专利名称：茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法
技术领域：
本发明属于农学领域，具体涉及到一种茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(S0D酶)活性和膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量通常被作为植物抗逆性的生理鉴定指标而在逆境生理研究中得到广泛应用。SOD酶作为植物体内超氧自由基的清除剂，活性高低与膜稳定性呈正相关，反映的是茶树抵御外界不利因素的能力；MDA植物在逆境条件下会发生膜脂过氧化作用，MDA是膜脂过氧化的最终产物之一，其含量变化常用来反映植物所受胁迫的伤害程度。茶树在种植过程中，其抗性除了受种性抗性影响外，还受环境、气候、生产管理水平等因素的制约，而表现出抗性差异。即同一品种在不同的环境、气候、管理水平下其表现抗性有所不同。本方法以反映茶树抗性能力的SOD酶和茶树受胁迫程度的丙二醛为指标，从茶树种性抗性和表现抗性两个角度加以评价，所得结果与茶树抗性田间呈现结果一致，能较准确地从生理角度对茶树抗性进行评价。目前，有关茶树生理生化分析还没有统一的取样部位。罗军武、唐和平、黄意欢等在研究茶树不同抗寒性品种间保护酶类活性的差异时，选用的是成龄茶树的成熟春叶(自上至下第二叶)；王玉、洪永聪、丁兆堂等在利用茶树叶片解剖结构指数预测茶树种质材料的抗寒性研究中采用的是枝条顶端以下第二张成熟叶片；而魏鹏在研究茶树抗旱性部分生理生化指标时候采用的则是生长高度相近的新梢芽下第2叶和第3叶。本人通过对茶树无性系后代间抗性生理因子的差异进行研究，结果表明茶树抗性生理指标在茶树叶片中的分布以第3、第11位最为稳定，自第7位叶以后酶活性基本维持在一定水平，这表明茶树无性系后代不但能继承母本的形态特征，保持整齐化一的特点，在生理生化特性方面，本质上也具有一致性。然而茶树是多年生作物，各种生理指标与外界环境因素及栽培条件和管理水平密切相关，修剪、采摘、病虫害、光线、温度等都会对茶树生理生化因子造成一定的影响。此外，由于茶树本身具有的品种差异性，因而取样部位是否具有良好的代表性，在很大程度上决定了茶树生理检测的准确性。本方法采用未修剪、具有明显叶位变化的茶树枝条，自上而下采集木质化部位第一片、同一着生方向、无病虫害且完整的叶片能较好代表茶树的整体生理性状。
此外，在10°C 13°C休眠临界状态时，各品种茶树SOD酶活性和MDA含量基本维持同一水平，而后随温度的下降，因其抗性大小而有所分化。因而，根据其生理指标的变化趋势，可以对茶树种性抗性和表现抗性作一鉴定。

发明内容
针对现有茶树抗性生理鉴定的方法还不是很成熟的情况下，本发明提供了一种茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法，即以10°C 13°C茶树临界休眠状态时，选取未修 剪、具有明显叶位变化的茶树枝条，采集叶片，带回实验室后，进行种性抗性指标(S0D酶)和表现抗性指标(MDA)基础值检测；而后当气温降至0°C以下时，按上述方法对茶树种性抗性和表现抗性指标重新测定后，依指标变化趋势对茶树抗性进行评价。本发明通过以下技术方案得以实现
茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法，包括选穗、叶片采集、洗净、擦干、打孔取样、研磨、离心、抗性指标检测和抗性评价步骤；具体是在10°c 13°C茶树休眠临界状态时，选取未修剪的枝条，采集叶片，进行种性抗性指标SOD酶和表现抗性指标MDA基础值的检测；而后当气温降至(TC以下时，按上述方法对茶树种性抗性指标SOD酶和表现抗性指标MDA重新测定后，依指标数值的变化趋势对茶树抗性进行评价。茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法，所述的选穗、叶片采集为在10°C 13°C茶树休眠临界状态时，选取未修剪的茶树枝条，自上而下采集木质化部位第一片叶，装入塑料袋内封口，贮于底部置有冰块的保温箱内，带回实验室备用。茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法，所述的打孔取样、研磨、离心为选取的 叶片用蒸馏水冲洗两次，并用洁净滤纸吸干，用打孔器，避开叶片主脉打取Φ=0. 5cm圆形叶片作为SOD酶、丙二醛测试材料；按SOD酶和丙二醛检测方法分别称取O. 5g和O. 2g，分别添加2ml缓冲液和少许石英砂及适量不溶性吡咯烷酮，所述的SOD酶为O. lmol/1预冷的pH7. 8磷酸缓冲液，丙二醛为10%三氯乙酸，冰浴中迅速研磨成浆，SOD酶检测用3mlO. lmol/1的磷酸缓冲液，丙二醛检测用10%三氯乙酸8ml分次冲洗研钵，转入IOml离心管中，在4°C条件下以4500r/min离心IOmin,上清液在相同条件下二次离心后分别用于SOD酶、MDA检测。茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法，所述的抗性指标检测采用下列方法进行检测超氧化物歧化酶活性测定参考氮蓝四唑法测定；茶树叶片丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸法。茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法，所述的抗逆性评价为采用上述两次检测数值为纵坐标，以温度为横坐标绘制平面直线，依该直线的斜率大小判断抗性强弱，超氧化物歧化酶的斜率越小说明茶树种性抗性越强，反之则弱；丙二醛的斜率越大说明茶树表现抗性越强，反之则弱。本发明与现有技术相比的创新之处及其优势
I、茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法，减少了自然生长茶树室外低温情况下，人为观测误差，克服了气候、地理环境条件、管理水平等因素造成的抗性表现差异，从种性抗性和表现抗性两个方面对茶树抗寒性加以评价。2、木质化部位第一片茶树叶片具有相似的生理年龄，考虑到地理环境、光照、人为等因素的影响，本方法选用未修剪、具有明显叶位变化的茶树枝条，自上而下采集木质化部位第一片、同一着生方向、无病虫害且完整的叶片，SOD酶活性和丙二醛等生理指标比较稳定，能较好代表茶树整体水平。3、茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法，每年都可进行，不需要极端最低气温出现，就能进行，极大地缩短了鉴定周期。


图I为茶树抗寒性早期生理鉴定方法流程图。
具体实施例方式实施例茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法
茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法，在10°c 13°C茶树临界休眠状态时，选取未修剪、具有明显叶位变化的舒茶早、平阳特早、翠峰、凫早2号茶树枝条，采集叶片，带回实验室后，进行种性抗性指标(S0D酶)和表现抗性指标(丙二醛)基础值检测；而后当气温降至0°C时，按上述方法对茶树种性抗性和表现抗性指标重新测定后，依指标变化趋势对茶树抗性进行评价。主要包括选穗、叶片采集、洗净、擦干、打孔取样、研磨、离心、抗性指标检测、抗逆性评价9个步骤。I、舒茶早、平阳特早、翠峰、凫早2号四个茶树种，在10°C 13°C茶树临界休眠状态时，分别选取未修剪且具有明显叶位变化的茶树枝条，自上而下采集四种茶树的木质化部位第一片、同一着生方向、无病虫害且完整的叶片5g，装入塑料袋内封口，贮于底部置有冰块的保温箱内，带回实验室备用。
2、各种茶树的叶片用蒸馏水冲洗两次，并用洁净滤纸吸干。对其中一种茶树而言(其它茶树依次进行)，SOD酶、丙二醛测试材料用打孔器避开叶片主脉打取Φ=0. 5cm圆形叶片。按SOD酶和丙二醛检测方法分别称取O. 5g和O. 2g，添加2ml相应缓冲液(SOD酶为O. lmol/1预冷的pH7. 8磷酸缓冲液，丙二醛为10%三氯乙酸)和少许石英砂及适量不溶性吡咯烷酮，冰浴中迅速研磨成浆，SOD酶用3ml0. lmol/1的磷酸缓冲液，丙二醛用10%三氯乙酸8ml分次冲洗研钵,转入IOml离心管中，在4°C条件下以4500r/min离心IOmin,上清液在相同条件下二次离心后分别用于SOD酶、丙二醛检测。3、相关抗性指标检测采用下列方法进行测试超氧化物歧化酶(SOD)活性测定参考氮蓝四唑(NBT)法测定；茶树叶片丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸法。上述测定结果作为基础值。4、当气温继续下降至0°C以下时，重新按上述方法取样、洗净、研磨、测试，并以上述两次检测数值为纵坐标，以温度为横坐标绘制平面直线，依该直线的斜率大小判断4种茶树抗寒性强弱。结果如下种性抗性(指标为SOD酶)由强到弱为舒茶早 > 平阳特早 > 凫早2号〉翠峰，表现抗性(指标为丙二醛)由强到弱为凫早2号〉翠峰〉平阳特早 > 舒茶早。
权利要求
1.茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法，其特征在于包括选穗、叶片采集、洗净、擦干、打孔取样、研磨、离心、抗性指标检测和抗性评价步骤；具体是在10°c 13°C茶树休眠临界状态时，选取未修剪的枝条，采集叶片，进行种性抗性指标SOD酶和表现抗性指标MDA基础值的检测；而后当气温降至0°C以下时，按上述方法对茶树种性抗性指标SOD酶和表现抗性指标MDA重新测定后，依指标数值的变化趋势对茶树抗性进行评价。
2.根据权利要求I所述的茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法，其特征在于所述的选穗、叶片采集为在10°C 13°C茶树休眠临界状态时，选取未修剪的茶树枝条，自上而下采集木质化部位第一片叶，装入塑料袋内封口，贮于底部置有冰块的保温箱内，带回实验室备用。
3.根据权利要求I所述的茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法，其特征在于所述的打孔取样、研磨、离心为选取的叶片用蒸馏水冲洗两次，并用洁净滤纸吸干，用打孔器，避开叶片主脉打取Φ=0. 5cm圆形叶片作为SOD酶、丙二醛测试材料；按SOD酶和丙二醛检测方法分别称取O. 5g和O. 2g，分别添加2ml缓冲液和少许石英砂及适量不溶性吡咯烷酮，所述的SOD酶为O. lmol/1预冷的pH7. 8磷酸缓冲液，丙二醛为10%三氯乙酸，冰浴中迅速研磨成衆，SOD酶检测用3ml O. lmol/1的磷酸缓冲液,丙二醒检测用10%三氯乙酸8ml分次冲洗研钵，转入IOml离心管中，在4°C条件下以4500r/min离心IOmin,上清液在相同条件下二次离心后分别用于SOD酶、MDA检测。
4.根据权利要求I所述的茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法，其特征在于所述的抗性指标检测采用下列方法进行检测超氧化物歧化酶活性测定参考氮蓝四唑法测定；茶树叶片丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸法。
全文摘要
本发明公开了一种茶树种性抗性与表现抗性生理鉴定方法，在10℃～13℃茶树临界休眠状态时，选取未修剪、叶片着生数较多的茶树枝条，自上而下采集木质化部位无病虫害的第一片叶，带回实验室后，进行种性抗性指标和表现抗性指标基础值检测；而后当气温降至0℃以下时，再对茶树种性抗性和表现抗性指标重新测定，采用上述两次检测数值为纵坐标，以温度为横坐标绘制平面直线，依该直线的斜率大小判断抗性强弱。本发明减少了自然生长茶树室外低温情况下，人为观测误差，克服了气候、地理环境条件、管理水平等因素造成的抗性表现差异，能从种性抗性和表现抗性两个方面对茶树抗寒性加以评价，而且不需等待极端最低气温出现，极大地缩短了鉴定周期。
文档编号G01N21/31GK102703573SQ201210164428
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月24日 优先权日2012年5月24日
发明者夏先江, 张必桦, 张永利, 徐奕鼎, 方吴云, 王烨军, 苏有健, 黄建琴 申请人:安徽省农业科学院茶叶研究所