专利名称：一种提高单分子荧光成像清晰度的方法及其装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及荧光光谱成像技术，特别是一种提高单分子荧光成像清晰度的方法及其装置。
背景技术：
在上世纪九十年代单分子科学的形成与发展使得人们能够在原子、分子尺度上观察和操纵微观物质世界。在单分子水平进行光学测量，可以揭露被大量分子系综平均掩盖的各个分子活动特性。基于单分子高清晰度的荧光成像用于分子探针和染料荧光标记是研究分子扩散、基因重组、蛋白质动力学过程等问题的重要手段和技术。实现单分子荧光成像普遍采用光学共聚焦显微实验系统进行测量，然而由于单分子荧光的辐射起伏(取决于分子的三重态特性及分子周围电子受体俘获电子的能力)以及较低的信噪比使得单分子荧光成像较为模糊，造成丢失一些局部区域的荧光信息，满足不了高清晰度荧光成像的要求。

发明内容
本发明提供一种提高单分子荧光成像清晰度和方法，该方法可以解决由于分子荧光辐射起伏以及信噪比较低而造成的单分子荧光成像模糊的问题。为解决上述问题，本发明采用的技术方案是
一种提高单分子荧光成像清晰度的方法，采用皮秒脉冲激光器产生激光，利用函数信号发生器输出正弦波形的调制电压信号控制声光调制器对激光进行强度调制，用调制后的激光扫描照射单分子样品，使用单光子探测器接收单分子样品发出的荧光光子，单光子探测器对入射荧光光子响应，并通过光电转化为一个标准的逻辑电脉冲输出信号，逻辑电脉冲信号输入到锁相放大器，同时将函数信号发生器的同步正弦波形调制电压信号输入锁相放大器，对逻辑电脉冲输出信号进行解调，得到被测的荧光光谱信号并对荧光光谱信号进行成像。通过调制和解调的过程，只容许包含荧光信号的调制谐波信号成分得到放大， 而抑制了其他频率的背景信号，即通过压缩噪声带宽有效降低量子噪声，提高了光谱成像信号的信噪比。本发明还提供一种实现上述方法的装置，所述的提高单分子荧光成像清晰度的方法的装置，包括皮秒脉冲激光器声光调制器、三维纳米平移台、单光子探测器、函数信号发生器、锁相放大器和计算机数据采集成像与控制系统，函数信号发生器与声光调制器连接， 皮秒脉冲激光器与声光调制器相连接，皮秒脉冲激光器输出的激光经过声光调制器进行强度调制后由一个二向色镜反射后通过显微镜物镜聚焦于样品分子上，分子受激发产生的荧光由显微镜物镜收集，通过二向色镜进入单光子探测器转化为逻辑电脉冲信号，单光子探测器和函数信号发生器一起连接锁相放大器，对逻辑电脉冲信号进行解调，计算机数据采集成像与控制系统分别与锁相放大器、三维纳米平移台以及单分子探测器连接。本发明利用强度调制激发光场，实现对单分子荧光光子进行强度调制，利用锁相放大器解调后的模拟信号消除了光子计数的量子涨落，提高了信噪比，实现高清晰度的单分子荧光成像。


图1为实现本发明所述方法的装置结构示意图2 (a)为分子荧光的光子计数光谱；(b)为解调后的分子荧光光谱。图3 (a)为单分子荧光的光子计数成像；(b)为解调后的单分子荧光成像。图4 (a)为一个单分子的荧光光子计数成像的三维立体图像；(b)为解调后的单分子荧光成像的三维立体图像。图5为扫描程序和荧光光子计数原理图。图中1-皮秒脉冲激光器，2-声光调制器，3-三维纳米平移台，4-单光子探测器， 5-函数信号发生器，6-锁相放大器，7-计算机数据采集成像与控制系统。
具体实施例方式以下以SR染料分子样品为例，结合附图对本发明所述的方法和装置进行进一步的详细描述。样品制备首先要根据实验要求薄膜的厚度来配制聚合物PMMA的浓度。将清洗干净的盖玻片放在勻胶机的托盘上，打开勻胶机电源开启真空泵将玻片吸附在托盘上，将配制好的包含有PMMA和SR染料的甲苯溶液滴到盖玻片上，开启勻胶机的启动按钮勻胶机将以事先设定好的转数旋转，根据要求样品薄膜的厚度通常设定转速为800-3000转/分钟， 根据样品浓度的不同还需要调节旋转时间(如分钟)。将旋涂有聚合物的样品玻片标号之后，放入到真空烘干箱中抽好真空后升温到PMMA玻璃点温度之上(大约为315 K)，进行淬火处理以消除残留的溶剂、氧气及舒缓旋涂技术对聚合物薄膜造成的影响，3小时之后关闭真空烘干箱电源让其自然冷却到室温温度。淬火处理后的样品具有更好的光稳定性和更长的光漂白时间。本发明所述的提高单分子荧光成像清晰度的方法的装置，如图1所示，包括皮秒脉冲激光器1、声光调制器2、三维纳米平移台3、单光子探测器4、函数信号发生器5、 锁相放大器6和计算机数据采集成像与控制系统7。本发明可通过多种公知的仪器实现，具体实施方式
中采用的仪器是皮秒脉冲激光器(picoQuant，PDL808型)，声光调制器 (Crystal ^Technology，3080-122 型)，三维纳米平移台(Tritor 200/20 SG)，单光子探测器 (SPCM-15)，函数信号发生器(Agilent，33250A型)，锁相放大器(SRS SR844)，计算机数据采集成像与控制系统(Ni 6251数据采集卡、LabVIEW程序)。函数信号发生器5与声光调制器2连接，皮秒脉冲激光器1与声光调制器2相连接，皮秒脉冲激光器1输出的激光经过声光调制器2进行强度调制后由一个二向色镜反射后通过显微镜物镜聚焦于样品分子上，分子受激发产生的荧光由显微镜物镜收集后通过二向色镜进入单光子探测器4转化为逻辑电脉冲信号，单光子探测器4和函数信号发生器5 一起连接锁相放大器6，对逻辑电脉冲信号进行解调，计算机数据采集成像与控制系统7分别与锁相放大器6、三维纳米平移台3以及单分子探测器4连接。采用皮秒脉冲激光器产生激光，利用函数信号发生器输出正弦波形的调制电压信号控制声光调制器对激光进行强度调制，用调制后的激光扫描照射单分子样品，使用单光子探测器接收单分子样品发出的荧光光子，单光子探测器对入射荧光光子响应，并通过光电转化为一个标准的逻辑电脉冲输出信号，逻辑电脉冲信号输入到锁相放大器，同时将函数信号发生器的同步正弦波形调制电压信号输入锁相放大器，对逻辑电脉冲输出信号进行解调，得到被测的荧光光谱信号并对荧光光谱信号进行成像。分子样品置于三维纳米平移台3上，计算机数据采集成像与控制系统7与三维纳米平移台3相连，计算机数据采集成像与控制系统7输出电压信号控制三维纳米平移台3 的扫描。单光子探测器4与计算机数据采集成像与控制系统7连接，通过数据采集卡的计数端子对分子荧光进行光子计数(图2 (a)所示)和通过LabVIEW程序进行分子荧光的光子计数成像(图3 (a)所示)。单光子探测器4和函数信号发生器5 —起连接到锁相放大器 6对单分子荧光光子信号进行解调解调，将解调信号输入到OT数据采集卡进行模拟采集和成像，锁相放大器6与计算机数据采集成像与控制系统7相连，记录解调后的荧光光谱(图 2 (b)所示)和通过LabVIEW程序进行成像(图3 (b)所示)。扫描程序和荧光光子计数原理如图5所示(基于NI6251板卡)。函数信号发生器5 (Agilent，33250A)输出的正弦波调制信号(30kHz，4. OVpp)加载到声光调制器2的驱动模块上，对皮秒脉冲激光器(40MHz)输出的激光进行强度正弦波调制，被调制后的激光经显微镜物镜聚焦后照射分子样品，显微镜物镜(100 X，油浸)收集分子发出的荧光，单光子探测器收集入射荧光单光子信号(大约10kHz)，并输入锁相放大器 6 (积分时间为30ms)对信号进行解调，计算机记录解调后的分子荧光信号。采用频率为30kHz正弦调制电压作为激光调制信号，对激光进行调制。图2 (a) 和(b)分别为单分子荧光的光子计数光谱和调制解调后的分子荧光光谱，从图2 (a)中可
以看到单分子荧光的平均光子计数#大约为9K，光子计数起伏M/大约为3K，对应荧光
信号起伏=1/3 ；从图2 (b)中可以看到单分子荧光解调后的平均信号V大约为
3.6mV，起伏^1T大约为0.3mV，那么荧光信号起伏ΛΙ7/Ρ =1/15，即分子荧光强度起伏由光子计数光谱的1/3减小为解调处理后的1/15。显微镜物镜的空间分辨率约为0. 3 μ m，在图3中选择的扫描步长为100 nm,扫描的像素为100 X 100，在x-y平面的扫描面积为10 μπι X 10 μ m。图3 (a)和(b)分别为单分子荧光的光子计数成像和解调后的单分子荧光成像，成像位置为相同样品的同一区域，光子计数成像的性噪比SNR大约为8，解调后的单分子荧光成像的性噪比SNR大约为 40，信噪比改善了 5倍。在图4中选择的扫描步长为25 nm，扫描像素为40 X 40，在χ-y平面的扫描面积为1 μπι X 1 μπι。图4 (a)和(b)分别为同一个单分子的荧光光子计数成像的三维立体图像和解调后的荧光成像的三维立体图像，从图4 (a)中可以看到光子计数的起伏较大，而采用本技术通过解调处理后的荧光成像更为平滑。
权利要求
1.一种提高单分子荧光成像清晰度的方法，其特征在于采用皮秒脉冲激光器产生激光，利用函数信号发生器输出正弦波形的调制电压信号控制声光调制器对激光进行强度调制，用调制后的激光扫描照射单分子样品，使用单光子探测器接收单分子样品发出的荧光光子，单光子探测器对入射荧光光子响应，并通过光电转化为一个标准的逻辑电脉冲输出信号，逻辑电脉冲信号输入到锁相放大器，同时将函数信号发生器的同步正弦波形调制电压信号输入锁相放大器，对逻辑电脉冲输出信号进行解调，得到被测的荧光光谱信号并对荧光光谱信号进行成像。
2.实现如权利要求1所述的提高单分子荧光成像清晰度的方法的装置，包括皮秒脉冲激光器(1)、声光调制器(2)、三维纳米平移台(3)、单光子探测器(4)、函数信号发生器(5)、 锁相放大器(6)和计算机数据采集成像与控制系统(7)，其特征在于函数信号发生器(5) 与声光调制器(2)连接，皮秒脉冲激光器(1)与声光调制器(2)相连接，皮秒脉冲激光器(1) 输出的激光经过声光调制器(2 )进行强度调制后由一个二向色镜反射后通过显微镜物镜聚焦于样品分子上，分子受激发产生的荧光由显微镜物镜收集后通过二向色镜进入单光子探测器(4)转化为逻辑电脉冲信号，单光子探测器(4)和函数信号发生器(5) —起连接锁相放大器(6)，对逻辑电脉冲信号进行解调，计算机数据采集成像与控制系统(7)分别与锁相放大器(6)、三维纳米平移台(3)以及单分子探测器(4)连接。
全文摘要
本发明涉及荧光光谱成像技术，为了解决由于分子荧光辐射起伏以及信噪比较低而造成的单分子荧光成像模糊的问题，本发明提供一种提高单分子荧光成像清晰度的方法及其装置。用声光调制器进行强度调制后的激光扫描照射单分子样品，使用单光子探测器接收单分子样品发出的荧光光子并转化为一个标准的逻辑电脉冲输出信号，逻辑电脉冲信号输入到锁相放大器，同时将同步正弦波形调制电压信号输入锁相放大器，对逻辑电脉冲输出信号进行解调，得到被测的荧光光谱信号并对荧光光谱信号进行成像。本发明利用强度调制激发光场，实现对单分子荧光光子进行强度调制，利用锁相放大器解调后的模拟信号消除了光子计数的量子涨落，提高了信噪比，实现高清晰度的单分子荧光成像。
文档编号G01N21/64GK102507521SQ20111034528
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者张国峰, 肖连团, 贾锁堂, 陈瑞云, 高岩 申请人:山西大学