磷酸二氢钾 0. 18 mg/mL ；氯化镁 0. 25 mg/mL ；柠檬酸 0. 06 mg/mL ；葡萄糖 0. 20 mg/mL ；尿素 0. 08 mg/mL ；粘蛋白(mucin) 2. 45 mg/mL ；溶菌酶(Iysozyme) 0· 60 units/mL ； 淀粉酶(σ-amylase》· 50 units/mL ；酸性磷酸酶(acid phosphatase)0. 01 units/mL。加入粘蛋白等活性物质前，PH值用盐酸或氢氧化钠调节至6. 2 7. 5的某一值，室温搅拌10 min后加入粘蛋白等活性物质，再室温搅拌30 min即完成配制。人工唾液可以按照上述配方自行配置，也可通过市场渠道购买。本人工唾液的有益效果是使用本发明所制的人工唾液与烟草胶基制品混合咀嚼后，能够模拟被测样品化学成份在口腔分泌物作用下的释放行为，与真实情况接近，为烟草胶基制品化学成份的提取搭建统一的平台，便于分析测定该类制品的化学成分及含量，进而客观地评价该制品的品质及特点。所用的高效液相色谱仪中的液相色谱参数如下色谱柱为C18反相色谱柱，流动相为甲醇和0.02 mol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液，流速0. 1 - 1 mL/min，柱温为30°C ；检测器为紫外检测器，最大吸收波长λ_= 254 nm。所述C18反相色谱柱可以为Waters XTerra RP C18色谱柱，也可以为Waters XTerra MS C18色谱柱或Kromasil C18色谱柱。所述模拟咀嚼机包括由圆柱形水浴循环箱和环绕该循环箱设置的环形水浴循环箱构成的测试腔，在圆柱形水浴循环箱上坐放有用于盛放人工唾液及测试物的平底小碗， 与电机转动轴相连接的转压圆盘通过吊装方式伸入测试腔内并与平底小碗碗底相对应，进液管和出液管设置在碗腔两侧，圆柱形水浴循环箱底面与气缸连接并可在气缸作用下升降。平底小碗的碗底设有颗粒状凸起，呈现一定的粗糙度，以利于测试物的转挤效果。平底小碗外壁为倒梯形结构，嵌放在圆柱形水浴循环箱的倒梯形内凹腔中，平底小碗内壁边缘为45°倾角。转压圆盘底面和平底小碗碗底面均涂覆有防粘涂层。进液管和出液管通过电磁阀分别与两个相同规格的蠕动泵相连接，用于添加或抽取人工唾液。所述转压圆盘和平底小碗的材质可以是不锈钢、聚四氟乙烯、环氧树脂、镀镍碳
4钢、尼龙棒等。本发明的具体操作是先打开恒温水浴循环系统，设置温度37°C，系统恒温后，开始测试动作。首先将戒烟口香糖样品放入平底小碗(即下咀嚼面)中，开启蠕动泵，向平底小碗注入一定量的人工唾液。开启气缸和电机，使咀嚼动作开始，气缸活塞伸长，将圆柱形水浴循环箱和小碗一同顶起并靠近转压圆盘(即上咀嚼面)，直到能给小碗中测试物施加一定的压力，并保持压力，此时转压圆盘在电机的带动下转动一定角度后停止，一次咬合磨压动作完成，气缸收缩；重复以上动作直至实验结束。测试过程中，进液蠕动泵定时、定量将新鲜恒温的人工唾液注入到小碗内，出液蠕动泵定时抽取人工唾液(咀嚼烟碱释放液)进行分析检测。到达系统设定时间后，电机停止转动，气缸活塞收缩，小碗下降，实验结束。此时可取出残留胶基样品，放入50 100 mL的锥形瓶中，加入少量正己烷，置于摇床上震荡15 min, 待胶基质样品完全溶解后，再向其中加入20 50 mL混合磷酸盐缓冲溶液，再次置于摇床震荡30 min。烟碱释放液和残留样品萃取液过0.45 μ m滤膜后，进入高效液相色谱仪进行定量检测，根据定量结果计算烟碱释放程度和速率。烟碱释放程度和速率通过烟碱随时间的累积释放率求得。烟碱累积释放率由一段时间的烟碱累积释放量除以样品总烟碱含量计算；样品总烟碱含量为测试时间内的烟碱释放总量与残留样品中烟碱含量的总和，也可以通过对未咀嚼的同款产品中烟碱含量的测定得出。进而根据需要绘制烟草胶基制品的烟碱生物利用度随时间变化曲线。本发明能够模拟烟草胶基制品中烟碱在人体口腔咀嚼过程中的释放情况，并对释放量和释放速率进行即时定量，可以检测烟草胶基制品的烟碱释放速率以及释放程度，为研究衡量该类产品质量安全和品质优劣提供具体技术和数据支持。该检测方法快速准确、 灵敏度高、重复性好，适用于各种规格戒烟口香糖的检测，便于推广。本发明设计的转压型模拟咀嚼机能够实现对胶基质食品的充分磨压咀嚼，并模拟人体口腔的恒温环境以及在咀嚼过程中不断分泌、吞咽唾液的状态，与人体食用戒烟口香糖的真实情况接近。设备配备有自动化电脑控制程序，易于操作，方法重复性好，检测周期短，适用于较大批量样品的快速分析，可在食品、医药等行业推广应用。


图1为本发明的检测流程图。图2为本发明中所用的转压型模拟咀嚼机结构示意图。图2中1.电机，2.出液管，3.转压圆盘，4.环形水浴循环箱，5.平底小碗，6. 气缸，7.支架，8.圆柱形水浴循环箱，9.进液管，10.测试腔。图3为高效液相色谱检测烟碱标准曲线。图4为实施例1条件下烟碱生物利用度曲线。图5为实施例2条件下烟碱生物利用度曲线。
具体实施例方式本发明以下结合附图做进一步说明
首先对检测装置及其使用方法结合图2予以描述该装置支架(7)上固定着气缸(6)、 电机(1)和环形水浴循环箱，气缸(6)的伸缩端与圆柱形水浴循环箱(8)相连，平底小碗(5)固定在圆柱形水浴循环箱之上，转压圆盘C3)与电机转轴相连，此外，进液管(9)和出液管( 通过支架伸入到环形水浴循环箱围绕的测试腔(10)内，固定在靠近平底小碗内侧边缘处。使用该装置时，设定恒温水浴循环系统温度为37°C，并保持整个测试过程中测试腔(10)内温度恒定。首先将戒烟口香糖样品放入平底小碗(5)中。开启蠕动泵，向平底小碗(即下咀嚼面)注入2 20 mL恒温37°C的人工唾液。开启气缸(6)和电机(1)，使咀嚼动作开始，气缸活塞伸长，将圆柱形水浴循环箱(8)和小碗一同顶起并靠近转压圆盘(3) (即上咀嚼面)，给小碗中测试物施加一定的压力，并保持压力，此时转压圆盘C3)在电机的带动下转动一定角度后停止，一次咬合磨压动作完成，气缸收缩；重复前面的动作直至实验结束。测试过程中，进液蠕动泵定时、定量向平底小碗(5)中注入新鲜的人工唾液，出液蠕动泵定时抽取人工唾液(咀嚼释放液)，蠕动泵的流速为0.5 20 mL/min。到达系统设定时间后，电机停止转动，气缸活塞收缩，平底小碗下降，实验结束。释放液和残留样品中的烟碱含量可通过高效液相色谱仪进行定量分析，根据定量结果计算烟碱释放程度和释放速率， 绘制戒烟口香糖烟碱生物利用度曲线。以下结合实施例对本发明做进一步描述 实施例1
测试样品Nicorette Classical 2mg Gum (UK)。人工唾液pH为6. 4，下咀嚼面小碗中人工唾液的起始量为10 mL，蠕动泵的流速为20 mL/min，测试共进行60 min。每隔5分钟抽取烟碱释放液和补充新鲜人工唾液，抽取和补充人工唾液的量均为5 mL;60 min时系统自动停止，此时出液蠕动泵抽取最后一份释放液。取出残留样品，放入50 mL锥形瓶中， 加入5.0 mL正己烷，盖上塞子，置于摇床上震荡15 min，待胶基质样品完全溶解后，再向其中加入20 mL混合磷酸盐缓冲溶液(pH = 6. 86)，再次置于摇床震荡30 min，分液取下层缓冲溶液层。释放液和残留样品萃取液中烟碱的检测采用高效液相色谱法，色谱参数如下色谱柱为Waters XTerra RP C18柱，流动相为甲醇和0. 02 mol/L的磷酸二氢钾溶液，体积比为23 77，(流动相中添加三乙胺，含量0.2 %，其作用是有效地改善烟碱色谱峰的拖尾，保留时间变大)，流速1 mL/min，柱温为30°C，进样量10 μ L，检测波长为254 nm。首先，称取一定量的烟碱标准品(99. 7%，Sigma)，采用流动相作溶剂，配制成浓度为 10. 0，20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，80.0，100.0 μ g/mL 的系列标准溶液，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析。以烟碱浓度为横坐标，以紫外检测器信号响应的峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线(见图3)。采用相同色谱条件对烟碱释放液和残留样品萃取液中烟碱含量进行测定，根据测定结果计算烟碱累积释放率，绘制该品种烟草胶基制品的烟碱生物利用度曲线(见图4)。从图4中可以看出，该产品的烟碱释放呈先快后慢趋势，60 min内其烟碱共释放了 83 %。实施例2
ΙΗ #ΒΠπ :Nicotinell Fruit 2mg Medicated Chewing Gum (Germany)。入工BilpH 为6. 4，小碗中人工唾液的起始量为5 mL，蠕动泵以2 mL/min的流速连续不断更新模拟咀嚼机内的人工唾液，测试共进行30 min。收集每2分钟的烟碱释放液，实验进行至观min 时关闭蠕动泵，30 min时系统自动停止，此时手动采集最后一份释放液。采用与实施例1中相同的方法处理残留样品。用高效液相色谱仪检测烟碱释放液和残留样品萃取液中的烟碱含量，色谱条件同实施例1。根据定量结果计算烟碱累积释放率，绘制该品种烟草胶基制品的烟碱生物利用度曲线(见图5)。从图5中可以看出，该产品的烟碱前8 min释放最快，释放量以约每分钟7. 5 %的速度增加；8 min到14 min释放速率明显减慢，释放量以约每分钟2. 2 %的速度增加；14 min到30 min释放速率进一步减慢，释放量以平均每分钟0. 9 % 的速度增加；30 min内该产品的烟碱共释放了 87. 14 %。对比实施例1，该品种烟草胶基制品的烟碱释放速率明显快于样品1，其原因可能与胶基的配方有关。实施例1中样品胶基的包埋缓释作用要强一些，烟碱释放曲线较为平缓，在咀嚼相当长的时间后，其胶基中仍然能够检测到烟碱残留。
权利要求
1.一种烟草胶基制品中烟碱生物利用度的体外模拟检测方法，其特征在于该方法具体步骤如下1)、体外烟碱释放与收集创建模拟烟草胶基制品在人体口腔中烟碱释放情况的模型， 该模型包括人工唾液和模拟咀嚼机，即模拟人体在使用烟草胶基制品时的情况，使人工唾液在恒温条件下不断注入模拟咀嚼机，模拟咀嚼机通过上下对挤、转动挤压被测样品的方式实现样品和人工唾液的充分接触和咀嚼搅拌，促使样品中的烟碱等成分充分释放，并实时收集咀嚼过程中的烟碱释放液进行分析检测；2)、收集液及残留样品中烟碱含量定量分析利用高效液相色谱仪实现对收集液及残留样品中烟碱含量的定量分析；3)、绘制体外烟碱生物利用度曲线由烟碱定量结果计算烟碱累积释放率，由此绘制烟碱生物利用度曲线。
2.根据权利要求1所述的烟草胶基制品中烟碱生物利用度的体外模拟检测方法，其特征在于所述人工唾液组分包括三类化合物无机盐类化合物，有机化合物，生物活性酶蛋白。
3.根据权利要求1所述的烟草胶基制品中烟碱生物利用度的体外模拟检测方法，其特征在于步骤3)中利用Origin、SPSS、Excel软件绘制烟碱生物利用度曲线。
4.根据权利要求1所述的烟草胶基制品中烟碱生物利用度的体外模拟检测方法，其特征在于所用的高效液相色谱仪中的液相色谱参数如下色谱柱为C18反相色谱柱，流动相为甲醇和0. 02 mol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液，流速0. 1- 1 mL/min,柱温为30°C ；检测器为紫外检测器，最大吸收波长Amax= 254 nm。
5.根据权利要求4所述的烟草胶基制品中烟碱生物利用度的体外模拟检测方法，其特征在于所述C18反相色谱柱是市售各品牌液相柱，可为Waters XTerra RP C18色谱柱，也可以为Waters XTerra MS C18色谱柱或Kromasil C18色谱柱。
全文摘要
一种烟草胶基制品中烟碱生物利用度的体外模拟检测方法，其特征在于该检测方法具体步骤如下1)体外烟碱释放与收集；2)收集液及残留样品中烟碱含量定量分析；3)绘制体外烟碱生物利用度曲线。本方法优点是采用自行设计的转压型模拟咀嚼机，能够很好的模拟人体口腔的咀嚼行为，合理配制的人工唾液以及对咀嚼腔体内人工唾液的不断更新，使烟草胶基制品中的烟碱能够充分释放，并能实时收集烟碱释放液进行检测，测试结果与人体使用该类产品的真实情况接近，可以为衡量烟草胶基制品的安全性及进行品质调控研究提供具体的数据支撑。本方法重复性好，灵敏度高，检测周期短，适用于烟草、食品、医药等行业的样品快速分析。
文档编号G01N30/02GK102507790SQ201110364439
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者宗永立, 张建勋, 张文娟, 慎龙舞, 曾波, 李鹏, 黄卫东 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院, 郑州嘉德机电科技有限公司