专利名称：大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉一种液相芯片及其制备方法与应用，尤其涉及一种大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片及其制备方法与应用，属于免疫技术及临床检测技术领域。
背景技术：
全球结直肠癌每年发病新病例数达94万，每年有近50万人死于结直肠癌。结直肠癌死亡居癌症死因第3位。大肠癌在我国也是最常见的恶性肿瘤之一，目前居恶性肿瘤发病率第4位。要提高结直肠癌患者的生存率和生活质量，早期发现、早期诊断和早期治疗是关键。
目前用于结直肠癌早期发现和诊断的主要方法是纤维内镜检查、大便潜血、直肠指检与直肠镜结合，还没有一种很好的无创伤的早期诊断和血液诊断指标和方法。
ELISA方法检测肿瘤标记物是临床检测常用的方法，但是其每次只能检测一个肿瘤标志物，而任何一种单一的肿瘤标志物诊断的灵敏度和特异度都不是很理想；因此，开发和使用联合检测以提高结直肠癌诊断的灵敏度和特异度以及阳性预测值是现实迫切需要解决的课题。
与以往的技术相比，当今发展的生物芯片技术可以实现把结直肠癌的肿瘤标志物一次性的联合检测的目的，目前产生的液相芯片技术是生物芯片的一种，它除了可以同时检测多种标记物以外，还具有较ELISA反应更加充分的液相反应特点，且具有省时省力，特异性强、灵敏度高，并且无创伤的优点。因此，研制和开发一种大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片是目前临床诊断的必需。

发明内容
针对现有肿瘤标记物ELISA检测，一次只能检测一个标记物的技术的不便和临床诊断的需要，本发明要解决的问题是提供一种大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片及其制备方法与应用，为结直肠癌的早期发现、早期诊断和早期治疗提供一种无创伤的，方便的，准确的临床检测方法以及检测试剂盒。
本发明的设计思路是选择结直肠癌的肿瘤标志物，制备针对每种肿瘤标志物不同抗原表位的抗体，分别与不同色号的微球偶联，制备出可对上述标记物进行一次性平行检测的液相芯片，在应用时，加入待检血清，使血清中的大肠癌肿瘤标记物被微球上的抗体捕获，再与生物素标记的二抗共同孵育，然后与链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PA)反应，通过Luminex100检测系统，实现对上述标记物一次性定量检测。
下面对本发明所述大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片进行详细的描述本发明所涉及的肿瘤标志物是在参考大量文献的基础上，并经过反复实验证实确有与结、直肠癌的发生有密切关系后选择的。
例如59.6％的结直肠癌患者血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)水平升高；在结直肠癌患者中糖链抗原242(carbohydrate antigen242，CA242)的阳性率达到了73.2％；有76.6％的患者催乳素(prolactin，PRL)水平增加；防御素α6(Defensin α6)的检测灵敏度为69.4％、特异度为83.3％、阳性预测值为91.9％；结肠癌分泌蛋白-2(Colon cancer secreted protein-2，CCSP-2)在II、III、IV期结肠癌、结肠腺癌以及结肠癌细胞系中表达增高78倍。
鉴于此，本发明确定了7种用于大肠癌诊断的肿瘤蛋白标记物，它们是癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖链抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)、糖链抗原72-4(carbohydrate antigen72-4，CA72-4)、糖链抗原242(carbohydrate antigen242，CA242)、催乳素(prolactin，PRL)、防御素α6(Defensinα6)、结肠癌分泌蛋白-2(Colon cancer secreted protein-2，CCSP-2)；并利用所述抗原制备或选择了其相应的抗体，它们分别是CEA抗体，CA19-9抗体，CA72-4抗体，CA242抗体，PRL抗体，防御素α6抗体，CCSP-2抗体。
本发明涉及的大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片，主要由微球，捕获抗体，检测抗体，链霉亲和素-藻红蛋白组成，其特征是，所述微球是26，36，46，56，66，76，86号微球；所述捕获抗体是CEA捕获抗体，CA19-9的捕获抗体，CA242的捕获抗体，CA72-4的捕获抗体，PRL的捕获抗体，防御素α6捕获抗体，CCSP-2捕获抗体；所述检测抗体是经活化的生物素标记的抗体；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与其相应的大肠癌蛋白标记物结合；其中所述CEA捕获抗体与26号微球形成偶联体，CA19-9捕获抗体与36号微球形成偶联体，CA72-4捕获抗体与46号微球形成偶联体，CA242捕获与56号微球形成偶联体，PRL捕获与66号微球形成偶联体，防御素α6捕获抗体与76号微球形成偶联体；CCSP-2捕获抗体与86号微球形成偶联体，以红色激光激发其球形基质上的红色分类荧光，依据其球形基质的色彩不同确定类型；所述检测抗体与链霉亲和素-藻红蛋白结合，以绿色激光激发藻红蛋白，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的大肠癌蛋白标记物的含量。
在上述的大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片中，所述捕获抗体分别是Mab cloneM111147(10-C10)，Mab clone M8073021(10c04)，MAb clone #CA72-4L(10-c004)，clone242II，MAb clone#M94194(10-P15)，n3378-08KNP-6 Pab anti-Hu E B，CCSP-2的抗体。
在上述的大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片中，所述检测抗体分别是MAbmouse anti-IgGl clone#M111146(10-c10)，Mab clone M8073021(10-c04)，clone#CA72-4M，MAb-c004-10mouse anti-IgGl，clone 242 IgG，MAb mouse anti-IgGlclone#M94193(10-P15)，N53378-08DNP-6 Pab rabbit-anti-Hu E B，CCSP-2的抗体。
检测抗体是用于识别肿瘤标记物的另一类抗体，其作用是将液相芯片结合的肿瘤标记物与检测荧光偶联，间接将结合的标记物的浓度与检测荧光的强度结合起来，从而实现对每种标记物的浓度进行定量测定。检测抗体通过生物素与avidin-R-PE结合，最后通过Luminex100检测系统对每一中肿瘤蛋白标记物进行定性定量检测。
本发明所述大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片的制备方法，其步骤是(1)捕获抗体与微球偶联形成偶联体分别选取26，36，46，56，66，76，86号羧基微球，洗涤；活化羧基微球；分别对应26，36，46，56，66，76，86号羧基微球顺序加入CEA捕获抗体，CA19-9的捕获抗体，CA242的捕获抗体，CA72-4的捕获抗体，PRL的捕获抗体，防御素α6捕获抗体，CCSP-2捕获抗体；混匀；室温下，以200～250rpm的转速放在摇床上孵育30～120分钟；重复1～2次；用PBS-TBN洗涤2～3次；得CEA捕获抗体与26号微球的偶联体，CA19-9捕获抗体与36号微球的偶联体，CA72-4捕获抗体与46号微球的偶联体，CA242捕获与56号微球的偶联体，PRL捕获与66号微球的偶联体，防御素α6捕获抗体与76号微球的偶联体；CCSP-2捕获抗体与86号微球的偶联体；计数每种微球偶联体的单位体积数，确定浓度，分别于4℃条件下避光保存；使用时，依据检测项目选择混合；(2)检测抗体与生物素的偶联将活化生物素按浓度1mg/ml溶解于二甲基亚砜中；另将待偶联并已经纯化的检测抗体分别按浓度1mg/ml溶解于0.1mol/L pH9.0的碳酸氢纳溶液中；以上述活化生物素液与待偶联的检测抗体溶液分别按1∶8的体积比混合，在室温下温育4～5小时；完成检测抗体与生物素的偶联。
本发明所述大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片在制备临床检测试剂中的应用。
将标记有探针的球形基质即捕获抗体与微球偶联的偶联体、报告分子即活化的生物素标记的检测抗体、链霉亲和素-藻红蛋白与样品混合，静置一段时间，探针可以与相应的目的分子特异性的结合，带有绿色报告荧光的报告分子也与目的分子特异性的结合，将混合物上样到Luminex 100，采用微流技术将微球偶联体分为单个细胞流，利用红、绿两束激光检测，获得光信号、处理数据就可完成对生物反应的实时、定量分析。
利用本发明的大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片，可以通过多种肿瘤标记物的平行检测和综合评价，建立一种数学模型，能明显提高大肠癌诊断的灵敏度和特异度，预计诊断大肠癌的灵敏度能达到90％，特异度能达到85％，阳性预测值能达到95％。
本发明的方法不但可以提高诊断的灵敏度和特异度，而且，由于将多个标记物放在一个反应体系中进行，不同的探针可以和不同的目的分子进行结合，反应后通过激光检测球形基质的色彩编号可以对不同的检测反应加以区分，因而更加省时省力，同时节约了检测成本。
具体实施例方式
实施例1捕获抗体与已知编号的微球的偶联1.分别选取26，36，46，56，66，76，86号羧基微球(Luminex公司)，用漩涡震荡器振荡微球悬液，时间20秒，使微球混合均匀。
2.分别取上述各号羧基微球大约2×103个，分别转移到离心管中，≥8000×g离心2min，沉淀羧基微球。
3.移走上清，加入100μl dH2O，用漩涡震荡器振荡20秒重悬微球，≥8000×g离心2min，沉淀羧基微球。
4.移走上清，加入80μl、100mM、pH＝6.2的磷酸二氢钠盐溶液，用漩涡震荡器振荡20秒重悬洗涤的羧基微球。
5.加入10μl、50mg/ml的Sulfo-NHS(用dH2O稀释)，用漩涡震荡器轻轻的振荡。
6.加入10μl、50mg/ml的EDC(用dH2O稀释)，用漩涡震荡器轻轻的振荡。室温孵育20min，每隔10分钟用漩涡震荡器轻振一次。≥8000×g离心2min，沉淀活化的羧基微球。
7.移走上清，加入250μl、50mM、pH＝5.0的MES，漩涡震荡器振荡20秒，重悬活化的羧基微球。≥8000×g离心2min，沉淀洗涤后的羧基微球。
8.重复步骤7两次，用50mM、pH＝5.0的MES洗涤2次。
9.加入100μl、50mM、pH＝5.0的MES，用漩涡震荡器振荡20秒。在混匀的微球中分别加入1μg捕获抗体(分别为Mab clone M111147(10-C10)，Mab cloneM8073021(10c04)，MAb clone #CA72-4L(10-c004)，clone 242II，MAbclone#M94194(10-P15)，n3378-08KNP-6 Pab anti-Hu E B，CCSP-2抗体)，用50mM、pH＝5.0的MES定容至500μl，用漩涡震荡器混匀。
10.在室温下放在摇床上(200rpm)孵育2小时。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。
11.移走上清，加入300μl PBS-TBN，漩涡震荡器振荡30秒。在室温下放在摇床(200rpm)上孵育30分钟。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。
12.移走上清，加入1ml PBS-TBN，漩涡震荡器振荡30秒。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。
13.重复步骤12一次，用PBS-TBN洗涤2次。
14.加入500μl PBS-TBN，重悬偶联好和洗涤好的微球，即得CEA捕获抗体与26号微球的偶联体，CA19-9捕获抗体与36号微球的偶联体，CA72-4捕获抗体与46号微球的偶联体，CA242捕获与56号微球的偶联体，PRL捕获与66号微球的偶联体，防御素α6捕获抗体与76号微球的偶联体；CCSP-2捕获抗体与86号微球的偶联体。
15.用细胞计数器计数微球的数量，换算出每种微球的浓度。
16.把偶联好的微球放在4℃避光保存，一般每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，依据检测项目选择混合。
实施例2检测抗体与生物素的偶联1.将活化生物素(Sigma公司)按浓度1mg/ml溶解于二甲基亚砜中。
2.将待偶联而已经纯化的检测抗体(分别为MAb mouse anti-IgGlclone#M111146(10-c10)，Mab clone M8073021(10-c04)，clone #CA72-4M，MAb-c004-10 mouse anti-IgGl，clone 242 IgG，MAb mouse anti-IgGl clone#M94193(10-P15)，N53378-08DNP-6 Pab rabbit-anti-Hu E B，CCSP-2的抗体)分别按浓度1mg/ml溶解于0.1mol/LpH9.0的碳酸氢纳溶液中。
3.将活化生物素液与待偶联的抗体溶液分别按1∶8的体积比混合，在室温下温育4h。
4.4℃条件下，在0.05mol/L，pH7.2的PBS透析24h，其中换液4次，以除去未结合的游离生物素。
5.加入0.02％NaN3于已结合有生物素的抗体溶液中，分别分装，在4℃避光保存，使用时，依据检测项目选择混合。
实施例3本发明所述大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片在临床检测中的应用(一)利用本发明所述大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片检测蛋白类肿瘤标志物的技术流程1.分别取出上述制备的针对每种肿瘤标志物的捕获抗体偶联微球各500个，按等比例混合，分装在96孔板中，每一个孔中含有各种捕获抗体偶联微球各500个，加入待检血清50μl，37℃孵育2小时。
2.≥8000×g离心2min，移走上清，加入300μl、1％PBS-BSA，漩涡震荡器振荡30秒，37℃孵箱封闭1个小时。
3.≥8000×g离心2min。移走上清，加入300μl PBS-TBN，漩涡震荡器振荡30秒。≥8000×g离心2min。
4.重复步骤3两次。
5.加入上述制备的生物素标记的检测抗体100μl，其中所述各种检测抗体事先按等比例混合，摇匀，37℃孵箱孵育30分钟。
6.≥8000×g离心2min，移走上清，加入300μl PBS-TBN，漩涡震荡器振荡30秒。≥8000×g离心2min。
7.重复步骤6两次。
8.加入链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)100μl，摇匀，37℃孵箱孵育30分。
9.≥8000×g离心2min，移走上清，加入300μl PBS-TBN，漩涡震荡器振荡30秒。≥8000×g离心2min。
10.重复步骤9两次。加入100μl PBS-TBN重悬微球，用于Luminex100进行检测。
11.Luminex100检测中，红色荧光定义微球的种类，绿色荧光测定SA-PE的平均荧光强度，根据标准曲线，确定待测样品的肿瘤标记物浓度。
(二)肿瘤蛋白标记物的标准曲线绘制分别根据各种肿瘤标记物的血清学浓度的范围，配备7种肿瘤标记物的标准品，每个标准品设6个稀释度，然后等比例混合，使各自的终浓度为所需的浓度，每孔50μl，反应步骤与待测样品的步骤完全相同，根据测定结果，运用Luminex100仪器分析系统提供的方程拟合各种肿瘤蛋白标记物的标准曲线，根据标准曲线，检测系统自动分析出各个待测样品的检测浓度，实现对7种肿瘤标记物的一次性定量分析。
结果表明本发明所述大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片一个孔就可同时检测7种肿瘤标记物，较传统的ELISA的效率提高了7倍。
权利要求
1.一种大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片，主要由微球，捕获抗体，检测抗体，链霉亲和素-藻红蛋白组成，其特征是，所述微球是26，36，46，56，66，76，86号微球；所述捕获抗体是CEA捕获抗体，CA19-9的捕获抗体，CA242的捕获抗体，CA72-4的捕获抗体，PRL的捕获抗体，防御素α6捕获抗体，CCSP-2捕获抗体；所述检测抗体是经活化的生物素标记的抗体；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与其相应的大肠癌蛋白标记物结合；其中所述CEA捕获抗体与26号微球形成偶联体，CA19-9捕获抗体与36号微球形成偶联体，CA72-4捕获抗体与46号微球形成偶联体，CA242捕获与56号微球形成偶联体，PRL捕获与66号微球形成偶联体，防御素α6捕获抗体与76号微球形成偶联体；CCSP-2捕获抗体与86号微球形成偶联体，以红色激光激发其球形基质上的红色分类荧光，依据其球形基质的色彩不同确定类型；所述检测抗体与链霉亲和素-藻红蛋白结合，以绿色激光激发藻红蛋白，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的大肠癌蛋白标记物的含量。
2.如权利要求1所述的大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片，其特征是，所述捕获抗体分别是Mab clone M111147(10-C10)，Mab clone M8073021(10c04)，MAb clone#CA72-4L(10-c004)，clone 242 II，MAb clone#M94194(10-P15)，n3378-08KNP-6 Pabanti-Hu E B，CCSP-2的抗体。
3.如权利要求1所述的大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片，其特征是，所述检测抗体分别是MAb mouse anti-IgG1 clone#M111146(10-c10)，Mab clone M8073021(10-c04)，clone#CA72-4M，MAb-c004-10 mouse anti-IgG1，clone 242 IgG，MAb mouseanti-IgG1 clone#M94193(10-P15)，N53378-08DNP-6 Pab rabbit-anti-Hu E B，CCSP-2的抗体。
4.权利要求1所述大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片的制备方法，其特征是(1)捕获抗体与微球偶联形成偶联体分别选取26，36，46，56，66，76，86号羧基微球，洗涤；活化羧基微球；分别对应26，36，46，56，66，76，86号羧基微球顺序加入CEA捕获抗体，CA19-9的捕获抗体，CA242的捕获抗体，CA72-4的捕获抗体，PRL的捕获抗体，防御素α6捕获抗体，CCSP-2捕获抗体；混匀；室温下，以200～250rpm的转速放在摇床上孵育30～120分钟；重复1～2次；用PBS-TBN洗涤2～3次；得CEA捕获抗体与26号微球的偶联体，CA19-9捕获抗体与36号微球的偶联体，CA72-4捕获抗体与46号微球的偶联体，GA242捕获与56号微球的偶联体，PRL捕获与66号微球的偶联体，防御素α6捕获抗体与76号微球的偶联体；CCSP-2捕获抗体与86号微球的偶联体；计数每种微球偶联体的单位体积数，确定浓度，分别于4℃条件下避光保存；使用时，依据检测项目选择混合；(2)检测抗体与生物素的偶联将活化生物素按浓度1mg/ml溶解于二甲基亚砜中；另将待偶联并已经纯化的检测抗体分别按浓度1mg/ml溶解于0.1mol/L pH9.0的碳酸氢纳溶液中；以上述活化生物素液与待偶联的检测抗体溶液分别按1∶8的体积比混合，在室温下温育4～5小时；完成检测抗体与生物素的偶联。
5.权利要求1所述大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片在制备临床检测试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片，主要由微球，捕获抗体，检测抗体，链霉亲和素－藻红蛋白组成，其中所述捕获抗体分别与相应的各号微球形成偶联体，以红色激光激发其球形基质上的红色分类荧光，依据其球形基质的色彩不同确定类型；所述检测抗体是经活化的生物素标记的抗体；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与其相应的大肠癌蛋白标记物结合；所述检测抗体与链霉亲和素－藻红蛋白结合，以绿色激光激发藻红蛋白，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的大肠癌蛋白标记物的含量。本发明还公开了所述大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片在制备临床检测试剂中的应用。
文档编号G01N33/531GK1766615SQ200510044899
公开日2006年5月3日 申请日期2005年10月11日 优先权日2005年10月11日
发明者高雪芹, 张华宁, 韩金祥 申请人:山东省医药生物技术研究中心