专利名称：基于连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学微量检测技术，具体涉及一种基于连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪。它采用近红外波长的半导体激光器，通过连续光多光子激发待测的微量物质，并实现荧光检测。
背景技术：
高效毛细管电泳(high-performance capillary electrophoresis，HPCE)是近十几年来发现的一种新型分离分析技术，具有分离效率高、分析时间短和进样量小等优点，且容易实现自动化，操作简单，广泛用于多肽和蛋白质、环境食品、DNA序列分析和单细胞检测。
HPCE，由于电泳的有效体积和进样量小，对检测器有更高的要求，故检测技术成为HPCE发展的关键。目前应用较多的检测方法有UV吸收、激光诱导荧光(Laser-induced fluorescence，LIF)、质谱和电化学检测等方法。
LIF是所有检测方法中灵敏度最高的一种方法，已达到单分子检测极限，LIF成为HPCE分析中的热点之一。同时常用的LIF方法也面临一些问题大多数生命物质在可见光区激光激发下不产生荧光，需要荧光探针标记；紫外光可以激发生命活性物质产生荧光，但紫外光的光毒性、光降解和光漂白又不利于单细胞分析和在体分离检测。
近年来，多光子激发荧光(Multi-photon Excitation，MPE)技术在细胞化学成像和氨基酸、蛋白质、神经递质等生命活性物质分析中的应用倍受重视。多光子激发具有激发体积小，光损伤和光毒性小，背景噪声低等特点。将多光子荧光激发技术和毛细管电泳技术联用，能发挥多光子激发荧光的优点，在分析化学和生命科学领域开展更多的应用研究。1997年Song等人(见Song J M，Inoue T，et al.Highly sensitive detection using laser two-photon excitedfluorescence in capillary electrophoresis.Journal of chromatography A，1997，765351-319)最先将毛细管电泳和多光子激发荧光技术结合起来，在amol(10-18mol)检测了Coumarine(7-anino-4-methyl coymarine)和DDCS(7-Diethy Aminocoumarine-3-acidsuccinimidyl ester)。Shear等人(Shear J，Brown E B Webb W.Mutiphoton-excitedfluorescence of fluoregen-labeled neurotransmitters.Analytical Chemistry，1996，68(10)1778--1783)曾用多光子系统研究荧光标记的神经递质，探究囊泡的分泌，探测极限在1000个分子以下。他们所用的光源是锁模飞秒激光器。但是，昂贵的飞秒锁模激光器限制了多光子激发荧光技术的推广。

发明内容
本发明的目的在于提供一种能克服现有技术缺陷，基于连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪。它具有检测灵敏度高、成本低和噪声低的特点。
本发明提供的一种基于连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪，它由激发光源、毛细管电泳部分、荧光检测部分和数据处理四部分构成，其中毛细管电泳部分由检测池，毛细管和直流高压电源组成。本系统基本工作过程是激光器采用半导体激光器，用于提供激发光源，实现双光子激发，发射的激光经过二向色镜和全反射镜的两次反射后进入物镜，物镜将光束聚焦成一点，照射在毛细管的检测出口使待测物质实现双光子激发；激发所产生的荧光同时被物镜所收集，在全反射镜反射，透过二向色镜，经带通滤光片组过滤后，荧光到达光电倍增管，光电倍增管将荧光信号放大后送给数据采集卡，再传送给计算机加以处理完成。
本发明为生物、医学和化学等学科提供一种经济的检测手段，适合微量物质检测，特别适合于生物体内荧光基团的检测。它采用近红外的连续光光源，实现多光子激发；荧光信号检测方法采用柱后检测法。本发明具有检测灵敏度高、成本低、噪声低和操作简单的特点。实验证明，柱后检测方法更适合连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪，并且检测极限从10-6M提高到10-9M，具体的试验数据说明见具体实施方式
部分。


图1为柱上和柱后检测的比较示意图，(a)柱上检测图(b)柱后检测图；图2为本发明的结构示意图；图3为不同的浓度由高到低依次检测所得到荧光峰值结果；图中，(a)10-2mol/l、(b)10-3mol/l、(c)10-4mol/l、(d)10-5mol/l、(e)10-6mol/l、(f)10-7mol/l、(g)10-8mol/l；图4为丁基Rhodamine B和Rhodamine B的分离图；a)10-3M丁基Rhodamine B的电泳谱图；b)10-4M Rhodamine B的电泳谱图；c)混合样品的分离。
具体实施例方式
如图1所示，现有的激发荧光——毛细管电泳检测仪采用的是柱上激发，柱上检测法，见图1(a)；本发明采用柱后激发，柱后检测方法，见图1(b)。
如图2所示，本发明的连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪由激发光源、毛细管电泳部分、荧光检测部分和数据处理部分构成。各部分分别介绍如下激光器采用半导体激光器5，提供激发光源，实现双光子激发。
毛细管电泳部分由缓冲池1、毛细管2、检测池4和直流高压电源10构成，其作用是提供电场，驱动待测物质泳动，实现物质的高效分离，本系统检测采用柱后检测。
荧光检测部分由物镜3，光电倍增管7、二向色镜12、全反射镜11和带通滤光组6构成；二向色镜12功能是对长波长的近红外激光反射，而对于物镜收集的短波长的荧光而言，则完全透射；带通滤光组6则过滤掉反射的近红外光，让短波长的荧光通过；光电倍增管实现探测并放大荧光信号。
数据处理部分由数据采集卡8和计算机9构成，负责采集和分析荧光信号，实现定性和定量分析。
本发明采用光源是价格低的半导体激光器，发射激光波长是近红外光，经过二向色镜12和全反射镜11的反射后进入物镜3，光束因物镜3的会聚作用而聚焦成一点，照射在毛细管的检测出口中心。待测的微量物质经过手动进样后，在电场力作用下由高电势流向低电势，由于不同的物质的电荷特性不同，因而所受的电场力不同，故泳动的速度就不同，导致物质到达检测出口的时间不同，进而实现空间上的分离。当待测物质达到检测出口时，在激光的照射下实现双光子激发。激发所产生的荧光同时被物镜3所收集，在全反射镜11反射，透过二向色镜12，经带通滤光片组6过滤后，只让荧光通过并到达光电倍增管7，光电倍增管将荧光放大后送给数据采集卡8，最后传送给计算机加以处理完成。
利用本发明提供的检测仪可以作定性和定量分析。
1定性分析因为不同物质，其激发荧光波长不同，和它们的电荷特性各异，受到电场力不等，在毛细管中流动速度大小不一，所以到达检测窗口的时间顺序有先有后。只要我们选用合适的带通滤光片，结合对检测时间的分析就可得出待测物质的不同组分。
2定量分析同一种物质，在毛细管中的运动速度相同，但是它的浓度的不同，导致在检测窗口照射时，浓度高的受激而产生荧光的几率就大(对一定范围内的浓度而言)，最后我们检测到的信号就要强。同一种物质不同浓度我们可以通过比较检测到的信号强度得出信号强度高的对应浓度高，反之，浓度低的信号强度低。最后与标准样品比较就可以得出该样品浓度的准确值。
实例上述检测仪的构成部件中，物镜3采用Olympus-CK40倒置荧光显微镜，半导体激光器5采用激光器HTYG-081，其波长为808nm，带通滤光片组6由440DCLP，BP590和D605/90组成，光电倍增管7采用R5070光电倍增管探测器，数据采集卡8采用fNIRI数据采集卡，计算机9采用赛扬800计算机，直流高压电源10采用±30KV/0.3mA直流高压电源。
采用上述实例中的荧光检测仪进行了下列实验，其实验过程、结果及分析如下1配制不同浓度的Rhodamine B溶液10-2mol/l；10-3mol/l；10-4mol/l；10-5mol/l；10-6mol/l；10-7mol/l；10-8mol/l。分别进行测量，得出本系统的线性工作区间范围7×10-7-8×10-4mol/L。具体结果如下图3，对不同浓度样品的检测结果表明，浓度高的检测结果值就大。2对10-6mol/l和10-9mol/l样品进行柱上检测和柱后检测，两种检测方式比较得出(如表1)柱后检测方式的灵敏度较高，背景噪声略低。
表1.对10-6mol/l和10-9mol/l两种浓度样品的柱上和柱后检测比较柱上检测 柱后检测 柱后检测/柱后检测峰值(10-6mol/l)3.4 26.5 7.8峰值(10-9mol/l)--5.4--备注--表示检测不出来3如图4所示，对10 M丁基Rhodamine B和10-4M Rhodamine B及其混合后的样品测量结果分析相互比较，我们的实验结果准确可信。图4的试验条件如下电泳条件硼砂缓冲溶液(10mM，PH9.0)；丁基Rhodamine B10-3M，Rhodamine B 10-4M；毛细管65cm×75I.D.；分离电压18KV；虹吸进样，高度10cm，10s。其中图a是10-3M丁基Rhodamine B的电泳谱图；图b是10-4M Rhodamine B的电泳谱图；图c是混合样品的分离谱图。
权利要求
1.一种基于连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪，由激光器、毛细管电泳部分、荧光检测部分和数据处理部分构成，所述毛细管电泳部分由检测池，毛细管和直流高压电源构成，其特征在于所述激光器采用半导体激光器(5)，用于提供激发光源，实现双光子激发，发射的激光经过二向色镜(12)和全反射镜(11)的反射后进入物镜(3)，物镜(3)将光束聚焦成一点，照射在毛细管(2)的检测出口使待测物质实现双光子激发；激发所产生的荧光被物镜(3)所收集，在全反射镜(11)反射，透过二向色镜(12)，经带通滤光片组(6)过滤后，荧光通过并到达光电倍增管(7)，将荧光放大后送给数据采集卡(8)，再传送给计算机(9)加以处理完成。
全文摘要
本发明公开了一种基于连续光的多光子激发毛细管电泳荧光检测仪。激光器采用半导体激光器，用于提供激发光源，实现双光子激发，发射的激光经过二向色镜和全反射镜的反射后进入物镜，物镜将光束聚焦成一点，照射在毛细管的检测出口使待测物质实现双光子激发；激发所产生的荧光被物镜所收集，在全反射镜反射，透过二向色镜，经带通滤光片组过滤后，荧光通过并到达光电倍增管，将荧光放大后送给数据采集卡，再传送给计算机加以处理完成。本发明为柱后检测法，特别适合于生物体内荧光基团的检测。具有检测灵敏度高、成本低、噪声低和操作简单的特点，其检测极限从10
文档编号G01N21/64GK1544922SQ20031011136
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月10日 优先权日2003年11月10日
发明者骆清铭, 曾绍群, 陈 胜 申请人:华中科技大学