专利名称：硒诊断/测定试剂盒及硒的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种硒诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硒浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
硒是生物必需的微量元素，植物硒是人类和动物获取硒的主要来源，人体过多的摄入硒能引起硒中毒。硒元素可使人体内的过氧化物分解，保护
细胞膜、心、肾、肺、眼等；可清除人体的自由基，抗衰老，增强人体免疫功能，可抑制多种致癌物质，人体缺硒会诱发心血管疾病和癌症。
结合国内外有关硒的各种检测方法.其中常用的测定方法如原子吸收
光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)和电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)等；原子吸收光谱(AAS)作为元素特效检测器与GC联用已成为微量元素分析的主要方法。另外还有，应用液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS)鉴定硒化合物。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用硒依赖性的酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技
术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定硒浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的硒诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行硒浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本发明硒浓度测定方法原理如下
谷胱甘肽二硫+ 2水谷胱甘肽过氧化物酶/Se
2谷胱甘肽+过氧化氢过氧化氢+ 二氧化碳+乙酰辅酶A 丙酮酸氧化酶
丙酮酸+辅酶八+氧丙酮酸+ 二氧化碳+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化)
L-苹果酸+辅酶
这种方法利用硒依赖性的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase;EC1.11丄9)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase; EC 1.1.1.38; EC 1.1.1.39; EC 1.1,1.40;EC 1丄1.S3)酶促反应连续监测法/速率比色法。谷胱甘肽过氧化物酶酶解谷胱甘肽二硫反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算硒的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明硒诊断/测定试剂盒较
为理想
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000 U/L
丙酮酸氧化酶 10000 U/L苹果酸脱氢酶 12000 U/L
谷胱甘肽二硫 10mmol/L二氧化碳 12mmol/L乙酰辅酶A 8mmol/L
二氧化碳可以是任何碳酸氢盐，如碳酸氢钠。本发明的硒诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括-
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A。试剂2
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸
脱氢酶。
还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂-试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶。
还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定硒浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。实施例一
本实施例的硒诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
谷胱甘肽过氧化物酶
丙酮酸氧化酶
苹果酸脱氢酶
谷胱甘肽二硫
二氧化碳
乙酰辅酶A
100 mmol/L500 mmol/L0.25 mmol/L10000 U/L10000U/L12000 U/L10 mmol/L12 mmol/L8 mmoI/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37T:，反应时间10分钟，起始吸光 度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硒样品与试剂 的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟 左右，检测时间3分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪K，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出硒的浓度大
实施例二
本实施例的硒诊断/测定试剂为双试剂，包括: 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
谷胱甘肽二硫
二氧化碳
乙酰辅酶A
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
谷胱甘肽过氧化物酶
丙酮酸氧化酶
苹果酸脱氢酶
100 mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 10 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L
励mmol/L 500 mmol/L 10000U/L 10000U/L 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光
度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硒样品与试剂1、
试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大
约1分钟左右，检测时间3分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析
仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出硒的浓度大
实施例三
本实施例的硒诊断/测定试剂为三试剂，包括: 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 谷胱甘肽二硫 二氧化碳 乙酰辅酶A 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
丙酮酸氧化酶 苹果酸脱氢酶 试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
100 mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 10 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L 12000 U/L
100mmol/L
10稳定剂 500 mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定硒浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10 分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被 测硒样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负 反应(下降反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间3分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出硒的浓度大 小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的测定方法均能达到 本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析 仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0015; 吸光度时间反应曲线应呈直线下降；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可 达0.5mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±6%;试剂测试 的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.065 ± 0.033 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便 于推广应用。
ii
权利要求
1. 一种利用硒依赖性的酶比色法及酶联法技术的硒浓度测定方法，其方法原理如下谷胱甘肽二硫+2水 <u>谷胱甘肽过氧化物酶/Se</u> 2谷胱甘肽+过氧化氢过氧化氢+二氧化碳+乙酰辅酶A <u>丙酮酸氧化酶</u> 丙酮酸+辅酶A+氧丙酮酸+二氧化碳+还原型辅酶 <u>苹果酸脱氢酶(脱羧化)</u> L-苹果酸+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出硒的浓度大小测定结果。
2. —种硒诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20——500 mmol/L稳定剂1——-4000 mmol/L还原型辅酶0.1———0.35 mmol/L谷胱甘肽过氧化物酶IOOO———80000 U/L丙酮酸氧化酶IOOO-——80000 U/L苹果酸脱氢酶IOOO-——80000 U/L谷胱甘肽二硫1—50 mmol/L二氧化碳1—50 mmol/L乙酰辅酶Al一50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在 此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。二氧化碳可以是任何碳酸氢盐。
3. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、 苹果酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、 苹果酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A组成双剂试剂； 试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、 乙酰辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、 丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶组成。还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、 丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A组成多剂试剂； 试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、 乙酰辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶组成。 还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、谷 胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位 置可以不限。
6. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂 14000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用硒依赖性的酶比色法及酶联法技术的硒诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硒浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出硒的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464336SQ200710192129
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司