专利名称：一种脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种游离多糖的测定方法，具体涉及一种A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法。
背景技术：
脑膜炎球菌感染是引起儿童细菌性脑膜炎和爆发性败血症的首要致病菌。据统计，全球每年流行性脑膜炎发病人数约为50万，尤其发展中国家发病率较高。世界范围内， 几乎所有脑膜炎疾病都是由A群、B群、C群、Y群和W135群脑膜炎球菌引起的，而接种安全有效的疫苗是预防和控制脑膜炎的理想措施。目前在国内外上市的脑膜炎疫苗主要有多糖疫苗和多糖结合疫苗两大类，其中多糖疫苗的抗原为半抗原，是非T细胞依赖性抗原，其诱导的免疫应答没有T淋巴细胞参与， 不能产生免疫记忆。所以WHO曾建议流脑多糖疫苗一般不用于2岁以下婴、幼儿的接种。流脑多糖结合疫苗则是将提取的脑膜炎球菌荚膜多糖与蛋白载体结合而成，其抗原为T细胞依赖性抗原，其诱导的免疫应答有T淋巴细胞参与，能刺激机体产生高水平抗体，增强对婴幼儿的免疫记忆，从而提高免疫效果。多糖结合疫苗中游离多糖的含量是多糖结合疫苗质量控制的关键指标之一，游离多糖含量超过规定限度会对疫苗临床效果产生不利的影响。因此游离多糖含量是反映结合疫苗质量优劣的重要指标。国外文献报道中有采用疏水层析、HPLC法进行多糖结合物中游离多糖的测定，但因层析过程中易受到分子大小相近杂质的影响，测定结果误差较大。国内朱为等人在《A群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合物中游离多糖测定方法的建立》中介绍了一种利用乙醇沉淀法测定A群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合物游离多糖的方法，但该方法操作比较繁琐，一个样品需要多天才能获得结果，同时对游离多糖含量较低的样品可能存在一定的误差；国内黄镇等人在中国专利200610048876.9中公开了 “一种A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖的测定方法”，此方法需向样品中加入冷酚溶液进行震荡，但冷酚毒性较强，对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，长期接触可抑制中枢神经或损害肝、肾功能，吸入苯酚也可导致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等。此外由于不同多糖结合物性质差异较大，因此多糖结合疫苗中游离多糖的测定一直是一个技术难关，目前尚无利用脱氧胆酸钠萃取方法测定多糖结合物中游离多糖含量的报道。

发明内容
本发明的方法克服了现有测定游离多糖含量方法的不足，可以准确测定A、C、 W135、Y群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖的含量，操作方法简单快捷。本发明提供的测定一种脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖的方法，取样、离心、计算多糖浓度、计算游离多糖含量，其中离心时在脑膜炎球菌多糖结合物和待测的脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物中加入脱氧胆酸钠溶液。本发明提供的测定一种脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖的方法，适用于A、C、 W135、Y群脑膜炎球菌多糖结合物。本发明提供的测定A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖的方法，包括以下步骤1)取样取待检脑膜炎球菌多糖结合物Iml作为样1，取待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液Iml作为样3 ；2)离心另取脑膜炎球菌多糖结合物Iml置于1. 5ml离心管中，取待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液Iml置于另一 1. 5ml离心管中；向每离心管加入100 μ 1
的DOC(脱氧胆酸钠)溶液，冰浴保持30分钟，后加入0. 5Μ HCl溶液25μ 1，充分振荡， 5000 6000rpm离心15 20分钟，每离心管单独收集上清液1ml，其中结合物上清液为样 2，衍生物上清液为样4;3)计算多糖浓度A群脑膜炎球菌多糖结合物测定磷含量，通过磷含量计算样1、 样2、样3、样4的多糖浓度；C群、W135群、Y群脑膜炎球菌多糖结合物测定唾液酸含量，通过唾液酸含量计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度，样1、样2、样3、样4的多糖浓度分别为 C1、C2、C3、C4。4)计算游离多糖含量其中P为回收率，H为游离多糖含量
权利要求
1.一种脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，包括取样、离心、计算多糖浓度、计算游离多糖含量，其特征在于，离心时在脑膜炎球菌多糖结合物和待测的脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物中加入脱氧胆酸钠溶液。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，该脑膜炎球菌多糖结合物选自A群、 C群、W135群或Y群。
3.根据权利要求2所述的A群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，包括以下步骤1)取样取待检脑膜炎球菌多糖结合物Iml作为样1，取待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液Iml作为样3 ；2)离心另取脑膜炎球菌多糖结合物Iml置于1.5ml离心管中，取待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液Iml置于另一 1. 5ml离心管中；向每离心管加入100 μ 11% 的脱氧胆酸钠溶液，冰浴保持30分钟，后加入0. 5Μ盐酸溶液25 μ 1，充分振荡，5000 6000rpm离心15 20分钟，每离心管单独收集上清液1ml，其中结合物上清液为样2，衍生物上清液为样4 ；3)计算多糖浓度A群脑膜炎球菌多糖结合物测定磷含量，按照“A群多糖浓度=磷含量/0. 08”，计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度(1工2、03、〇4 ；4)计算游离多糖含量其中P为回收率，H为游离多糖含量
4.根据权利要求2所述的C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，包括以下步骤1)取样取待检脑膜炎球菌多糖结合物Iml作为样1，取待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液Iml作为样3 ；2)离心另取脑膜炎球菌多糖结合物Iml置于1.5ml离心管中，取待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液Iml置于另一 1. 5ml离心管中；向每离心管加入100 μ 1 1% 的脱氧胆酸钠溶液，冰浴保持30分钟，后加入0. 5Μ盐酸溶液25 μ 1，充分振荡，5000 6000rpm离心15 20分钟，每离心管单独收集上清液1ml，其中结合物上清液为样2，衍生物上清液为样4 ；3)计算多糖浓度C群脑膜炎球菌多糖结合物测定唾液酸含量，按照“C群多糖浓度= 唾液酸含量/0. 8”，计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度Cl、C2、C3、C4 ；4)计算游离多糖含量其中P为回收率，H为游离多糖含量
5.根据权利要求2所述的W135群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法， 包括以下步骤1)取样取待检脑膜炎球菌多糖结合物Iml作为样1，取待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液Iml作为样3 ；2)离心另取脑膜炎球菌多糖结合物Iml置于1.5ml离心管中，取待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液Iml置于另一 1. 5ml离心管中；向每离心管加入100 μ 1 1%的脱氧胆酸钠溶液，冰浴保持30分钟，后加入0. 5M盐酸溶液25 μ 1，充分振荡，5000 6000rpm离心15 20分钟，每离心管单独收集上清液1ml，其中结合物上清液为样2，衍生物上清液为样4 ；3)计算多糖浓度W135群脑膜炎球菌多糖结合物测定唾液酸含量，按照“W135群多糖浓度=唾液酸含量/0. 56”，计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度Cl、C2、C3、C4 ；4)计算游离多糖含量其中P为回收率，H为游离多糖含量 CAC7P=— X 100% ,H=— -Px 100%。 C3Cl
6.根据权利要求2所述的Y群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，包括以下步骤1)取样取待检脑膜炎球菌多糖结合物Iml作为样1，取待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液Iml作为样3 ；2)离心另取脑膜炎球菌多糖结合物Iml置于1.5ml离心管中，取待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液Iml置于另一 1. 5ml离心管中；向每离心管加入100 μ 1 1% 的脱氧胆酸钠溶液，冰浴保持30分钟，后加入0. 5Μ盐酸溶液25 μ 1，充分振荡，5000 6000rpm离心15 20分钟，每离心管单独收集上清液1ml，其中结合物上清液为样2，衍生物上清液为样4 ；3)计算多糖浓度Y群脑膜炎球菌多糖结合物测定唾液酸含量，按照“Y群多糖浓度= 唾液酸含量/0. 56”，计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度Cl、C2、C3、C4 ；4)计算游离多糖含量其中P为回收率，H为游离多糖含量 CAClΡ-— X 100% ,H=— +Px 100%。 C3Cl
全文摘要
本发明提供了一种A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，其包括以下步骤1)取样分别取待检脑膜炎球菌多糖结合物和待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液1ml作为样1和3；2)离心另取脑膜炎球菌多糖结合物和待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液置于离心管中。向每离心管加入脱氧胆酸钠溶液，冰浴保持30分钟，后加入盐酸溶液，充分振荡，离心，收集每离心管的上清液，作为样2和4；3)计算多糖浓度；4)计算游离多糖含量。本发明能准确、简便地测定出脑膜炎球菌A、C、W135、Y群多糖结合物中游离多糖含量，从而评价制品质量。
文档编号G01N33/48GK102175841SQ20101062362
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者何佳琦, 王婷婷, 魏文进 申请人:北京民海生物科技有限公司, 深圳康泰生物制品股份有限公司