专利名称：一种检测赭曲霉毒素a的试剂盒及其检测方法
技术领域：
一种检测赭曲霉毒素A的试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域，用于对粮食，饲料及其食品中赭曲霉毒素A(简称OTA)含量的检测。
背景技术：
赭曲霉毒素A(OTA)是真菌曲霉ochraceous和几种Penicillium真菌产生的一种毒素。OTA已经被证明对动物及人的肾产生损害，也是一种致癌物质，霉菌毒素引起的中毒大多通过被霉菌污染的粮食，油料作物以及发酵食品等引起，而且霉菌毒素中毒往往表现为明显的地方性和季节性，临床表现较为复杂，有急性中毒、慢性中毒以及致癌、致畸和致突变等。OTA在大多数谷物中均可分离到，包括大麦、小麦、燕麦、玉米、咖啡豆等，以这些谷物作为饲料的家禽也会受到污染，因此为了保障人们的健康，开展食品中OTA的卫生检测研究是很有必要的。
第56次FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会(JECFA)会议对OTA进行了危险性评价，得出的结论是体内和体外试验显示OTA都具有遗传毒性，考虑到小麦、大麦和黑麦等谷物是摄入OTA主要的食物品种，决定制定这些食物中OTA的限量标准，会议认为这些食物及其制品中OTA限量为5μg/kg。到目前为止，已有11个国家制定了食品(1-50μg/kg)和饲料(100-1000μg/kg)中的OTA的限量标准，主要是欧洲国家，我国尚无粮食中的OTA限量标准。
因而作为国际食品安全评价机构的JECFA很少能得到我国的污染监测和暴露量评估数据，使我们始终处于被动地位。另外对于食品、农副土特产品、保健品等出口到欧盟市场，其检验检疫必须符合有关OTA、黄曲霉、污染农药等食品安全规定的要求，在这方面我国产品的出口已遭受了很多的损失，而且进口方面，也迫切要求建立一个完善、方便的检测手段。因此，尽快建立高灵敏的OTA的检测，积极开展OTA的研究是当务之急。
目前赭曲霉毒素A的测定方法有多种，如薄层色谱法TLC(灵敏度为10μg/ml)，高效液相色谱法HPLC(灵敏度为10μg/ml)， 免疫荧光染色法(灵敏度0.025μg/ml)，但由于费时，灵敏度低，仪器设备昂贵，操作复杂且不适用于大批量样品的检测等缺点，已被逐步淘汰。酶联免疫测定法ELISA(灵敏度为2.5ng/ml)，由于其特异性强，灵敏度高，操作简便，不需直接接触毒素，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。尽管如此，检测的灵敏度和试剂的稳定性还无法达到要求，致使无法实际应用，所以目前为止没有一个国产的试剂盒面市。
时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)是上世纪八十年代初发展起来的新的免疫测定技术。时间分辨荧光免疫分析法其原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，其一端和镧系元素结合，另一端和抗体分子上的自由氨基联接，制成EU3+标记抗体，它与待测样品中的抗原结合成免疫复合物。理想情况下，测定复合物中镧系元素的荧光强度就能确定样品中抗原的量，但实际上这种复合物的荧光强度相当弱，只有再加入一种增强溶液(Enhancement solution)，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)重新形成微胶囊，在紫外等光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，即可确定样品中抗原的量。

发明内容
本发明的目的在于提供一种检测OTA的试剂盒及其检测方法，用于对粮食，饲料及其食品中OTA含量的检测。
本发明的技术方案该检测OTA的试剂盒是由1、96或48孔包被板，2、缓冲液，3、赭曲霉毒素A标准，4、赭曲霉毒素A的抗体冻干品，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液，7、增强液所组成。
本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)来检测OTA。采用TRFIA的技术主要有两个方面特异性多克隆抗体的制备，利用抗原免疫家兔，获得含有抗体的血清，经过生化提纯分离免疫球蛋白；第二，EU3+标记抗体的制备。
测定方法为测定的基础是标记免疫反应。包被有OTA-BSA的微孔板，加入OTA标准或已处理好的样品到各自的微孔中、再加入OTA抗体，振荡反应，游离的OTA与微孔板上的OTA-BSA竞争OTA抗体，洗涤液洗涤，没有连接的OTA抗体在洗涤步骤中被除去。加入EU3+-羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的EU3+-羊抗兔抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中抗原的量。
本发明的有益效果该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到1ng/ml以上。


图1检测赭曲霉毒素A的试剂盒示意图。1、96或48孔包被板，2、缓冲液，3、赭曲霉毒素A标准，4、赭曲霉毒素A的抗体冻干品，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液，7、增强液。
图2OTA-TRFIA标准曲线图。
具体实施例方式
实施例1制备试剂盒和检测玉米样品OTA是典型的半抗原，故在免疫反应中具有反应原性，但需与大分子物质结合后才有免疫原性，OTA中的羧基为活性基团，可与蛋白质的氨基结合。因此可用碳二亚胺法，使OTA与大分子蛋白KLH结合，以合成的OTA-KLH作为人工合成的免疫抗原进行动物免疫。
OTA-KLH抗原的制备1、用1ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解1-2mg OTA；2、用1ml的0.13mol/L NaHCO3偶联缓冲液溶解1-2mg KLH载体蛋白；3、取0.4-0.8mg OTA的溶液加到KLH的溶液中；4、溶解2-4mg碳二亚胺(EDC)于1mL双蒸水，并取50-100μL加入到上述混合液中，室温作用2小时(避光)；5、离心后取上清液上柱(Sephadex G-25)分离，进行紫外扫描检测。
多克隆赭曲霉毒素A抗体的制备1.选取4周大的，体重约1.5Kg的健康新西兰大白兔。OTA是一种半抗原，将OTA和KLH相连接作为抗原。
2.油包水抗原乳化剂的制备用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂1.2ml混合2mgOTA-KLH，用匀浆器混合2小时。将制好的乳化剂滴入盛有冷水的烧杯中，一油滴状态能完整地停留在水面上，而不扩散，表明是稳定的。
3.免疫兔子及抽血先将兔子背部的毛小心剪去，然后取600μl制备好的油包水抗原乳化剂，多位点地进行皮下注射，使抗原能缓慢扩散，每隔1～2周免疫一次，共需六次，在免疫3～4次后，从兔子的耳缘静脉抽血约1ml，离心10min后，得血清可进行鉴定。合格后稀释、分装、冻干备用。
Eu3+-羊抗兔抗体的制备取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体1-2ml，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH8.5缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260)，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L。取500-1000μl稀释后的羊抗兔抗体加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/L Tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)层析，A280监测收集蛋白峰，稀释分装备用。
包被板固相抗原制备将OTA-BSA用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH9.6缓冲液稀释至10mg/L的包被液，96(或48)孔微孔板各孔加100μl，4℃放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，加150μl含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。
试剂的配制(1)标准赭曲霉毒素A(OTA)(0ng/ml，0.1ng/ml，1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml)，从OTA纯品中稀释得到，稀释液为甲醇∶水＝7∶3。
(2)缓冲液8mmol/L NaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50μmol/L二乙烯三胺
(3)五乙酸(DTPA)、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3的Tris-HCl pH7.8。
(4)洗涤液14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2％NaN3的50mmol/LTris-HCl pH7.8。
(5)增强液的配制1升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmol β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)，50μmol三正辛基氧化膦(TOPO)，1ml曲拉通X-100(TritonX-100)。
试剂盒提供的试剂每一个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下(1).1×96孔板(8条×12孔，可以拆分为单孔)包被有OTA-BSA。
(2).6×OTA标准液，1.0ml/瓶，标准液浓度为0，0.1，1，10，100，1000ng/ml。
(3).1×OTA抗体冻干品，用时0.5ml蒸馏水溶解。
(4).1×EU3+-羊抗兔抗体冻干品，用时0.5ml蒸馏水溶解。
(5).1×增强液15ml。
(6).1×洗涤液30ml，用时以蒸馏水1∶25稀释。
(7).1×缓冲液30ml，实验室应自备的试剂甲醇。
70％甲醇溶液30ml蒸馏水或去离子水和70ml纯甲醇混合制备70％甲醇溶液。
蒸馏水或去离子水。
测定之前注意事项1.使用之前将所有试剂回升至室温(18-30℃)。
2.使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3.如果样品量大建议使用多通道移液器。
4.在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。
5.取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-8℃。
具体检测步骤如下先将样品进行处理将玉米样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液12.5ml(甲醇∶水＝7∶3)。加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸。取1ml滤液用1ml蒸馏水或去离子水进行稀释，备用。
取OTA-BSA板条，加入50μl的OTA标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加缓冲液1∶20稀释的OTA抗体50μl，移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，25℃振荡1小时，洗涤液洗三次，加缓冲液1∶20稀释的EU3+-羊抗兔抗体100μl，25℃振荡1小时，用洗涤液洗六次，加200μl增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的OTA含量，见表1和图2，该例的样品中OTA浓度为0.23ng/ml。
表1

实施例2制备试剂盒OTA-KLH抗原的制备同实施例1。
多克隆赭曲霉毒素A抗体的制备同实施例1。
Eu3+-羊抗兔抗体的制备取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体1ml，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH9.0缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260)，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L。取500μl加入含0.2mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，28℃磁力搅拌反应16小时。反应液经用80mmol/LTris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sephadex-G50柱(1×40cm)层析，收集蛋白峰，稀释分装备用。
包被板固相抗原制备同实例1。
试剂的配制1.标准赭曲霉毒素A(OTA)(0ng/ml，0.1ng/ml，1ng/ml，10ng/m1，100ng/ml，1000ng/ml)，从OTA纯品中稀释得到，稀释液为甲醇∶水＝7∶3。
2.缓冲液8mmol/L NaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50μmol/L DTPA、0.1ml/LTween-20和0.1％NaN3的Tris-HCl pH7.8。
3.洗涤液14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-20和0.2％NaN3的50mmol/LTris-HCl pH7.8。
4.增强液的配制1升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmol β-NTA，50μmol TOPO，1ml Triton X-100。
试剂盒提供的试剂每一个盒中的试剂足够进行48个测量，盒中的材料如下(1).1×48孔板(4条X 12孔，可以拆分为单孔)包被有OTA-BSA。
(2).6×OTA标准液，1.0ml/瓶，标准液浓度为0，0.1，1，10，100，1000ng/ml。
(3).1×OTA抗体冻干品，用时0.5ml蒸馏水溶解。
(4).1×EU3+-羊抗兔抗体冻干品，用时0.5ml蒸馏水溶解。
(5).1×增强液15ml。
(6).1×洗涤液30ml，用时以蒸馏水1∶25稀释。
(7).1×缓冲液30ml，实施例3制备试剂盒OTA-KLH抗原的制备1.用二甲基甲酰胺(DMF)溶解2mg OTA；2.用0.13mol/L NaHCO3偶联缓冲液溶解2mg KLH载体蛋白；3.取0.8mg OTA的溶液加到KLH的溶液中；4.溶解4mg碳化二亚胺(EDC)于双蒸水，并取100μL加入到上述混合液中，室温作用2小时(避光)；5.离心后取上清液上柱(Sephadex G-25)分离，进行紫外扫描检测。
多克隆赭曲霉毒素A抗体的制备与实施例1相同，略。
Eu3+-羊抗兔抗体的制备取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体2ml，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH8.5缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260)，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L。取1000μl加入含0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/LTris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)层析，A280监测收集蛋白峰，稀释分装备用。
固相抗原制备与实施例1相同。
试剂的配制与实施例1相同。
试剂盒提供的试剂与实施例1相同。
实验室应自备的试剂与实施例1相同。
测定之前注意事项同实施例1。
具体检测步骤同实施例1。
实施例4试剂盒提供的试剂与实施例1相同，用于检测大麦样品。
具体检测步骤如下先将大麦样品进行处理将大麦样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液12.5ml(甲醇∶水＝7∶3)。加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸。取1ml滤液用1ml蒸馏水或去离子水进行稀释，备用。
取OTA-BSA板条，加入50μl的OTA标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加缓冲液1∶20稀释的OTA抗体50μl，移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，25℃振荡1小时，洗涤液洗三次，加缓冲液1∶20稀释的EU3+-羊抗兔抗体100μl，25℃振荡1小时，用洗涤液洗六次，加200μl增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的OTA含量，见表2和图2，该例的样品中OTA浓度为0.17ng/ml。
表2

实施例5试剂盒提供的试剂与实施例1相同，用于检测血液样品。
具体检测步骤如下先将血液样品进行处理取0.5ml血液加0.5ml甲醇的水溶液(甲醇∶水＝7∶3)进行稀释，备用。
取OTA-BSA板条，加入50μl的OTA标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加缓冲液1∶20稀释的OTA抗体50μl，移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，25℃振荡1小时，洗涤液洗三次，加缓冲液1∶20稀释的EU3+-羊抗兔抗体100μl，25℃振荡1小时，用洗涤液洗六次，加200μl增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的OTA含量，见表3和图2，该例的样品中OTA浓度为0.14ng/ml。
表3

权利要求
1.一种检测赭曲霉毒素A的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征是由96或48孔包被板(1)，缓冲液(2)，赭曲霉毒素A标准(3)，赭曲霉毒素A的抗体冻干品(4)，铕标记的羊抗兔抗体(5)，洗涤液(6)和增强液(7)所组成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/LpH9.6 Na2CO3-NaHCO3的缓冲液将OTA-BSA稀释至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各孔加100μl，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150μl含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的赭曲霉毒素A标准(3)，从OTA纯品中稀释得到，稀释液为甲醇∶水＝7∶3，共6瓶，OTA浓度分别为0ng/ml，0.1ng/ml，1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的赭曲霉毒素A的抗体冻干品(4)，用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂1.2ml混合2mgOTA-KLH，用匀浆器混合2小时，制得油包水抗原乳化剂，取600μl制备好的油包水抗原乳化剂，在新西兰大白兔身上多位点地进行皮下注射，在免疫3～4次后，可进行鉴定，血清合格后稀释、分装、冻干备用。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的铕标记的羊抗兔抗体(5)，将购得的羊抗兔抗体，经PD-10柱转换缓冲条件至pH9.0，收集蛋白峰，取已转换的羊抗兔抗体加入Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸，反应过夜，反应液经柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中的铕标记的羊抗兔抗体(5)，取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体1-2ml，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH8.5-9.0缓冲液，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L，取500-1000μl稀释后的羊抗兔抗体加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-30℃磁力搅拌反应16小时，反应液经用80mmol/L Tris-HClpH7.8缓冲液平衡的Sephadex-G50柱(1×40cm)层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的缓冲液(2)8mmol/L NaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3的50mmol/L Tris-HCl pH7.8；洗涤液(6)14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2％NaN3的50mmol/L Tris-HCl pH7.8；增强液(7)1升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmolβ-萘甲酰三氟丙酮，50μmol三正辛基氧化膦和1ml曲拉通X-100。
8.一种用权利要求1所述的试剂盒检测赭曲霉毒素A的方法，其特征是取包被有OTA-BSA的微孔包被板，加入OTA标准或处理好的样品到各自的微孔中，再加入OTA抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加铕标记的羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加增强液振荡后测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的OTA含量。
9.根据权利要求8所述的检测赭曲霉毒素A的方法，其操作为取包被有OTA-BSA的微孔包被板，加入50μl的OTA标准或处理好的样品到各自的微孔中，加50μl以缓冲液(2)作稀释剂，1∶20稀释OTA抗体，25-37℃振荡0.5-1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液(2)1∶20稀释的100μl EU3+-羊抗兔抗体，25-37℃振荡0.5-1小时，用洗涤液洗六次，加200μl增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的OTA含量。
10.根据权利要求8所述的检测赭曲霉毒素A的方法，其中的样品处理，谷物样品处理将谷物样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液12.5ml，提取液为甲醇∶水＝7∶3，加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸，取1ml滤液用1ml蒸馏水或去离子水进行稀释，备用；血液样品处理取0.5ml血液加0.5ml甲醇的水溶液，甲醇∶水＝7∶3，进行稀释，备用。
全文摘要
一种检测赭曲霉毒素A的试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域，用于对粮食，饲料及其食品中赭曲霉毒素A(OTA)含量的检测。本发明配制的试剂盒，采用TRFIA检测OTA，测定的基础是标记免疫反应。微孔板包被有OTA－BSA，加入OTA标准或样品，再加入OTA抗体。游离的OTA与微孔板上的OTA－BSA竞争OTA抗体，没有连接的OTA抗体被洗涤除去，加入EU
文档编号G01N33/547GK1614422SQ20041006538
公开日2005年5月11日 申请日期2004年11月27日 优先权日2004年11月27日
发明者陶文沂, 金坚, 黄飚, 张莲芬, 时瑾 申请人:江南大学