专利名称：习惯性流产遗传检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体习惯性流产遗传易感性的试 剂盒，通过同时检测与习惯性流产密切相关的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4基因(CTLA4)、肿瘤坏死因 子-a基因(TNF-a)、白细胞介素-6基因(IL-6)、 5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)的单核苷酸 多态性位点基因型来评估个体习惯性流产遗传易感性。
背景技术：
妊娠不足28周、胎儿体重不足1000g而终止者称为流产(Abortion)。孕12周前终止者成为早期流 产，孕12周至不足28周终止者成为晚期流产。其中，自然因素导致的流产称为自然流产(Spontaneous abortion, miscarrage)。自然流产率占全部妊娠的10% 15%，其中，80%为早期流产。
习惯性流产指连续发生三次或三次以上自然流产。其发生率约占妊娠总数的1%，占自然流产数的15 %。习惯性流产的病因极为复杂，染色体异常、解剖因素、内分泌异常、免疫因素、血型不合、感染甚至 精神因素等均可导致习惯性流产的发生。其中，常见原因有胚胎染色体异常、免疫因素异常、甲状腺功能 低下、子宫畸形或发育不良、宫颈粘连、宫颈内口松弛等。
习惯性流产是一种复杂的多基因疾病，从根本上讲是遗传因素和环境因素交互作用的结果，是基因在 环境诱导下的异常表达所致。因此，从遗传角度寻找和确定与习惯性流产相关的易感基因或致病基因，就 可以从根本上阐明其发病机制，不仅能够为诊疗方案的确定提供辅助支持，还能对易感人群进行提示，使 其进行有效预防，降低习惯性流产的发生
目前，涉及习惯性流产的一些基因，已经被很好的进行研究。其作用机制、生化功能、信号通路、调 控、转录等等方面都有明确可靠的研究结果；研究手段、方法、仪器设备和试剂等都己经发展到了一个相 当的高度。目前，经证实并且机理研究清楚的与抗氧化能力密切相关的基因有细胞毒性T淋巴细胞相关抗 原4基因(CTLA4)、肿瘤坏死因子-a基因(TNF-a)、白细胞介素-6基因(IL-6)、 5， 10-亚甲基四氢叶酸 还原酶基因(MTHFR)。
CTLA4基因位于人类染色体2q33，编码特异性受体，并表达于T淋巴细胞表面，是一种T细胞活化的 抑制性调节因子。CTLA4基因对调节母-胎之间的免疫耐受发挥着重要的作用。rs231775 (A49G)是位于 CLTA4基因第1外显子上的一个A/G单核苷酸多态性位点，此多态性导致CTLA4 mRNA表达显著下降，使得 CTLA4分子对免疫信号的下调作用降低，从而使免疫信号的调节失去控制。研究发现，携带M基因型的习 惯性流产患者同AG和GG基因型的患者比较，能产生高水平的IgE抗体，AA基因型被认为主要介导了 TH2 为主的免疫反应。由此可以推测，习惯性流产患者中高频率分布的等位基因G和基因型GG,与TH2免疫反 应降低有关，由此打破了母-胎界面TH1/TH2的免疫平衡，从而引起对宫内胎儿有害的免疫反应，是遗传 风险基因型。
肿瘤坏死因子-a (TNF-a)是一种主要由单核-吞噬细胞产生的单核因子，TNF-a作为具有多种生物学 活性的细胞因子也参与正常妊娠过程中的多种生物学功能的调节，妊娠期适量的TNF-a能促进妇女能量代 谢及胚胎发育，提高孕激素及绒毛膜促性腺激素的合成，并且能刺激细胞滋养层生成尿激酶型血浆素原激 活剂(uPA)，有利于蛻膜细胞外基质降解及胎盘植入，对妊娠维持有重要作用。经研究发现，正常早孕妇 女血清中TNF-a明显低于正常非孕妇女，而反复流产组血清中的TNF-a明显高于正常早孕组，其中难免 流产组明显高于先兆流产组。因此认为，在妊娠期TNF-a分泌受到抑制，而TNF-a的高水平表达与反复 流产相关，可作为预测流产的指标。rsl800629和rsl799724均为位于TNF- a基因启动区G/A单核苷酸多 态性位点，A等位基因会增加TNF-ci的转录和分泌，而TNF-a水平的升高将增加习惯性流产的风险，因此 这两个位点的A等位基因为风险基因型。
白细胞介素-6 (IL-6)是一种多功能细胞因子，在正常妊娠妇女的血清及羊水中均存在著一定量的 IL-6，至妊娠后期及分娩前IL-6水平明显升高。妊娠后期IL-6的急剧升高与肾移植中的排斥反应相似， 是母体对胎儿的一种排斥反应，在妊娠期间，母体的免疫机制受到抑制，在妊娠末期这种抑制被解除，出 现排斥反应，表现为各种细胞因子的出现。研究发现正常早孕妇女血清中IL-6水平与正常非孕妇女无明显差异，反复流产组血清中IL-6明显高于正常早孕组，其中难免流产组明显高于先兆流产组。因此认为， 高水平的IL-6与反复流产相关，可作为预测流产的指标。rs1800796是位于IL-6启动子区域的一个G-572C 单核苷酸多态性位点，与IL-6的表达相关。研究表明，携带风险基因型G时IL-6表达增加，造成免疫应 答的紊乱，增加习惯性流产的风险。
5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢的关键酶，现有研究显示，叶酸与母胎的健康密切 相关。在受精卵发育、细胞分裂生长十分旺盛时，孕妇新陈代谢活跃，蛋白质合成加速，叶酸的需要量陡 然剧增。如果孕妇体内红细胞叶酸贮存量不足，胎盘发育不良就会自发流产。目前，已发现MTHFR上存在 一系列的多态性位点，这些位点通过改变MTHFR的表达或者活性，进而阻碍叶酸代谢，增加习惯性流产的 风险。rsl801133是位于MTHFR基因第5外显子上的C677T单核苷酸多态性位点，引起MTHFR基因编码的 蛋白第222个氨基酸由Ala[A]变为Val[V]。研究表明，携带T等位基因时，蛋白的热敏感性增加，MTHFR 活性降低。rsl801131是位于第一号染色体MTHFR基因第八个外显子上第1298核苷酸的一个A/C单核苷酸 多态性位点，携带C等位基因时，会引起MTHFR基因编码的蛋白第429个氨基酸由Glu变为Ala。现有研 究显示，携带这2个MTHFR多态性位点的风险基因型时都会降低MTHFR的活性，导致叶酸代谢及同型半胱 氨酸清除过程受阻，促进了血栓形成倾向，增加了习惯性流产的发生风险。

发明内容
基于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4基因(CTLA4)、肿瘤坏死因子-o基因(TNF- a )、白细胞介素-6 基因(IL-6)、 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上的6个SNPs位点多态性可用来评估个体习惯 性流产遗传易感性的基础上，本发明提供一种检测个体习惯性流产遗传易感性的试剂盒。
该试剂盒包括
检测CTLA4基因上rs769214号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测TNF-a基因上rsl800629号和rsl799724号SNPs多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探 针对；
检测IL-6基因上rsl800796号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测MTHFR基因上rsl801133号和rsl801131号SNPs多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探 针对；
荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)。
本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对CTLA4基因上rs769214号SNP位点、TNF-a基因上rs1800629 号和rsl799724号SNP位点、IL-6基因上rsl800796号SNP位点、MTHFR基因上rs薩133号和rs藤131 号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这6个SNPs位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领 域技术人员能够轻易完成的，特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。
本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是指针对CTLA4基因上rs769214号SNP位点、TNF-a基因上 rsl800629号和rsl799724号SNP位点、IL-6基因上rsl800796号SNP位点、MTHFR基因上rs薩133号 和rsl801131号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这6个SNPs位点基因型的Taqman 探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的，特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进 行合成。
本发明试剂盒的组分和含量包括
6nl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液，
0.6nl 25mM dNTP混合液，
3.6^1 25mM MgCV溶液，
0.15^1 (5units/nl) T叫DNA聚合酶，
20nM特异性引物对每条引物各0.225nl，
10nM特异性荧光探针对每条探针各0. 25^1,
去离子水31.95nl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒，进行6次独立的荧光定量PCR反应，每次反应的体系为总体积1(^1，包含浓度为 20ng/nl的DNA模板2^1、 lpl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0. lpl 25mM dNTP混合液、0. 6|ui 25mMMgCl2 溶液、t).025nl (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20nM的有义引物和反义引物各0. 225|il、 lO[iM的带VIC 荧光探针和带FAM荧光探针各0. 25^1，去离子水5. 325^1。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为5(TC、 2分钟，95'C、 IO分钟，进行60个循环的95°C、 30秒， 6(TC、 l分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤3: SNP基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定暈PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.应用检测试剂盒进行个体习惯性流产遗传易感性检测的服务 步骤l: DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，釆用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DNA抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的CTLA4基因上rs769214号SNP位点、TNF-a基 因上rsl800629号和rsl799724号SNP位点、IL-6基因上rsl800796号SNP位点、MTHFR基因上rsl801133 号和rsl801131号SNP位点分别进行荧光定量PCR检测，确定这6个SNPs位点的基因型。
步骤3:个体习惯性流产遗传易感性的分析
通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具个体习惯性流产遗传易感性的分析报告单。报告中详细说 明了被检测者习惯性流产遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体习惯性流产遗传易感性 分析报告单。
权利要求
1. 一种检测个体习惯性流产遗传易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4基因基因上rs769214号SNP位点、肿瘤坏死因子-α基因上rs1800629号和rs1799724号SNP位点、白细胞介素-6基因上rs1800796号SNP位点、5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801133号和rs1801131号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对细胞毒性T淋巴细胞 相关抗原4基因基因上rs769214号SNP位点、肿瘤坏死因子-a基因上rsl800629号和rsl799724号SNP 位点、白细胞介素-6基因上rsl800796号SNP位点、5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号和 rsl801131号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这6个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针对是指针对细胞毒性T淋巴 细胞相关抗原4基因基因上rs769214号SNP位点、肿瘤坏死因子-a基因上rsl800629号和rsl799724号 SNP位点、白细胞介素-6基因上rsl800796号SNP位点、5， 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133 号和rsl801131号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这6个SNPsf点基因型的Taqman 探针对。 '
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括6nl 10 X荧光定量PCR反 应缓冲液、0.6|il 25mM dNTP混合液、3. 6^1 25mM MgCh溶液、0. 15pl (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20nM特异性引物对每条引物各0. 225^1、 lOnM特异性荧光探针对每条探针各0. 25pl、去离子水31. 95^1。 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC 。
5. 权利要求l所述的试剂盒在检测个体习惯性流产遗传易感性上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测个体习惯性流产遗传易感性的试剂盒及其应用。该试剂盒包括同时检测细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4基因(CTLA4)、肿瘤坏死因子-α基因(TNF-α)、白细胞介素-6基因(IL-6)、5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上的6个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒可用于评估个体习惯性流产遗传易感性。
文档编号G01N21/00GK101470071SQ20071017284
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月24日 优先权日2007年12月24日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司