专利名称：减毒的革兰氏阴性细菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及活的减毒革兰氏阴性细菌。减毒的革兰氏阴性细菌可用于免疫原性组合物或疫苗组合物中，如用于预防细菌感染，以及用于研究，因为减毒菌株为研究人员和可能的接触者(如动物、人)提供了较高的安全性。
因此，本发明涉及包含本发明革兰氏阴性细菌如活的减毒革兰氏阴性细菌的免疫原性或疫苗组合物。组合物中的细菌也可以是灭活的；但是活的减毒革兰氏阴性细菌可能是有利的。因此，本发明还涉及用于制备和/或配制这些组合物的方法；如在合适的培养基上/中培养或培育或繁殖细菌，收获细菌，任选灭活细菌，并与合适的兽医学或制药学可接受载体、赋形剂、稀释剂、或介质(vehicle)和/或佐剂和/或稳定剂混合；或者，将细菌与合适的兽医学或制药学可接受载体、赋形剂、稀释剂、或介质和/或佐剂和/或稳定剂混合。由此，本发明还涉及细菌在配制这些组合物中的用途。
减毒细菌还可作为表达或复制载体，如用于对减毒细菌而言异源的核酸分子的复制和/或表达，所述核酸分子如编码病原体的免疫原、抗原、或表位的核酸分子，病原体的例子是减毒细菌以外的病原体。减毒细菌作为载体的用途也为操作减毒细菌的研究人员或技术人员和可能的接触者(如动物、人)提供了较高的安全性。
因此，本发明还涉及用于制备这些载体的方法，如转化细菌使得细菌包含且任选表达异源核酸分子。
本发明还涉及这些载体的用途；如用于生成对细菌而言异源的基因产物，如多肽，诸如免疫原、表位、或抗原的方法，包括培养、培育、或繁殖经转化而包含并在适于表达的条件下表达编码该基因产物的异源核酸分子的细菌，且任选收获或分离或分开基因产物；或者，由经转化而表达它的细菌收获或分离或分开基因产物；或者，用于引发针对基因产物和/或细菌的免疫学应答或免疫原性应答或者针对衍生或获得基因产物的病原体和/或该细菌的保护性免疫应答的方法，包括对受试者施用经转化而表达基因产物的细菌，所述受试者如动物，诸如易受病原体和/或细菌感染的动物，例如牛或火鸡；或者，用于制备免疫原性、免疫学、或疫苗组合物的方法，包括将载体或经转化细菌与制药学或兽医学可接受载体、稀释剂、介质、或赋形剂和/或佐剂和/或稳定剂混合。
本发明还涉及用于细菌减毒的靶标，如编码细菌减毒靶标的突变型核苷酸序列或基因，以及用于确立细菌减毒靶标多肽的方法和生成减毒细菌的方法。减毒的靶标可以用作免疫原性化合物，如用在免疫原性组合物或疫苗组合物中，或者用于生成免疫原性或疫苗组合物中所使用的表位。由此，本发明涉及减毒靶标在制备组合物中的用途，如与制药学或兽医学可接受载体、稀释剂、赋形剂、或介质和/或佐剂和/或稳定剂混合。
本发明还涉及用于在受试者，如动物，诸如易受革兰氏阴性细菌诸如巴斯德氏菌感染的动物，如火鸡或牛中诱发免疫学或免疫原性或保护性免疫应答的方法，包括对动物施用本发明的疫苗或免疫原性组合物。
本发明甚至还涉及这些减毒细菌的制备，如革兰氏阴性细菌，诸如巴斯德氏菌；例如，包括将一种或多种转座元件导入细菌，并分离包含在目标物种中不引起死亡的(且因而是减毒的)转座元件的细菌。任选的是，还可以鉴定细菌中的突变，从而能够获得生成减毒细菌的候选方法。
本发明甚至还涉及用于生成减毒细菌的这些候选方法。因为已经鉴定或表征了突变，所以可以通过除了将一种或多种转座元件导入细菌以外的技术将突变导入细菌，诸如通过同源重组，如导致细菌基因组的一部分发生至少一个添加(插入)或缺失(还设想了两个或多个添加和/或缺失)或替代(诸如至少一个核苷酸被另一种核苷酸替代)的同源重组。因此，本发明涉及用于生成包含已知或先前鉴定的修饰或突变(如本文鉴定的修饰或突变)的减毒细菌的方法，包括将缺失或插入或替代导入细菌基因组，通过重组是有利的，并任选鉴定和/或分离包含修饰或突变的细菌。
由此，本发明还涉及革兰氏阴性细菌突变体，其中所述细菌在如下核苷酸序列中具有至少一个突变，由所述核苷酸序列编码的多肽与由选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性SEQ IDNO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、6l、64、67、70、75、78、81、84、87、90、和93所示核苷酸序列；所述突变导致细菌的毒力减弱。而且，本发明还涉及本文所述这种细菌的用途、组合物、和方法。
背景技术：
已经公认，活的减毒微生物可以作为高度有效的疫苗；与由不进行复制的免疫原产生的免疫应答相比，由这种疫苗引发的免疫应答常常强度更大且时间更长。对此的一种解释是活的减毒菌株在宿主中建立了受限感染并模拟天然感染的早期阶段。另外，与杀死的或灭活的制剂不同，活的疫苗能够诱发由细胞介导的有力应答，这可能与它们在抗原呈递细胞诸如巨噬细胞中的复制能力有关。
在动物和人类中使用活的减毒疫苗已经有很长的历史，特别是使用化学诱变技术。然而，凭借经验减毒的疫苗能够恢复毒力。
结合关于细菌发病机理的日益增加的知识，现代分子生物学技术鉴定了涉及微生物在体内生长和存活的数种基因。这为减毒提供了新的靶基因，而且提出了这样的概念，即可以通过将限定的非恢复突变导入已知涉及毒力的选定基因而将未来的疫苗菌株“合理地”减毒，参阅例如WO-A-00/61724、WO-A-00/68216、和EP-A-0889120。
尽管已经在实验室中生成了许多减毒菌株，然而只有少数有资格作为潜在疫苗候选者用于动物。这可能是部分由于需要平衡疫苗的免疫原性与微生物恢复活性和致病性的可能性。
显然，为减毒选择适当基因(这将生成合适的疫苗候选者)并不简单，而且难以预测。许多因素可能影响减毒突变体作为疫苗的可接受性，因此需要努力研究以鉴定并选择合适的减毒基因。只是在体外进行了许多减毒实验，而且它们的结果不能外推至体内，特别是关于由此生成的突变体对接种动物的残余致病性。
参考Kachlany SC、Planet PJ、Bhattacharjee MK、Kollia E、DeSalle R、Fine DH、Figurski DH，Nonspecific adherence by Actinobacillusactinomycetemcomitans requires genes widespread in bacteria andarchaea(伴放线放线杆菌的非特异粘附需要细菌和古细菌中普遍存在的基因)，J Bacteriol，2000年11月，182(21)6169-6176。
Fuller TE、Martin S、Teel JF、Alaniz GR、Kennedy MJ、LoweryDE，Identification of Actinobacillus pleuropneumoniae virulence genesusing signature-tagged mutagenesis in a swine infection model(猪感染模型中使用标志-标记诱变对大叶性肺炎放线杆菌毒力基因的鉴定)，Microb Pathog，2000年7月，29(1)39-51。
Fuller TE、Kennedy MJ、Lowery DE，Identification of Pasteurellamultocida virulence genes in septicemic mouse model usingsignature-tagged mutagenesis(白血病小鼠模型中使用标志-标记诱变对多杀巴斯德氏菌毒力基因的鉴定)，Microb Pathog，2000年7月，29(1)25-38。
Kehrenberg C、Werckenthin C、Schwarz S，Tn5706，atransposon-like element from Pasteurella multocida mediatingtetracycline resistance(Tn5706，来自多杀巴斯德氏菌的介导四环素抗性的转座子样元件)，Antimicrob Agents Chemother，1998年8月，42(8)2116-2118。
DeAngelis PL，Transposon Tn916 insertional mutagenesis ofPasteurella multocida and direct sequencing of disruption site(多杀巴斯德氏菌的转座子Tn916插入诱变和破坏位点的直接测序)，MicrobPathog，1998a年4月，24(4)203-209。
DeAngelis PL、Jing W、Drake RR、Achyuthan AM，Identificationand molecular cloning of a unique hyaluronan synthase fromPasteurella multocida(来自多杀巴斯德氏菌的独特透明质酸合酶的鉴定和分子克隆)，J Biol Chem，1998b年4月3日，273(14)8454-8458。
Lee MD、Henk AD，Tn10 insertional mutagenesis in Pasteurellamultocida(多杀巴斯德氏菌中的Tn10插入诱变)，Vet Microbiol，1996年5月，50(1-2)143-148。
Choi KH、Maheswaran SK、Choi CS，Colorimetric assay usingXTT for assessing virulence of avian Pasteurella multocida strains(使用XTT的比色测定法用于评估鸟类多杀巴斯德氏菌菌株的毒力)，VetMicrobiol，1995年7月，45(2-3)191-200。
Nnalue NA，Tn7 inserts in both orientations at a singlechromosomal location and apparently forms cointegrates in Pasteurellamultocida(Tn7在多杀巴斯德氏菌中以两个方向插入单一染色体位置且显然形成共合体)，Mol Microbiol，1990年1月，4(1)107-117。
Stocker，美国专利号4,550,081、4,837,151、5,210,035、和5,643,771。
Highlander，美国专利号6,180,112。
Kachlany涉及Tad基因。Kachlany中的突变型Tad基因与减毒无关。在Kachlany中没有对动物进行测试，而且本发明没有选择Tad基因。Fuller的论文涉及本发明没有选择的序列。Kehrenberg不涉及减毒突变体或者特征标记诱变或STM技术；而是，Kehrenberg涉及转座子的定向插入(相同插入元件的使用)。DeAngelis 1998a只提供了STM技术的一般描述，而且本质上没有提供突变体。DeAngelis 1998b涉及使用STM技术将转座子插入HA生物合成基因座(Genbank编号AF036004)。该序列是PM70的序列Pm0775的同源物。本发明没有选择编码Pm0775的序列。Lee关注STM技术对Tn10转座子的使用；Lee未能公开或提议对动物的任何测试或者对减毒突变体的任何研究；而是，Lee只涉及营养缺陷型突变体。尽管Choi引用了多杀巴斯德氏菌转座子插入突变体，而且该突变体可能还没有诱发死亡，然而Choi不含关于转座子插入位置的细节，因此不能说是可重复的。类似的，Nnalue未能教导或提议本发明。Stocker的专利涉及aroA基因中Tn10转座子的插入。本发明没有选择aroA基因。Highlander关注灭活白细胞毒素的lktC基因中Tn1545转座子的插入。本发明没有选择lktC基因。因此，真正认为本领域尚未教导或建议本发明。
此外，期望鉴定涉及减毒的基因或核酸序列，并在此基础上开发减毒细菌，以及减毒疫苗或免疫原性组合物，诸如具有高度免疫原性并展示优越安全特性和有限副作用或没有副作用的那些组合物。
发明概述本发明提供了在编码第一多肽的第一核苷酸序列中具有突变并导致细菌的毒力减弱的革兰氏阴性细菌突变体，其中第一多肽具有氨基酸序列；第二多肽具有由SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；且第一多肽的氨基酸序列与第二多肽的氨基酸序列相同，或者第一多肽的氨基酸序列与第二多肽的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。
细菌突变体可以是巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)，如细菌可以是多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahaemolytica)、鸭瘟巴斯德氏菌(Pasteurella anatipestifer)、或大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)，有利的是多杀巴斯德氏菌。
突变可以是第一核苷酸序列中的缺失、插入、或核酸替代，诸如整个第一核苷酸序列的缺失；或者在SEQ ID NO2的第180-181位核苷酸或第182-183位核苷酸或第190-191位核苷酸、SEQ ID NO6的第77-78位核苷酸或第1026-1027位核苷酸或第1027-1028位核苷酸、SEQ ID NO9的第416-417位核苷酸、SEQ ID NO12的第389-390位核苷酸、SEQ ID NO16的第381-382位核苷酸、SEQ ID NO19的第219-220位核苷酸、SEQ ID NO22的第1353-1354位核苷酸、SEQID NO25的第136-137位核苷酸、SEQ ID NO28的第384-385位核苷酸、SEQ ID NO31的第222-223位核苷酸或第225-226位核苷酸、SEQ ID NO34的第217-218位核苷酸、SEQ ID NO37的第1411-1412位核苷酸、SEQ ID NO40的第943-944位核苷酸、SEQ ID NO43的第855-856位核苷酸、SEQ ID NO46的第369-370位核苷酸、SEQID NO49的第111-112位核苷酸、SEQ ID NO52的第443-444位核苷酸、SEQ ID NO55的第4-5位核苷酸、SEQ ID NO61的第573-574位核苷酸、SEQ ID NO64的第875-876位核苷酸、SEQ ID NO70的第218-219位核苷酸、SEQ ID NO75的第1072-1087位核苷酸、SEQ ID NO78的第64-65位核苷酸、SEQ ID NO81的第282-283位核苷酸、SEQ ID NO84的第1431-1432位核苷酸、SEQ ID NO87的第974-975位核苷酸、SEQ ID NO90的第802-803位核苷酸、SEQID NO92的第850-851位核苷酸之间的插入；或紧挨着SEQ ID NO58的第1位核苷酸的上游的插入；或紧挨着SEQ ID NO67的第1位核苷酸的上游的插入。
突变体可以包含异源核酸序列，诸如编码来自致病性病毒、寄生虫或细菌的免疫原、治疗性蛋白质、变应原、生长因子或细胞因子的异源核酸序列。
本发明还提供了包含依照本发明的突变体以及制药学或兽医学可接受稀释剂、载体、介质、或赋形剂的免疫原性组合物或疫苗，而且任选还包含佐剂。
本发明还提供了具有氨基酸序列的分离的第一多肽，其中第二多肽具有由SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；且第一多肽的氨基酸序列与第二多肽的氨基酸序列相同，或者第一多肽的氨基酸序列与第二多肽的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。
本发明设想了包含第一种分离多肽以及制药学或兽医学可接受稀释剂、载体、介质、或赋形剂和任选的佐剂的免疫原性或疫苗组合物。
另外，本发明设想了包含对第一种分离多肽特异的抗体的抗体制剂。
本发明还包括用于检测革兰氏阴性细菌感染的诊断方法，包括在样品中检测第一种分离多肽或对所述第一种分离多肽特异的抗体。
本发明还涉及被动免疫方法，包括施用抗体制剂。
本发明还提供了具有SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93或者SEQ ID NO1、4、5、8、11、14、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、86、89、92、95、96、或97所示序列的分离核酸分子，以及用于检测革兰氏阴性细菌的PCR引物，该引物包含具有SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93或者SEQ ID NO1、4、5、8、11、14、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、86、89、92、95、96、或97所示核苷酸序列中至少10个连续核苷酸的序列的分离核酸分子。探针或引物可以是至少8个、优选至少10个、更优选至少12、13、14、或15个、诸如至少20个、如至少23或25个、例如至少27或30个核苷酸的任何片段，它们对于期望扩增的序列而言是独特的或者位于期望扩增的序列中且最不保守，如在革兰氏阴性细菌之中或在革兰氏阴性细菌特定科或种之中，诸如在巴斯德氏菌之中，或者在多杀巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鸭瘟巴斯德氏菌、或大叶性肺炎放线杆菌之中，有利的是多杀巴斯德氏菌之中是保守的。对于PCR或杂交引物或探针以及它们的最佳长度，还可以参考Kajimura等人，GATA，7(4)71-79，1990。
术语“免疫原性组合物”和“免疫学组合物”和“免疫原性或免疫学组合物”覆盖引发针对目标病原体的免疫应答的任何组合物；例如在施用或注射到动物(诸如鸟类如火鸡或牛如母牛)体内后引发针对目标病原体(如多杀巴斯德氏菌)的免疫应答。术语“疫苗组合物”和“疫苗”覆盖诱发针对目标病原体的保护性免疫应答或提供针对病原体的有效保护的任何组合物；例如在施用或注射到动物(诸如鸟类如火鸡或牛如母牛)体内后引发针对目标病原体的保护性免疫应答或提供针对病原体(如多杀巴斯德氏菌)的有效保护。病原体的亚单位，如由病原体分离的抗原或免疫原或表位，病原体如细菌，诸如革兰氏阴性细菌，例如多杀巴斯德氏菌；和亚单位组合物包含或基本上由分离自病原体的一种或多种抗原、免疫原、或表位组成，病原体如细菌，诸如革兰氏阴性细菌，例如多杀巴斯德氏菌。
注意，在本公开书中，特别是在权利要求中，术语诸如“包含”、“含有”、“包括”等可以具有美国专利法中赋予它的含义；如它可以指“包括”等；而且术语诸如“基本上由…组成”具有美国专利法中赋予它的含义，如它容许未明确叙述的成分，但排除在现有技术中找到的或影响本发明的基本或新颖特征的成分。
下文发明详述公开或明显教导了这些和其它实施方案。
发明详述本发明提供了在微生物(诸如细菌，例如革兰氏阴性细菌，如多杀巴斯德氏菌)减毒中涉及的核苷酸序列和基因、由该核苷酸序列编码的产物(如蛋白质、抗原、免疫原、表位)、用于生成这些核苷酸序列、产物、微生物的方法及其用途，诸如用于制备疫苗或免疫原性组合物，或用于引发免疫学或免疫应答，或作为载体，如作为表达载体(例如体外或体内表达载体)。
导入微生物核苷酸序列和基因的突变产生了新的且非显而易见的减毒突变体。这些突变体可用于生成具有高度免疫原性的活的减毒免疫原性组合物或活的减毒疫苗。
这些突变体还可作为载体，用于表达产物的体外表达，以及用于核苷酸序列的扩增或复制(如DNA复制)，和用于体内表达产物。
突变的鉴定提供了新的且非显而易见的核苷酸序列和基因，以及由所述核苷酸序列和基因编码的新的且非显而易见的基因产物。
这些基因产物提供了抗原、免疫原、和表位，而且作为分离的基因产物是有用的。
这些分离的基因产物及其表位还可用于生成抗体，后者可用于诊断应用。
能够提供或产生表位、抗原、或免疫原的这些基因产物还可用于免疫原性或免疫学组合物和疫苗。
一方面，本发明提供了在核苷酸序列或基因中包含减毒突变的细菌，其中突变修饰、降低、或消除由基因编码的多肽或蛋白质的表达和/或生物学活性，导致细菌的毒力减弱。
突变并非必须位于编码序列或基因内才能破坏它的功能从而导致减毒。突变也可以位于参与基因表达调控的核苷酸序列中，例如位于调控转录起始、翻译、和转录终止的区域中。由此，还包括启动子和核糖体结合区(这些调控元件通常位于编码序列或基因起始密码子上游大约60至250个氨基酸；Doree SM等人，J Bacteriol，2001，183(6)1983-1989；Pandher K等人，Infect Imm，1998，66(12)5613-5619；Chung JY等人，FEMS Microbiol Letters，1998，166289-296)、转录终止子(终止子通常位于编码序列或基因终止密码子下游大约50个核苷酸内；Ward CK等人，Infect Imm，1998，66(7)3326-3336)。在操纵子中，这些调控区可能位于基因或编码序列上游更远处。基因间区域中的突变也可能导致减毒。
与编码序列或基因有关的这些调控序列内的突变修饰、抑制、或消除由此基因编码的多肽或蛋白质的表达和/或生物学活性，导致细菌的毒力减弱，因而这些突变与本发明所述的基因或编码序列内的突变是相当的。
减毒降低或消除了细菌的致病性以及临床症状或损伤的严重性，减慢了细菌的生长速度，并防止细菌引起死亡。
本发明涉及微生物，诸如细菌，如革兰氏阴性细菌，诸如巴斯德氏菌科的细菌，例如多杀巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鸭瘟巴斯德氏菌、和大叶性肺炎放线杆菌。有利的是，细菌是多杀巴斯德氏菌。
多杀巴斯德氏菌是革兰氏阴性细菌，是多种生产动物疾病的起因，而且是人类机会性病原体。它是严重巴斯德氏菌病，诸如驯养和野生鸟类的禽霍乱、牛出血性败血病、和猪萎缩性鼻炎(Hunt ML等人，VetMicrobiol，2000，72(1-2)3-25)的病原因子。可以根据被膜抗原将分离菌在血清学上分成血清组(A、B、D、E、和F)，或者根据菌体LPS抗原分成16种血清型。
使用特征标记诱变(Signature Tagged Mutagenesis，STM)已经鉴定了参与细菌减毒的潜在核苷酸序列。本文引用的文件中讨论了该方法，还可参阅WO-A-96/17951。
STM涉及将独特的、特征标记的转座子插入微生物基因组。
在插入座位，基因组核苷酸序列被破坏。在本发明中，对由此生成的突变(及由此携带突变的突变体)分析了减毒情况。
通过对转座子侧翼DNA区域的PCR扩增(聚合酶链式反应)、克隆、和测序，测定了每个减毒突变体破坏区(如基因或编码序列或开放读码框(ORF))的序列。
在本发明的一个实施方案中，修改WO-A-96/17951中描述的STM法使之在多杀巴斯德氏菌中发挥作用。需要注意的是，这些改动包括使用Tn10转座子而非Tn5，并使用不含亮氨酸的CDM培养基进行选择而非链霉素抗性选择。实施例列出了更多细节。
由通过STM法鉴定的潜在基因进一步选择参与减毒的基因或核苷酸序列的根据是动物在接种细菌突变体后没有死亡。
对于兽医学应用，本发明的一个有利方面包括在目标动物而非动物模型中直接进行实验选择。该方法能够更加准确地选择细菌突变体的适当突变。对于多杀巴斯德氏菌，实验是直接在火鸡中进行的，即多杀巴斯德氏菌的天然目标宿主之一。
给火鸡肌肉内接种足够量的特征标记的多杀巴斯德氏菌突变体集合(如每只动物0.5ml，107CFU)。认为在接种后一定时间没有被再次分离到的突变体是潜在减毒的。将没有被再次分离到的突变体与集合中再次分离的那些通过特征标签的PCR扩增和分析区分开来。
然后通过肌肉内途径将每一种潜在减毒突变体注射到火鸡体内(如每只动物0.5ml，104CFU)。记录接种后7天内每天的火鸡死亡率。认为不引起死亡的突变体是减毒的。
在多杀巴斯德氏菌菌株P-1059中进行了该特定方法，并获得了许多减毒突变体。其中5个已经于2003年4月1日保藏于法国巴黎巴斯德研究院的CNCM(国立微生物保藏中心)。4G11突变体可以在编号CNCMI-2999下获得。5D5突变体可以在编号CNCM I-3000下获得。9C8突变体可以在编号CNCM I-3001下获得。9H4突变体可以在编号CNCM I-3002下获得。13E1突变体可以在编号CNCM I-3003下获得。
转座子插入座位侧翼的核苷酸序列命名为SEQ ID NO1、4、5、8、11、14、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、86、89、92、95、96、和97。
转座子紧挨着序列1、8、11、14、15、27、33、42、54、57、66、72、73、77、80、95、和97的5′末端以及序列4、5、18、21、24、30、36、39、45、48、51、60、63、69、83、86、89、和96的3′末端插入多杀巴斯德氏菌菌株P-1059。对于突变体9H4，转座子插入序列SEQ IDNO92的第850-851位核苷酸之间。
本发明的一个具体方面是在包含选自下组的序列的基因或ORF和/或其调控区中具有减毒突变的多杀巴斯德氏菌菌株P-1059减毒突变体SEQ ID NO1、4、5、8、11、14、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、86、89、92、95、96、和97。
本发明的其它具体实施方案包括依照本发明的减毒突变体，诸如本文提及的依照布达佩斯条约的条款保藏于CNCM的减毒突变体。
例如，可以通过转座子插入或定向诱变(缺失、插入、替代)来获得P-1059减毒突变体。可以在这些核苷酸序列或基因及其互补序列中进行减毒突变。还可以在所述基因或核苷酸序列调控区包含的核苷酸序列中进行减毒突变。
上述序列或其部分(诸如它们的至少10、15、或20个核苷酸，例如它们的至少10个连续核苷酸、或它们的至少15个连续核苷酸、且更有利的是它们的至少20个连续核苷酸，直至序列全长)可以作为PCR引物用于检测并选择转座子插入突变体。PCR可以包括一对引物，例如一条对转座子特异，另一条对待突变基因或核苷酸序列特异。根据PCR扩增产物的预期大小，该方法能够扩增和/或检测PCR片段。关于生物体(如革兰氏阴性细菌，诸如巴斯德氏菌，如多杀巴斯德氏菌，例如多杀巴斯德氏菌菌株PM70或P-1059(如参见下文))中相应基因或ORF和/或其调控区的知识；例如相应基因或ORF和/或其调控区的大小，可用于设计PCR引物，用于筛选扩增得到的PCR片段，和用于检测具有正确大小的PCR片段，从而能够选择突变体。
可以在EMBL数据库和May BJ等人，Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(6)3460-3465中得到多杀巴斯德氏菌菌株PM70的完整基因组。使用序列SEQ ID NO1、4、5、8、11、14、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、86、89、92、95、96、和97进行的Blast能够在PM70基因组上定位同源序列，然后确定PM70中的对应基因或ORF。
将多杀巴斯德氏菌菌株PM70中的这些核苷酸序列命名为SEQ IDNO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、和90。
对于P-1059菌株的突变体9H4，在PM70中没有找到同源序列。已经将该P-1059 ORF测序并命名为SEQ ID NO93。
本发明的另一个方面是在包含选自下组的核苷酸序列的基因或ORF和/或其调控区中具有至少一个减毒突变的菌株PM70减毒突变体SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、和90。
可以在这些核苷酸序列或基因及其互补序列中进行减毒突变。还可以在所述基因调控区包含的核苷酸序列中进行减毒突变。例如，可以通过转座子插入或定向诱变(缺失、插入、替代)来获得减毒突变体。
术语“互补”在本文中指双链基因组中另一条链的核苷酸序列，因而覆盖作为有义链的互补链的反义链，反之亦然。术语“核苷酸”也涵盖脱氧核糖核苷酸(由此构成的脱氧核糖核酸或DNA)、核糖核苷酸(由此构成的核糖核酸或RNA)、和信使核糖核苷酸(mRNA)。
更一般的说，可以将减毒突变导入细菌的基因组，细菌诸如革兰氏阴性细菌，例如巴斯德氏菌科的细菌，如多杀巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鸭瘟巴斯德氏菌、和大叶性肺炎放线杆菌，有利的是细菌，在多杀巴斯德氏菌多种菌株之任一(如P-1059菌株、PM70菌株)的基因组中，在至少一种编码氨基酸序列的核苷酸序列中发生突变，由所述核苷酸序列编码的氨基酸序列与由SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、和93所示核苷酸序列编码的氨基酸序列之一具有至少大约70％同一性、至少大约75％同一性、至少大约80％同一性、至少大约85％同一性、至少大约90％同一性、且有利的是至少大约95、96、97、98、或99％或更多同一性。可以在这些核苷酸序列或基因及其互补序列中进行减毒突变。还可以在所述基因调控区包含的核苷酸序列中进行减毒突变。例如，可以通过转座子插入或定向诱变(缺失、插入、替代)来获得减毒突变体。得到的减毒突变体是本发明的实施方案。具体实施方案是P-1059减毒突变体。
可以通过NCBI(国家生物技术信息中心)成对blast和blosum62矩阵使用标准参数(即，注意可以在“国家生物技术信息中心”(NCBI，贝塞斯达，马里兰州，美国)服务器上以及Altschul等人，J Mol Biol，1990，215403-410中获得的BLAST或BLASTX算法；由此，该文件通过术语“blast”来谈及使用该算法或BLAST或BLASTX和BLOSUM62矩阵)来确定两种氨基酸序列之间的同一性百分比。
动词“编码”在用于本文时并非意味着将核苷酸序列限于实际的编码序列，而是同样涵盖包括并非编码序列的其调控序列在内的完整基因。
还可以使用可以在NCBI获得的Myers和Miller(OptimalAlignments in Linear Space(线性空间的最佳比对)，CABIOS，411-17，1988，收入本文作为参考)的“比对”程序以及可以通过因特网在诸如NCBI等网站获得的相同或其它程序来测定序列同源性或同一性诸如核苷酸序列同源性。
或者或另外，术语“同源性”或“同一性”，例如在用于核苷酸或氨基酸序列时，可以指两种序列之间同源性的定量测量。可以如下计算序列同源性百分比(Nref-Ndif)*100/Nref，其中Ndif指两种序列在比对时不同残基的总数，而Nref指序列之一的残基数目。由此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC将具有75％的序列同一性(Nref＝8；Ndif＝2)。
或者或另外，“同源性”或“同一性”在用于序列时可以指两种序列中核苷酸或氨基酸相同的位置数目除以较短序列的核苷酸或氨基酸数目，其中两种序列的比对可以依照Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman，1983，PNAS USA，80726，收入本文作为参考)确定，例如使用窗口大小20个核苷酸，字长4个核苷酸，且缺口补偿4，而且可以使用商品化程序(如IntelligeneticsTMSuite，Intelligenetics公司，加利福尼亚州)方便地进行包括比对在内的对序列数据的电脑辅助分析和解释。当说到RNA序列与DNA序列相似或具有一定程度的同一性或同源性时，认为DNA序列中的胸苷(T)与RNA序列中的尿苷(U)是相同的。由于认为DNA序列中的胸苷(T)与RNA序列中的尿苷(U)是相同的，因此RNA序列属于本发明的范围之内，而且可以由DNA序列衍生。
有利的是，可以使用可以在NCBI获得的BlastP程序(Altschul等人，Nucl Acids Res，253389-3402，收入本文作为参考)以及可以通过因特网在诸如NCBI等网站获得的相同或其它程序来测定序列同一性或同源性诸如氨基酸序列同一性或同源性。
下列文件(每一份都收入本文作为参考)提供了比较诸如两种蛋白质的氨基酸残基等序列的相对同一性或同源性的算法，而且另外/或者就前述而言，这些文献中的教导可用于测定同源性或同一性百分比Needleman SB和Wunsch CD，A general method applicable to the searchfor similarities in the amino acid sequences of two proteins(可用于搜索两种蛋白质氨基酸序列相似性的一般方法)，J Mol Biol，48444-453，1970；Smith TF和Waterman MS，Comparison of Biosequences(生物序列的比较)，Advances in Applied Mathematics，2482-489，1981Smith TF、Waterman MS、和Sadler JR，Statistical characterization ofnucleic acid sequence functional domains(核酸序列功能结构域的统计学鉴定)，Nucleic Acids Res，112205-2220，1983；Feng DF和DolittleRF，Progressive sequence alignment as a prerequisite to correctphylogenetic trees(渐进式序列比对作为纠正系统树的先决条件)，J ofMolec Evol，25351-360，1987；Higgins DG和Sharp PM，Fast andsensitive multiple sequence alignment on a microcomputer即微型计算机上的快速且灵敏的多序列比对，CABIOS，5151-153，1989；Thompson JD、Higgins DG、和Gibson TJ，Cluster Wimproving thesensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighing，positions-specific gap penalties and weight matrix choice即Cluster W通过序列加权、位置特异缺口补偿、和加权矩阵选项来改进渐进式多序列比对的灵敏度，Nucleic Acids Res，224673-480，1994；以及，Devereux J、Haeberlie P、和Smithies O，A comprehensive set ofsequence analysis program for the VAX即用于VAX的序列分析程序综合组，Nucl Acids Res，12387-395，1984。而且，熟练技术人员无需过度实验就能够考虑用于测定同源性百分比的许多其它程序或参考文献。
本发明涉及编码具有相同生物学功能的多肽或蛋白质的核苷酸序列或基因中的突变。可以通过活性位点的保守性来分析或鉴定或测定或检查功能相似性。这可以通过NCBI DART研究(Domain ArchitectureRetrieval Tool即结构域结构检索工具)来进行。
本发明由此提供了包含本文所述减毒突变的本文所述减毒细菌突变体。
减毒的革兰氏阴性细菌突变体包含一个突变，其中至少一种特定基因或核酸序列的全部或部分如本文所述发生突变。特定基因或核酸序列包括包含序列SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93或者与它们同源(如70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同源)的那些基因或核酸序列或其调控区。有利的是，特定基因或核酸序列包括包含序列SEQ ID NO2、6、9、12、25、31、37、40、43、46、70、75、78、81、84、87、90、或93或者与它们同源的那些基因或核酸序列或其调控区。更有利的是，特定基因或核酸序列包括包含SEQ ID NO6、12、25、31、37、40、46、70、75、84、87、90、或93或者与它们同源的那些基因或核酸序列或其调控区。甚至更有利的是，特定基因或核酸序列包括包含SEQ ID NO37、40、75、90、或93或其同源核苷酸序列或者与它们同源的那些基因或核酸序列。优选的是，突变体是巴斯德氏菌，诸如多杀巴斯德氏菌，例如P-1059或PM70。
可以使用任何已知技术将突变导入微生物，诸如例如重组DNA技术，以将详细鉴定的突变导入选定的基因或核酸序列(定向诱变)。这种突变可以是同源或异源核酸序列的插入，缺失、取代，如用另一种核苷酸取代至少一个核苷酸，或其组合。在一个实施方案中，突变是缺失突变，其中部分核酸序列或基因的缺失、有利的是整个核酸序列或基因的缺失引起基因或核酸序列的破坏。核酸的缺失避免了致病性的恢复。在另一个实施方案中，突变是本文如实施例中所述转座子插入座位的对应座位中的插入。对于P-1059菌株而言，有利的是，这些座位紧挨着序列1、8、11、14、15、27、33、42、54、57、66、72、73、77、80、95、和97的5′末端和紧挨着序列4、5、18、21、24、30、36、39、45、48、51、60、63、69、83、86、89、和96的3′末端。在PM70菌株中，这些座位位于SEQ ID NO2的第180-181位或第182-183位或第190-191位、SEQ ID NO6的第77-78位或第1026-1027位或第1027-1028位、SEQ ID NO9的第416-417位、SEQ ID NO12的第389-390位、SEQID NO16的第381-382位、SEQ ID NO19的第219-220位、SEQ IDNO22的第1353-1354位、SEQ ID NO25的第136-137位、SEQ IDNO28的第384-385位、SEQ ID NO31的第222-223位或第225-226位、SEQ ID NO34的第217-218位、SEQ ID NO37的第1411-1412位、SEQ ID NO40的第943-944位、SEQ ID NO43的第855-856位、SEQ ID NO46的第369-370位、SEQ ID NO49的第111-112位、SEQ ID NO52的第443-444位、SEQ ID NO55的第4-5位、SEQID NO61的第573-574位、SEQ ID NO64的第875-876位、SEQ IDNO70的第218-219位、SEQ ID NO75的第1072-1087位、SEQ IDNO78的第64-65位、SEQ ID NO81的第282-283位、SEQ ID NO84的第1431-1432位、SEQ ID NO87的第974-975位、SEQ ID NO90的第802-803位、或SEQ ID NO92的第850-851位核苷酸之间；或者紧挨着SEQ ID NO58的第1位核苷酸的上游；或者紧挨着SEQ IDNO67的第1位核苷酸的上游。在另外的革兰氏阴性细菌中，诸如巴斯德氏菌科成员，如多杀巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鸭瘟巴斯德氏菌、和大叶性肺炎放线杆菌，这些座位位于编码本文所定义的具有其同一性百分比的同源氨基酸序列的核苷酸序列中的(关于PM70所述)相似氨基酸对之间。由此，突变体可以是革兰氏阴性细菌，而且有利的是巴斯德氏菌，诸如多杀巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鸭瘟巴斯德氏菌、和大叶性肺炎放线杆菌，例如多杀巴斯德氏菌，诸如P-1059或PM70。
根据定义，缺失突变体包含至少一个依照本发明的核苷酸序列的缺失或本发明核苷酸序列中的缺失。这些缺失突变体包括全部或部分的特定基因序列或特定核苷酸序列得到缺失的那些突变体。一方面，突变导致占基因或特定核苷酸序列至少大约10％、至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约98％、或至少大约99％的至少一个核酸的缺失。优选的是，整个基因或特定核苷酸序列得到缺失。
突变体可以包含超过一个突变，它们可能导致累加或协同程度的减毒，而且可能导致对减毒回复的更好预防。
这些多重突变可以联合已知具有减毒特性的核苷酸序列或基因，诸如aro基因，例如aroA(Homchampa P等人，Veterinary Microbiology，1994，4235-44)的突变，以及依照本发明的核苷酸序列或基因中的突变。
在一个实施方案中，突变体包含至少一个突变，其中对于每一个突变而言，特定基因或核酸序列的全部或部分如本文所述发生突变。这些特定基因或核酸序列包括那些包含序列SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93或者与它们同源的基因或核酸序列或其调控区。由此，本发明设想了上述序列的两个或更多发生了突变(如本文所述的缺失)的突变体。有利的是，突变体中下列序列或者包含下列序列或与它们同源的序列或其调控区的两个或更多发生了突变(如本文所述的缺失)SEQ ID NO2、6、9、12、25、31、37、40、43、46、70、75、78、81、84、87、90、或93。更有利的是，发生突变的特定基因或核酸序列(如发生突变的两个或更多基因或核酸序列)包括那些包含SEQ ID NO6、12、25、31、37、40、46、70、75、84、87、90、或93或者与它们同源的基因或核酸序列或其调控区。突变体可以是革兰氏阴性细菌，而且有利的是，突变体是巴斯德氏菌，诸如多杀巴斯德氏菌，例如P-1059或PM70。
有利的是，本发明设想了下列序列或其调控区的两种或更多发生突变(如本文所述的缺失)的突变体SEQ ID NO37、40、75、90、和93或其同源核苷酸序列。
各个实施方案包括包含下列序列或者与它们同源的基因或核酸序列或其调控区本身或其中发生缺失的突变体序列SEQ ID NO37和40；SEQ ID NO37和75；SEQ ID NO37和90；SEQ ID NO37和93；SEQID NO40和75；SEQ ID NO40和90；SEQ ID NO40和93；SEQ IDNO75和90；SEQ ID NO75和93；SEQ ID NO90和93。突变体可以是革兰氏阴性细菌，而且有利的是，突变体是巴斯德氏菌，诸如多杀巴斯德氏菌，例如P-1059或PM70。
根据本公开书和本领域的知识，将突变导入特定基因组区域的方法对于熟练技术人员而言是已知和显而易见的。例如，将待突变的整个基因或序列或片段克隆到载体中，并进行修饰以消除其表达和/或其生物学活性。将载体导入细菌，例如通过电穿孔(如Jablonski L等人，Microbial Pathogenesis，1992，1263-68)或接合(Lee MD等人，Vet Microbiol，1996，50143-148)。通过遗传重组将经过修饰的DNA片段重新导入细菌基因组，有利的是通过细菌染色体与载体之间的同源重组。例如，载体可以是Cardenas(Cardenas M等人，Vet Microbiol，2001年5月3日，80(1)53-61)描述的自杀质粒。有利的是，这种载体在(同源重组中所采用的)两个侧翼臂或区域之间额外包含多终止序列(如6个终止密码子，每个读码框一个)以阻断任何可能的翻译。
本发明的减毒微生物(如革兰氏阴性细菌，诸如多杀巴斯德氏菌)还可以包含至少一种插入其基因组中的同源或异源核酸序列。这可用于在体内或在体外繁殖或复制异源核酸分子和/或表达异源核酸分子。有利的是，异源核酸序列编码与减毒微生物的天然表达的那些不同的致病病毒、寄生虫、或细菌媒介的免疫原、抗原、或表位。这种异源序列可以编码微生物或细菌的另一种菌株，如另一种多杀巴斯德氏菌菌株的免疫原、抗原、或表位。免疫原或抗原是能够诱发针对病原体或病原体分泌抗原的免疫应答的蛋白质或多肽，而且包含一个或多个表位；而表位是能够诱发针对病原体或病原体分泌抗原的免疫应答的肽或多肽。
适于这种载体中的这种用途的异源核酸序列对于熟练技术人员而言将是显而易见的(Fedorova ND和Highlander SK，Infect Immun，1997，65(7)2593-2598)，而且包括例如那些来自巴斯德氏菌科成员(特别是多杀巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鸭瘟巴斯德氏菌、和大叶性肺炎放线杆菌)或像大肠杆菌、沙门氏菌、和弯曲杆菌等细菌的序列。
有利的是，插入异源序列是为了在施用后在宿主中由微生物进行表达，从而形成针对减毒微生物和所述表达免疫原二者的免疫应答。有利的是，一起插入异源序列与容许其表达的调控元件(诸如启动子)，或者将二者可操作连接，或者使前者位于后者下游。还可以添加可用于蛋白质的寻址和表达的核苷酸序列。因此，可以在表达产物中包含前导或信号序列以便于转运穿过细胞壁和/或分泌。
在一个实施方案中，将同源或异源序列插入为了减毒而选择的核苷酸序列或基因中；有利的是，将同源或异源序列插入本文所鉴定的转座子插入座位的对应座位之一。
为了改进表达，可以修改密码子使用以适应使用的细菌载体。
本发明的减毒突变体还可以包含编码治疗性蛋白质、变应原、生长因子、细胞因子、免疫调控物、或免疫刺激物，诸如GM-CSF，例如与目标物种匹配的GM-CSF(例如，若减毒载体是多杀巴斯德氏菌，则对于对牛施用而言，可以由载体表达牛GM-CSF，例如由另一种异源蛋白质、肽、多肽、抗原、免疫原、或表位的载体进行表达)的核酸序列。
依照本发明的另一个方面，将减毒微生物用于生成活的减毒免疫原性组合物或活的减毒疫苗组合物。
依照本发明的一个有利方面，减毒微生物是依照本发明突变的革兰氏阴性细菌，诸如巴斯德氏菌，例如多杀巴斯德氏菌，例如P-1059或PM70。
有利的是，如本文所述，微生物可以作为重组载体用于动物或人针对由巴斯德氏菌以外的其它因子引起的感染的免疫和/或接种。
免疫原性组合物或疫苗组合物包含减毒突变体以及制药学或兽医学可接受载体、赋形剂、稀释剂、或介质和任选的稳定剂和/或佐剂。减毒突变体可以是额外表达对载体而言异源的核酸分子的载体，诸如异源表位、抗原、免疫原、和/或生长因子、细胞因子、免疫调控物、或免疫刺激物。
术语“免疫原性组合物”在本文中覆盖一旦注射到动物或人体内就能够引发针对靶病原体的免疫应答的任何组合物。术语“疫苗组合物”或“疫苗”在本文中覆盖一旦注射到动物或人体内就能够诱发针对靶病原体的保护性免疫应答的任何组合物。
制药学或兽医学可接受介质(vehicle)可以是水或盐水，但是它也可以包括例如细菌培养基。
可以将依照本发明的减毒细菌冻干，有利的是与稳定剂一起。可以依照众所周知的标准冻干流程来进行冻干。制药学或兽医学可接受稳定剂可以是碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、海藻糖)、谷氨酸钠(Tsvetkov T等人，Cryobiology，1983，20(3)318-323；Israeli E等人，Cryobiology，1993，30(5)519-523)、蛋白质诸如蛋白胨、清蛋白、乳清蛋白、或酪蛋白、含蛋白质物质诸如脱脂奶(Mills CK等人，Cryobiology，1988，25(2)148-152；Wolff E等人，Cryobiology，1990，27(5)569-575)、和缓冲剂(如磷酸盐缓冲剂、碱金属磷酸盐缓冲剂)。
佐剂可用于使冻干制剂可溶。
佐剂的实例是基于矿物油和/或植物油和非离子表面活性剂诸如嵌段共聚物、Tween、Span的水包油、水包油包水乳浊液。其它合适的佐剂是例如维生素E、皂角苷、和Carbopol、氢氧化铝、或磷酸铝(Vaccine Design，The subunit and adjuvant approach(疫苗设计，亚基和佐剂方法)，Pharmaceutical Biotechnology(制药学生物技术)，第6卷，Michael F.Powell和Mark J.Newman编，1995，Plenum出版社，纽约)。
活的减毒细菌可以在含甘油的培养基中保存于-70℃。
任选的是，免疫原性组合物或疫苗可以联合选自灭活或活的形式的其它致病微生物或病毒的一种或多种免疫原、抗原、或表位。
本发明的另一个方面是依照本发明的核苷酸序列或基因，诸如依照本发明的命名为SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、和93的核苷酸序列或基因，而且有利的是命名为SEQ ID NO1、4、5、8、11、14、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、86、89、92、95、96、和97的那些。
本发明的另一个方面是依照本发明的核苷酸序列或基因用于表达和产生肽、多肽、或蛋白质或者更一般的说表达产物如免疫原、抗原、或表位的用途。在一个实施方案中，由这些核苷酸序列或基因编码的多肽或肽或蛋白质可以作为亚单位免疫原或抗原或表位用于免疫原性组合物或疫苗中。表位测定流程，诸如构建重叠肽库(Hemmer B等人，Immunology Today，1998，19(4)163-168)、Pepscan(Geysen HM等人，Proc Nat Acad Sci USA，1984，81(13)3998-4002；GeysenHM等人，Proc Nat Acad Sci USA，1985，82(1)178-182；Van derZee R等人，Eur J Immunol，1989，19(1)43-47；Geysen HM，Southeast Asian J Trop Med Public Health，1990，21(4)523-533；MultipinPeptide Synthesis Kit de Chiron)、和算法(De Groot A等人，Nature Biotechnology，1999，17533-561)可用于实践本发明，而无需过度实验。
有利的多肽是那些具有SEQ ID NO3、7、10、13、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、76、79、82、85、88、91、或94所示氨基酸序列的多肽或者那些由核苷酸序列SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93编码的多肽。也可以有利地使用来自这些多肽的表位。
本发明涵盖来自另一种细菌的等同多肽，所述细菌诸如革兰氏阴性细菌，有利的是巴斯德氏菌科的成员，如多杀巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鸭瘟巴斯德氏菌、和大叶性肺炎放线杆菌，而且更有利的是在多杀巴斯德氏菌多种菌株的任一种的基因组中，包括其氨基酸序列与SEQID NO3、7、10、13、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、76、79、82、85、88、91、或94所示氨基酸序列之一具有至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、和至少大约96、97、98、或99％同一性的等同多肽和/或与以上述序列表示的多肽具有相同生物学功能的多肽。上文已经描述了确定同一性或相同生物学功能的标准。
本发明还涵盖这些多肽的免疫原性片段，其至少具有所述多肽10个氨基酸、至少20个、诸如至少30个、有利的是至少50个、且更有利的是至少70个氨基酸的链，如包含多肽的至少10个连续氨基酸、有利的是多肽的至少20个连续氨基酸、诸如多肽的至少30个且更有利的是至少50个连续氨基酸、且甚至更有利的是多肽的至少70个连续氨基酸的多肽片段。当然，片段小于完整多肽。片段可以联合其它多肽，如在融合多肽中；例如，本发明的多肽或其片段可以是包含另一个部分(另一种多肽)，如免疫原性增强部分和/或分泌增强部分，诸如增强免疫原性的脂蛋白部分或者信号或前导序列部分的融合多肽的一部分。因此，本发明设想了多肽、蛋白质、抗原、免疫原、或表位-或是本文中所鉴定的序列或其片段，或是与本发明载体异源的那些序列-作为融合体的表达，如作为融合多肽，如有利地包含免疫原性增强部分诸如脂蛋白部分和/或分泌增强部分诸如信号或前导序列部分的融合多肽的一部分。
有利的是，通过体外表达来产生多肽或片段。将依照本发明的核苷酸序列(如SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、93)或其片段插入载体，可操作地连接调控元件，诸如启动子、核糖体结合区和终止子、以及起始密码子和终止密码子。有利的载体是可用于在细菌即大肠杆菌中进行体外表达的质粒(Mahona F等人，Biochimie，1994，46(1)9-14；Watt M等人，Cell Stress Chaperones，1997，2(3)180-190；Frey J，Res Microbiol，1992，143(3)263-269)。
也可以化学合成这些多肽(Luo Y等人，Vaccine，1999，17(7-8)821-831)。
由此，本发明的一个方面是包含至少一种依照本发明的多肽或片段(亚单位免疫原性组合物或疫苗)或至少一种本文所述体内表达载体(活的重组免疫原性组合物或疫苗)以及制药学或兽医学可接受载体、赋形剂、稀释剂、或介质和任选的佐剂的免疫原性组合物或疫苗。本文在关于活的疫苗时已经描述了这些成分的实例。
在另一个实施方案中，可以将这些核苷酸序列或其片段插入重组载体以产生能够在宿主中体内表达由这种核苷酸序列或片段编码的多肽的活的重组免疫原性组合物或疫苗。
体内表达载体可以是多核苷酸载体或质粒(EP-A2-1001025；Chaudhuri P，Res.Vet.Sci.2001，70(3)255-256)、病毒(如腺病毒、痘病毒诸如禽痘(US-A-5,174,993、US-A-5,505,941、和US-A-5,766,599)或金丝雀痘(US-A-5,756,103))、或细菌即大肠杆菌或沙门氏菌。
本发明的多肽和片段还可用于治疗。
多肽和片段还可用作抗体-抗原反应中的试剂。因此，本发明的另一个方面是用于检测革兰氏阴性细菌感染的诊断方法和/或试剂盒。试剂盒如ELISA可以包含至少一种依照本发明的多肽或片段(如至少一种通过本文序列鉴定的多肽或其本文所讨论的片段)。
针对本文多肽或片段(通过本文序列鉴定的多肽或其本文所讨论的片段)的抗体可用作诊断试剂或用于被动免疫或接种疫苗或治疗。被动免疫中抗体的施用量可以与本领域用量相同或相似，使得熟练技术人员根据本领域知识就能够实践被动免疫而无需过度实验。
本发明的另一个方面是包含对依照本发明的多肽或片段特异的抗体的抗体制剂以及使用它的诊断方法。就对多肽特异的抗体而言，意味着该抗体优先结合这种多肽，如抗体结合这种多肽而不结合其它多肽，或者具有可以接受的针对这种多肽的独特特异性，这样，使用本领域已知的技术或本文引用的文件中讨论的技术(包括Sambrook，见下文)，抗体可用于由样品分离多肽或检测多肽在样品中的存在，且假阳性不超过5％。
抗体可以是多克隆的或单克隆的。
用于产生抗体的方法对于熟练技术人员而言是众所周知的。
若需要多克隆抗体，则用多肽或片段免疫选定的动物(如小鼠、兔、山羊、马、等)。由经免疫动物采集血清，并依照已知流程进行处理和可能的纯化。参阅如Jurgens等人，J Chrom，1985，348363-370。
通过杂交瘤技术制备单克隆抗体的一般方法学是众所周知的。可以通过细胞融合产生永生的抗体生成细胞系，也可以通过其它技术，诸如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或埃巴病毒转染。参阅如Liddell JE编，A practical guide to monoclonal antibodies(单克隆抗体实践指南)，John Wiley and sons，1991，第188页；de StGroth SJ等人，J ImmunolMethods，1980，35(1-2)1-21。
依照本发明的核苷酸序列及其片段可以作为探针用于杂交，如在诊断方法中。
有利的是使用严谨杂交条件。可以参考Sambrook等人，MolecularCloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验室指南)，冷泉港实验室出版社，1989，1.101-1.104。严谨条件下的杂交指用1×SSC缓冲液和0.1％SDS于55℃、有利的是62℃、且更有利的是68℃清洗1小时后仍能观察到阳性杂交信号，如用0.2×SSC缓冲液和0.1％SDS于55℃、诸如62℃、且有利的是68℃清洗1小时。
还可以通过它们在严谨杂交条件下的结合能力来表征核苷酸序列。由此，本发明可以设想本文鉴定的核酸序列和在严谨杂交条件下与它们结合的核酸分子。
依照本发明的核苷酸序列及其片段可以作为引物用于PCR或涉及扩增和/或杂交的类似方法，如用于检测任何介质，例如组织样品、生物学流体、水、食品中的革兰氏阴性细菌。
有利的是，使用具有依照本发明的核苷酸序列或基因(如SEQ IDNO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、93)的至少20个、诸如至少30个、如至少50个、例如至少70个、或更有利的是至少100个连续核苷酸的核苷酸序列片段。
另外，本发明涉及在动物或人中针对或预防细菌感染进行免疫或者针对细菌感染进行保护的方法，所述动物有利的是易受感染的动物，诸如鸟类、兔、牛、和猪，且更有利的是鸟类，诸如鸡、火鸡、和鸭(包括种畜、肉鸡、和蛋鸡)。
依照这些方法，施用(1)本发明的活的减毒免疫原性组合物或疫苗、或(2)本发明的亚单位免疫原性组合物或疫苗、或(3)本发明的活的重组免疫原性组合物或疫苗、或其联合。当然，可以与不属于本发明的其它疫苗或免疫原性组合物一起使用本发明的实施方案，如在致敏-加强过程中，诸如首先施用本发明的疫苗或免疫原性组合物，然后施用不同的疫苗或免疫原性组合物，或顺序相反。
值得注意的是，可以通过肌肉内(IM)、皮内(ID)、或皮下(SC)注射或者通过鼻内、气管内、或口服施用进行施用。有利的是，通过注射器、无针装置(像例如Pigjet、Avijet、Dermojet或Biojector(Biojet，俄勒冈，美国))、喷雾、饮用水、滴眼液施用依照本发明的免疫原性组合物或疫苗。
活的减毒免疫原性组合物或疫苗的有利施用是in ovo、通过口(如饮用水、全身喷雾)、眼(如滴眼液、全身喷雾)、气管(如喷雾)、皮内、皮下(SC)、或肌肉内(IM)途径。
熟练技术人员根据本公开书和本领域知识无需过度实验就可以确定并优化活的减毒微生物的数量。一般而言，可以在单个剂量单元中对动物(包括人)施用大约104-109CFU，有利的是大约105-108CFU，且更有利的是大约106-107CFU。
可以在单个剂量单元中通过肌肉内途径对鸟类动物施用大约104-107CFU，有利的是大约105-107CFU。单个剂量单元的体积可以在大约0.2ml与大约0.5ml之间，而且有利的是大约0.3ml。可以在单个剂量单元中通过口、气管、或眼途径对鸟类动物施用大约105-108CFU，有利的是大约106-107CFU。对于喷雾施用，根据装置和微滴大小调整体积，对于大约1000只动物是大约30ml-大约600ml，而且有利的是每只动物大约0.2ml。
对于牛和猪，有利的途径是IM和SC。可以在单个剂量单元中对动物施用大约104-109CFU，有利的是大约105-108CFU。单个剂量单元的体积可以在大约0.2ml与大约5.0ml之间，而且有利的是在大约0.5ml与大约2.0ml之间，而且更有利的是大约1.0ml。
可以在单个剂量单元中通过IM或SC途径对兔施用大约104-108CFU，有利的是大约105-107CFU。单个剂量单元的体积可以在大约0.2ml与大约0.5ml之间，而且有利的是大约0.5ml。还可以在单个剂量单元中通过ID途径对它们施用大约104-108CFU，有利的是大约105-107CFU。单个剂量单元的体积可以在大约0.1ml和大约0.2ml之间。
现在将通过下面的非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例实施例1特征标记的多杀巴斯德氏菌转座子突变体库的构建(STM筛选)标记的SM10λpir pLOF/km转化子的构建如Hensel等人(Science，1995，269400-403)所述生成标签。选择包含较好杂交但彼此不交叉杂交的标签的最初标记pUTminiTn5Km2质粒。发现标记的pUTminiTn5Km2载体中的Mini-Tn5转座子在数种多杀巴斯德氏菌菌株中不转座。相反，转座子mini-Tn10显示在多杀巴斯德氏菌中发挥功能(Lee等人，Vet Microbiol，1996，50143-148)。因此，将预先选择的标签由pUTminiTn5载体转移到包含mini-Tn10的质粒pLOF/Km(Herrero等人，J Bacteriology，1990，1726557-6567)中。使用在克隆标签的KpnI位点两侧结合pUTminiTn5Km2载体的引物通过PCR扩增标签。这些引物包含限制酶SalI的序列。然后用SalI消化PCR产物并克隆到经修饰形式的pLOF/Km载体(其中SalI位点取代了唯一的sfiI克隆位点)的SalI位点中。然后将标记的pLOF/Km质粒转化到大肠杆菌菌株SM10λpir(Kmr、thi、thr、leu、tonA、lacY、supE、recA∷RP4-2-Tc∷Muλpir)(Miller VL等人，J Bacteriol，1988，1702575-2583)中。该菌株能够通过接合动员质粒诸如pLOF/Km进入受体细菌。
筛选和反向选择的方法接合过程需要选择获得了质粒pLOF/Km的受体多杀巴斯德氏菌的方法和反向选择大肠杆菌SM10λpir供体的方法。
在选择方法中，使用由mini-Tn10转座子编码的卡那霉素选择受体多杀巴斯德氏菌。
最初，对于接合中大肠杆菌供体的反向选择使用巴斯德氏菌菌株P-1059的自发链霉素抗性突变体。然而，似乎该菌株对火鸡的毒力减弱了，因而这里不能使用。多杀巴斯德氏菌菌株能够在化学确定培养基(CDM)(Hu等人，Infection and Immunity，1986，804-810)上生长。利用这种化学确定培养基含琼脂但不含亮氨酸的经修饰形式进行针对大肠杆菌供体的反向选择。巴斯德氏菌菌株能够在这种培养基上生长，该培养基的组成列于表1中，而亮氨酸营养缺陷型的大肠杆菌SM10λpir菌株则不能。
表1
多杀巴斯德氏菌菌株在CDM培养基上的传代向冻干安瓿瓶中加入200μl BHI(脑-心浸液)使多杀巴斯德氏菌菌株(USDA P-1059，可以由美国典型培养物保藏中心获得，编号ATCC15742)复苏，取一部分悬浮液在BHI琼脂板上划线，并于37℃保温过夜。将该板上的菌落用于接种BHI肉汤培养基，并于37℃振摇培养过夜。加入甘油至终浓度15％v/v，并分装冻存于-80℃。将这些冻存分装物之一的样品在BHI琼脂板上划线，并保温过夜。然后将该BHI板上的菌落在成分如表1所列的CDM琼脂板上划线并于37℃保温3天。将该CDM板上的菌落用于接种BHI肉汤培养基，并于37℃振摇培养过夜。向此培养物中加入甘油至终浓度15％v/v，并分装冻存于-80℃。将此菌株称为16084(CDM)。
突变体库的构建将标记的SM10λpir pLOF/Km转化子与多杀巴斯德氏菌菌株16084(CDM)进行接合。为了将同胞突变体(由于突变体在接合流程过程中复制而产生的、转座子位于相同位置的突变体)的分离降至最低，将每一个标记SM10λpir转化子与多杀巴斯德氏菌菌株在至少三份分开的接合中进行接合。在补充50μg/ml卡那霉素的CDM琼脂板上选择巴斯德氏菌转座子突变体。
然后将每一个标记转座子的卡那霉素抗性突变体在BHI卡那霉素50μg/ml琼脂板上划线两次以形成单菌落。然后将单菌落接种到BHI肉汤培养基中，并于37℃振摇培养过夜。然后加入甘油至终浓度15％v/v，并将突变体在分装管中冻存于-80℃。
实施例2特征标记的巴斯德氏菌突变体库中对火鸡的毒力减弱的突变体的筛选为了给火鸡进行接种要培养多杀巴斯德氏菌突变体的培养物，将20μl实施例1中获得的突变体的每份甘油原种与200μl补充50μg/ml卡那霉素的BHI培养基混合，并置于96孔微量滴定板中。将这些微量滴定板在静止条件下于37℃保温大约18小时。然后将10μl每种突变体的18小时培养物与200μl补充50μg/ml卡那霉素的BHI培养基在新的微量滴定板中混合，并将板于37℃保温大约4小时。在生长指数期停止培养，并将100μl每种突变体的培养物转移到新的微量滴定板中，并用于测定650nm的光密度(OD)。
通过混合剩余的100μl 4小时培养物而形成接种体或输入库。每个输入库由48种不同突变体组成。通过FACS(荧光激活细胞分拣)分析测定100μl这些合并悬浮液的滴度。然后将1ml合并悬浮液在生理学缓冲液中稀释以获得滴度为2×107cfu/ml的悬浮液。然后给5只一组的三周龄火鸡肌肉内接种0.5ml这种悬浮液(每只动物107cfu)。通过在接种前一天采集的血样中筛选针对巴斯德氏菌的抗体的存在来确定火鸡接种前的血清学状况。通过离心由输入库剩余部分收获细胞，并由细胞沉淀提取染色体DNA。
接种后大约14小时，由5只火鸡中的3只采集1ml血样。将血样的稀释系列(10-1至10-7)铺展到补充5％绵羊血液的Columbia琼脂板上。将板于37℃保温24小时，然后将大约10000个巴斯德氏菌菌落重悬于BHI培养基。然后将称为输出库的这些悬浮液离心，并由细胞沉淀提取染色体DNA。
如Hensel等人所述(Science，1995，269400-403)，通过输入库和输出库DNA样品中存在的特征标签(signature tags)的PCR扩增，以及扩增得到的PCR产物与加载了特征标签编码DNA的点印迹的杂交，来鉴定输入库中存在但未能由火鸡再次分离到的巴斯德氏菌突变体。认为这些突变体的毒力潜在减弱了。这种减毒通过筛选火鸡中潜在突变体的单一感染不引起死亡进行确认。
实施例3多杀巴斯德氏菌突变体对火鸡的毒力减弱的确认为了复苏在实施例2中鉴定为潜在减毒的转座子突变体或具有在培养中生长的有限能力的突变体，将20μl甘油原种与200μl补充50μg/ml卡那霉素的BHI培养基在微量滴定板中混合。将这些微量滴定板在静止条件下于37℃保温大约18小时。然后将10μl每种突变体的这种培养物与200μl补充50μg/ml卡那霉素的BHI培养基在新的微量滴定板中混合，并将该板在静止条件下保温大约4小时。在生长指数期停止培养，并将100μl每种突变体的培养物转移到新的微量滴定板中，并用于测定650nm的光密度(OD)。然后将每种突变体的培养物在生理学缓冲液中1∶10000稀释以获得大约2×104cfu/ml的浓度。然后给2只五周龄火鸡肌肉内接种0.5ml这种稀释液(每只动物104cfu)。由接种前一天采集的血样确定每组火鸡中一些动物的血清学状况。对火鸡监测随后7天的死亡率。对于测试的突变体，72种突变体在接种的两只鸟中都未引起死亡。认为这72种突变体的毒力减弱了。
实施例4火鸡筛选后鉴定的转座子插入突变体的表征通过反向PCR或任意引发PCR克隆转座子插入一侧的侧翼DNA，从而鉴定减毒多杀巴斯德氏菌突变体基因组中的转座子插入位点。
通过在BHI卡那霉素50μg/ml琼脂板上划线，由-80℃甘油原种复苏这些突变体。然后将单菌落用于接种BHI肉汤培养基，并由此制备染色体DNA。
对于反向PCR，用限制性位点为4个碱基对的限制酶消化染色体DNA，诸如Tsp509I、αTaqI、或RsaI。然后在大体积中连接DNA以促进分子内连接。然后使用与转座子已知序列退火的向外引物由这种连接DNA模板扩增转座子侧翼DNA，诸如StipJ(SEQ ID NO98，20聚物)(5′ATC TGA TCC TTC AAC TCA GC 3′)、StipA(SEQ ID NO99，19聚物)(5′CGC AGG GCT TTA TTG ATT C 3′)、KTGRI(SEQ IDNO100，27聚物)(5′GCC GAA TTC GAT GAA TGT TCC GTT GCG3′)、Tn10IR1(SEQ ID NO101，20聚物)(5′TTT ACC AAA ATCATT AGG GG 3′)、和Tn10IR4(SEQ ID NO102，19聚物)(5′GATCAT ATG ACA AGA TGT G 3′)。然后将这些反向PCR产物克隆并测序。
对于任意引发PCR，将染色体DNA作为模板用于第一轮PCR，其中使用一种与转座子退火的外向引物诸如StipA和一种任意引物诸如arb1(SEQ ID NO103，35聚物)(5′GGC CAC GCG TCG ACT AGT CANNNN NNN NNN GAT AT 3′)或arb6(SEQ ID NO104，35聚物)(5′GGC CAC GCG TCG ACT AGT CAN NNN NNN NNN CAG CC 3′)。这第一轮PCR的退火温度最初设得非常低，并在后续循环中升高。然后将这第一轮PCR的一部分产物作为模板用于第二轮PCR。这第二轮PCR利用另一种向外引物，诸如KTGRI，它与转座子退火的位置比第一轮PCR中所使用的引物更接近转座子的末端。这第二轮PCR中所使用的另一种引物与第一轮PCR中所使用的任意引物的5′端已知序列的20个碱基具有相同序列，诸如arb2(SEQ ID NO105，20聚物)(5′GGC CACGCG TCG ACT AGT AC 3′)。然后将这第二轮PCR的PCR产物克隆并测序。
然后分析获得的序列以鉴定可能被转座子破坏的开放读码框(ORF)，并用于搜索目前可以在EMBL数据库和由明尼苏达大学(MayBJ等人，Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(6)3460-3465)测定的多杀巴斯德氏菌菌株PM70基因组序列中获得的相似序列。
注意，在下列核苷酸序列中，N相当于任何核苷酸(A或C或G或T)。
突变体1G4、3F4、3G12、12D6、和14C10突变体1G4、3F4、和12D6具有完全相同的转座子插入位点。转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO1(775聚物)。转座子是紧挨着该序列的5′末端插入的。
起始密码子位于序列SEQ ID NO1的第179-181位。
对于突变体3G12，转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ IDNO95(101聚物)。转座子是紧挨着该序列的5′末端插入的。
对于突变体14C10，转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ IDNO96(220聚物)。转座子是紧挨着该序列的3′末端插入的。
通过使用由SEQ ID NO1编码的60个氨基酸的序列进行的blast，鉴定了4个其它巴斯德氏菌科的蛋白质和基因。
转座子在突变体1G4、3F4、和12D6中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006115的第8507-8508位之间。转座子在突变体3G12中的定位对应于序列AE006115的第8609-8610位之间。转座子在突变体14C10中的定位对应于序列AE006115的第8517-8518位之间。转座子破坏了PM70基因PM0773即PhyA的同源物。PhyA基因预测参与被膜合成。PM0773的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ IDNO2，而其氨基酸序列鉴定为SEQ 1D NO3。
突变体1G8、9D1、和9D8在突变体1G8中，转座子是紧挨着序列SEQ ID NO4(226聚物)的3′末端插入的。该序列具有两个编码潜在较长蛋白质的开放读码框(+2和-2)。依照本发明的ORF是读码框-2。
在突变体9D1中，转座子是紧挨着序列SEQ ID NO5(87聚物)的3′末端插入的。
插入突变体9D8中的转座子位于序列SEQ ID NO4的第225位之后。
在突变体1G8、9D1、和9D8中，转座子破坏了PM70基因PM0871的同源物。转座子在这些突变体中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006125的第9849-9850位之间(突变体1G8)、第8899-8900位之间(突变体9D1)、或9848-9849位之间(突变体9D8)。PM0871的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO6，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO7。
通过使用SEQ ID NO7进行的blast，鉴定了另一种巴斯德氏菌科的基因/蛋白质。这是流感嗜血菌HI1586(Genbank编号U32832和AAC23234)。我们发现在PM0871与HI1586之间在507个氨基酸上具有72％同一性。
突变体2F2转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO8(78聚物)。转座子是紧挨着该序列的5′末端插入的。该序列具有三个编码潜在较长蛋白质的开放读码框(+1、+2和-1)。依照本发明的ORF是读码框+2。
在突变体2F2中，转座子破坏了PM70基因PM1727的同源基因。该转座子的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70序列Genbank编号AE006210(PM1727)的第644-645位之间。PM1727的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO9，而其氨基酸鉴定为SEQ ID NO10。
通过使用SEQ ID NO10进行的blast，鉴定了另一种巴斯德氏菌科的基因/蛋白质。这是流感嗜血菌H10621(Genbank编号U32744和AAC22281)。我们发现在PM1727与H10621之间在183个氨基酸上具有77％同一性。
PM1727是水解酶超家族的成员，具体而言，它与磷酸组氨醇磷酸酶有关。
突变体3A2转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO11(467聚物)。转座子是紧挨着该序列的5′末端插入的。
终止密码子位于第428-430位。
在突变体3A2中，转座子的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70序列Genbank编号AE006094(PM0586)的第5103-5104位之间。PM0586的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO12，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO13。
通过使用SEQ ID NO13进行的blast，鉴定了另外两种巴斯德氏菌科的基因和蛋白质。这些基因和蛋白质是溶血巴斯德氏菌A1 PlpD(Genbank编号AF058703和AAC32565)和睡眠嗜血菌31kDa(Genbank编号L07795和AAA24941)。我们发现在PM0586与溶血巴斯德氏菌PlpD之间在276个氨基酸上具有73％同一性，而在PM0586与睡眠嗜血菌31kDa之间在273个氨基酸上具有71％同一性。
PlpD和PM0586是ompA蛋白质家族的成员。
突变体3D3转座子插入位点两侧的侧翼DNA序列显示于SEQ ID NO14(204聚物，转座子在5′末端)和SEQ ID NO15(35聚物，转座子在5′末端)。
终止密码子位于SEQ ID NO14的第7-9位和SEQ ID NO15的第33-35位。
通过使用SEQ ID NO14及其编码的氨基酸序列(65个氨基酸)进行的blast，鉴定了另一种巴斯德氏菌科的基因/蛋白质。我们发现与蛋白质PM0064在65个氨基酸上具有100％同一性。转座子在突变体3D3中的定位分别对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006042的第4778-4779位或第4787-4788位之间(由SEQ ID NO14和SEQ ID NO15推导的位置)。这种差异可能是因为转座子的插入导致转座子插入位点处的少数核苷酸发生复制。第4788位位于基因PM0064中。第4778位在PM0064终止密码子的下游6bp处。PM0064的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO16，而其氨基酸序列鉴定为SEQID NO17。
通过使用SEQ ID NO17进行的blast，鉴定了其它革兰氏阴性细菌的基因和蛋白质。
突变体3D8转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO18(75聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。
转座子在突变体3D8中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006080的第7769-7770位之间。转座子破坏了PM70基因PM0445的同源物。PM0445的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO19，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO20。
突变体3F1转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO21(229聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。
转座子在突变体3E1中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006133的第9195-9196位之间。转座子破坏了PM70基因PM0940的同源物。PM0940的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO22，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO23。
通过使用SEQ ID NO17进行的blast，鉴定了其它革兰氏阴性细菌的基因和蛋白质。
突变体3H2转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO24(58聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。该序列具有两个编码潜在较长蛋白质的开放读码框(+1和-3)。依照本发明的ORF是读码框+1。
通过使用SEQ ID NO24及其编码的氨基酸序列(19个氨基酸)进行的blast，鉴定了另一种巴斯德氏菌科的基因。我们发现与蛋白质PM1951在19个氨基酸上具有100％同一性。转座子在突变体3H2中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70序列Genbank编号AE006231(PM1951，uvrA)的第9418-9419位之间。PM1951的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO25，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO26。
通过使用SEQ ID NO26进行的blast，鉴定了其它革兰氏阴性细菌的基因和蛋白质。
UvrA是DNA修复ABC切除核酸酶。
突变体4D6
转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO27(54聚物)。转座子紧挨着该序列的5′末端。该序列具有两个编码潜在较长蛋白质的开放读码框(+1和-2)。依照本发明的ORF是读码框+1。
转座子在突变体4D6中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70序列Genbank编号AE006036的第6492-6493位之间。转座子破坏了PM70基因PM0032或hktE的同源物。PM0032的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQID NO28，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO29。
通过使用SEQ ID NO29进行的blast，鉴定了另一种巴斯德氏菌科的基因/蛋白质。这是伴放线放线杆菌过氧化氢酶(Genbank编号AF162654和AAF17882)。我们发现在PM0032与伴放线放线杆菌过氧化氢酶之间在482个氨基酸上具有85％同一性。
HktE是过氧化氢酶。
突变体4F4和12A5对于突变体4F4，转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ IDNO30(172聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。
对于突变体12A5，转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ IDNO97(546聚物)。转座子是紧挨着该序列的5′末端插入的。
通过使用由SEQ ID NO30编码的57个氨基酸的序列进行的blast，鉴定了另外四种巴斯德氏菌科的基因/蛋白质。
转座子在突变体4F4中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006116的第5272-5273位之间。转座子在突变体12A5中的定位对应于序列AE006116的第5275-5276位之间。转座子破坏了PM70基因PM0776的同源物。PM0776的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO31，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO32。这些蛋白质是UDP葡萄糖脱氢酶。
突变体4F12转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO33(226聚物)。转座子紧挨着该序列的5′末端。
转座子在突变体4F12中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70序列Genbank编号AE006038的第9263-9264位之间。转座子破坏了PM70基因PM0048或fadR的同源物。PM0048的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQID NO34，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO35。FadR是大肠杆菌蛋白质的同源物，其是脂肪酸代谢的转录调控物，影响数种脂肪酸生物合成(fab)和脂肪酸降解(fad)基因。
突变体4G11转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO36(214聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。
通过使用SEQ ID NO36及其编码的氨基酸序列(70个氨基酸)进行的blast，鉴定了另一种巴斯德氏菌科的基因/蛋白质。我们发现与蛋白质PM1024在70个氨基酸上具有100％同一性。转座子在突变体4G11中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006143的第3532-3533位之间。转座子破坏了PM70基因PM1024或HtpG的同源物。PM1024的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO37，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO38。
通过使用SEQ ID NO38进行的blast，鉴定了其它革兰氏阴性细菌的基因/蛋白质
HtpG是热休克蛋白。
突变体4G11根据布达佩斯条约保藏于巴斯德研究院保藏中心，并且可以在编号CNCM I-2999下获得。
突变体5D5转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO39(252聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。
转座子在突变体5D5中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006188的第5695-5696位之间。转座子破坏了PM70基因PM1517或plpE的同源物。PM1517的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO40，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO41。
PlpE预测是膜脂蛋白。
突变体5D5根据布达佩斯条约保藏于巴斯德研究院保藏中心，并且可以在编号CNCM I-3000下获得。
突变体5F11转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO42(546聚物)。转座子紧挨着该序列的5′末端。
终止密码子位于第148-150位。
转座子在突变体5F11中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006150的第572-573位之间。转座子破坏了PM70基因PM1087或nifR3的同源物。PM1087的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO43，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO44。
通过使用SEQ ID NO44进行的blast，鉴定了另一种巴斯德氏菌科的基因/蛋白质。这是流感嗜血菌HI0979(Genbank编号U32778和AAC22639)。我们发现在PM1087与HI0979之间在332个氨基酸上具有78％同一性。
NifR3是固氮酶调控基因。
突变体5G9转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO45(43聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。该序列具有三个编码潜在较长蛋白质的开放读码框(+2、+3和-1)。依照本发明的ORF是读码框+2。
通过使用由SEQ ID NO45编码的14个氨基酸的序列进行的blast，鉴定了另外四种巴斯德氏菌科的基因/蛋白质。
转座子在突变体5G9中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006116的第573-574位之间。转座子破坏了PM70基因PM0774或hyaE的同源物。PM0774的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO46，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO47。这些基因涉及被膜合成。
突变体6E5转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO48(279聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。
起始密码子位于第169-171位。
转座子在突变体6E5中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组Genbank编号AE006182的第6673-6674位之间。转座子破坏了PM70基因PM1459或pgtB的同源物。PM1459的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQID NO49，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO50。
PgtB是磷酸甘油酸转运调控蛋白。
突变体6E6转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO51(93聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。
终止密码子位于第12-14位。
转座子在突变体6E6中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006096的第9051-9052位之间。转座子破坏了PM70基因PM0605的同源物。PM0605的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO52，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO53。
突变体6F12转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO54(772聚物)。转座子紧挨着该序列的5′末端。
起始密码子位于第2-4位。
转座子在突变体6F12中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006192的第5362-5363位之间。转座子破坏了PM70基因PM1556或comF基因的同源物。PM1556的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO55，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO56。
ComF是感受态蛋白质F。
突变体6G4转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO57(700聚物)。转座子紧挨着该序列的5′末端。
转座子在突变体6G4中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006206的第3758-3759位之间。插入在基因PM1697与PM1697之间。转座子插入了PM1696的启动子区域与起始密码子之间。
PM1696的起始密码子位于序列SEQ ID NO57的第26-28位。
PM1696的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO58，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO59。
通过使用SEQ ID NO59进行的blast，鉴定了其它革兰氏阴性细菌的基因和蛋白质。
突变体6H1转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO60(188聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。
转座子在突变体6H1中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006119的第4139-4140位之间。转座子破坏了PM70基因PM0806或speF基因的同源物。PM0806的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO61，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO62。
通过使用SEQ ID NO62进行的blast，鉴定了另外两种巴斯德氏菌科和弧菌科(Vibrionaceae)的基因/蛋白质。这些基因是流感嗜血菌speF(Genbank编号U32740和AAC22248)和霍乱弧菌鸟氨酸脱羧酶(AE004431和AAF96957)。我们发现在PM0806与流感嗜血菌speF之间在719个氨基酸上具有83％同一性。
SpeF是鸟氨酸脱羧酶。
突变体6H6转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO63(101聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。该序列具有两个编码潜在较长蛋白质的开放读码框(+1和-1)。依照本发明的ORF是读码框+1。
转座子在突变体6H6中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006155的第983-984位之间。转座子破坏了PM70基因PM1138的同源物。PM1138的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ IDNO64，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO65。
突变体7A7转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO66(222聚物)。转座子紧挨着该序列的5′末端。
转座子在突变体7A7中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006170的第7853-7854位之间(在PM1321与PM1322之间的基因间区域中)。转座子插入了PM1322的终止子区域与终止密码子之间。
终止密码子位于序列SEQ ID NO66的第25-27位。
PM1322的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO67，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO68。
突变体7F8转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO69(55聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。该序列具有三个编码潜在较长蛋白质的开放读码框(+1、+3和-3)。依照本发明的ORF是读码框+3。
转座子在突变体7F8中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006224的第8292-8293位之间。转座子破坏了PM70基因PM1866的同源物。PM1866的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO70，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO71。
突变体9C8转座子插入位点两侧的侧翼DNA序列显示于SEQ ID NO72(598聚物，转座子在5′末端)和SEQ ID NO73(561聚物，转座子在5′末端)。
终止密码子位于SEQ ID NO72的第26-28位。将序列SEQ ID NO72与73联合在一起并限于ORF。将由此生成的序列称为SEQ ID NO74(575聚物)。
转座子在突变体9C8中的定位分别对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006132的第2224-2225位或第2210-2211位之间(由SEQ ID NO72和73推导的位置)。两个位置都在基因PM0926(fimA)中。PM0926的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO75，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO76。
通过使用SEQ ID NO76进行的blast，鉴定了另一种巴斯德氏菌科的基因/蛋白质。这是流感嗜血菌FimA(Genbank编号AF053125和AAC08991)。我们发现在PM0926与流感嗜血菌FimA之间在171个氨基酸上具有77％同一性。
FimA是粘附素，一种菌毛蛋白。
突变体9C8根据布达佩斯条约保藏于巴斯德研究院保藏中心，并且可以在编号CNCM I-3001下获得。
突变体9H4
转座子插入位点两侧的侧翼DNA序列显示于SEQ ID NO92(1391聚物)。转座子插入了该序列的第850-851位之间。该序列只有一个读码框。依照本发明的ORF是读码框-2。
起始密码子位于SEQ ID NO92的第1318-1316位，而终止密码子位于第29-31位。将由此生成的ORF序列称为SEQ ID NO93(1290聚物)，而将其氨基酸序列称为SEQ ID NO94。
使用序列SEQ ID NO92和SEQ ID NO94进行的blast未能鉴定任何同源基因或蛋白质。
突变体9H4根据布达佩斯条约保藏于巴斯德研究院保藏中心，并且可以在编号CNCM I-3002下获得。
突变体10G11转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO77(70聚物)。转座子紧挨着该序列的5′末端。
起始密码子位于第62-64位。
转座子在突变体10G11中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006056的第2938-2939位之间。转座子破坏了PM70基因PM0220(rpL31_1)的同源物。PM0220的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO78，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO79。
RpL31_1是50S核糖体蛋白。
突变体11E8转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO80(506聚物)。转座子紧挨着该序列的5′末端。
起始密码子位于SEQ ID NO80的第195-197位。
转座子在突变体11E8中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006085的第282-283位之间。转座子破坏了PM70基因PM0488的同源物。PM0488的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ IDNO81，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO82。
突变体12A1转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO83(243聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。
通过使用SEQ ID NO83及其编码的氨基酸序列(81个氨基酸)进行的blast，鉴定了另一种巴斯德氏菌科的基因。我们发现与蛋白质PM0063蛋白质在81个氨基酸上具有100％同一性。转座子在突变体12A1中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006042的第2880-2881位之间。转座子破坏了PM70基因PM0063或lepA的同源物。PM0063的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO84，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO85。
通过使用SEQ ID NO85进行的blast，鉴定了其它革兰氏阴性细菌的基因和蛋白质。
LepA是GTP结合膜蛋白。
突变体12B3转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO86(147聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。
转座子在突变体12B3中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006152的第4028-4029位之间。转座子破坏了PM70基因PM1112或deaD的同源物。PM1112的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO87，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO88。
通过使用SEQ ID NO88进行的blast，鉴定了另一种巴斯德氏菌科的基因/蛋白质。这是流感嗜血菌HI0231(Genbank编号U32709和AAC21900)。我们发现在PM1112与HI0231之间在605个氨基酸上具有80％同一性。
DeaD是RNA解旋酶。
突变体13E1转座子插入位点侧翼的DNA序列显示于SEQ ID NO89(187聚物)。转座子紧挨着该序列的3′末端。该序列具有两个编码潜在较长蛋白质的开放读码框(+1和-3)。依照本发明的ORF是读码框-3。
转座子在突变体13E1中的定位对应于多杀巴斯德氏菌PM70基因组序列Genbank编号AE006138(PM0989)的第2173-2174位之间。PM0989的核苷酸序列在本文中鉴定为SEQ ID NO90，而其氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO91。
通过使用SEQ ID NO91进行的blast，鉴定了另一种巴斯德氏菌科的基因/蛋白质。这是流感嗜血菌HI0325(Genbank编号U32717和AAC21988)。我们发现在PM0989与HI0325之间在414个氨基酸上具有79％同一性。
突变体13E1根据布达佩斯条约保藏于巴斯德研究院保藏中心，并且可以在编号CNCM I-3003下获得。
实施例5转座子插入突变体的PCR选择转座子可以插入细菌基因组中的任何位置。但是可以使用PCR进行对正确突变体的选择。
使用了一对引物，其中一条是对转座子特异的，诸如Tn10IR1(SEQID NO101)、Tn10IR4(SEQ ID NO102)、KTGRI(SEQ ID NO100)、StipA(SEQ ID NO99)和StipJ(SEQ ID NO98)，而另一条是对待突变的基因或序列特异的。这种基因或其部分的核苷酸序列(如上文测定的转座子插入座位附近区域的序列)有助于设计这些引物。也可使这适应于其它多杀巴斯德氏菌菌株或其它革兰氏阴性细菌的基因或核苷酸序列，所述细菌诸如巴斯德氏菌科的细菌，特别是溶血巴斯德氏菌、鸭瘟巴斯德氏菌、和大叶性肺炎放线杆菌。
关于多杀巴斯德氏菌菌株PM70或P-1059(实施例4)中对应基因或ORF和/或其调控区的知识，诸如其大小，可用于筛选扩增得到的PCR片段，并用于检测那些具有插入待突变基因或序列中的转座子的相应大小的PCR片段。若转座子插入在基因以外，则可能不能扩增得到PCR片段，或者可能扩增得到过长的片段。由此，PCR能够选择突变体。
对于多杀巴斯德氏菌P-1059菌株，这些基因特异引物可以是
在先前获得的突变体的情况中，使用下列引物对进行PCR，而且扩增得到的PCR片段具有下列大小
实施例6转座子插入突变体针对同源攻击的功效和保护将由多杀巴斯德氏菌16084菌株衍生的转座子插入突变体(实施例1)通过滴眼液施用于三周龄常规火鸡。研究针对多杀巴斯德氏菌16084菌株的眼同源攻击的功效。
设置24组三周龄常规火鸡。第0天，各组通过滴眼液接种大约108CFU的下表所示突变体。
一组三周龄常规火鸡不进行接种，作为对照(第25组)。
所有火鸡都在第23天接受滴眼液的攻击，每只鸟施用108CFU的多杀巴斯德氏菌16084菌株。
记录攻击后2周内每天的死亡率。在研究结束时(第37天)，进行临床检查以确定存活鸟的健康状况。
根据接受攻击的鸟的数目和第37天健康鸟的数目计算保护率。
对于有些组，这些实验进行了重复，而且保护率是累计结果。本发明的有些突变体在这些实验中没有进行测试。
实施例7转座子插入突变体针对异源攻击的功效和保护将由多杀巴斯德氏菌16084菌株衍生的转座子插入突变体(实施例1)通过滴眼液施用于三周龄常规火鸡。研究针对多杀巴斯德氏菌X73菌株(USDA)的眼异源攻击的功效。
设置五组每组10只三周龄常规火鸡。第0天，各组通过滴眼液接种大约108CFU的下表所示突变体。
一组10只三周龄常规火鸡不进行接种，作为对照(第6组)。
所有火鸡都在第21天接受滴眼液的攻击，每只鸟施用106CFU的多杀巴斯德氏菌X73菌株。
记录攻击后2周内每天的死亡率。在研究结束时(第36天)，进行临床检查以确定存活鸟的健康状况。
根据接受攻击的鸟的数目和第36天健康鸟的数目计算保护率。
实施例8通过接合构建确定的缺失突变体首先，使用高保真聚合酶通过PCR扩增靶基因及侧翼DNA序列，并克隆到合适的克隆载体中。PCR引物设计成在用于反向PCR时缺失该基因以生成初始构建物。PCR引物包含XbaI位点以导入新的限制性位点，从而提供基因缺失的标志。然后将缺失构建物转移到自杀载体pCVD442(Donnenberg等人，Infection and Immunity，1991，594310-4317)中以转移到巴斯德氏菌染色体中。然后将pCVD442质粒转化到大肠杆菌菌株SM10λpir中。通过与大肠杆菌SM10λpir/pCVD442的接合，将该构建物导入多杀巴斯德氏菌菌株16084(CDM)。使用pCVD442质粒上存在的抗生素抗性标记(氨苄青霉素抗性基因)选择包含整合到染色体同源位点(局部二倍体)中的质粒的转化子和重组子。在补充1μg/ml氨苄青霉素的BHI琼脂板上选择巴斯德氏菌突变体。
pCVD442质粒的复制需要Pir蛋白质。该蛋白质是由pir基因编码的，它在供体菌株SM10λpir中作为λ噬菌体溶原体存在，而在受体多杀巴斯德氏菌中不存在。所以，pCVD442质粒在受体多杀巴斯德氏菌中不复制因此只有在质粒整合到染色体中时才能获得抗生素抗性菌落。该自杀载体还包含sacB基因，它编码酶果聚糖蔗糖酶，在存在蔗糖时其对大多数革兰氏阴性细菌有毒。因此可以采用蔗糖选择作为反向选择来分离发生了第二次重组事件导致质粒由染色体丧失的菌落。这第二次重组事件能够导致两种结果，即野生型等位基因的再生或缺失突变体的生成。通过菌落PCR鉴定包含缺失突变的菌落。
实施例9通过电穿孔构建确定的缺失突变体首先，使用高保真聚合酶通过PCR扩增靶基因及侧翼DNA序列，并克隆到合适的克隆载体中。PCR引物设计成在用于反向PCR时缺失该基因以生成初始构建物。PCR引物包含XbaI位点以导入新的限制性位点，从而提供基因缺失的标志。然后将缺失构建物转移到自杀载体pCVD442中以转移到巴斯德氏菌染色体中。通过电穿孔将该构建物导入多杀巴斯德氏菌菌株16084(CDM)。为了除去16084的实质胞外被膜，收获前将稳定期细胞用绵羊睾丸透明质酸酶(V型，使用前过滤除菌，终浓度25μg/ml)处理1小时并清洗细胞。将pCVD442(1.5μg)与细胞悬浮液在10％甘油(0.05ml，1010细胞/ml)中混合，立即将混合液转移到冰冷的1mm电穿孔杯(Biorad，Hercules，加利福尼亚，美国)中。使用GenePulser(Biorad)对细胞进行脉冲(12.5kV/cm，250欧姆，40μF)。脉冲后立即将细胞在1ml BHI中稀释，并将部分培养物(5-50μl)快速(在l-5分钟内)涂布到含1μg/ml氨苄青霉素的BHI琼脂板上。使用质粒上存在的抗生素抗性标记(氨苄青霉素抗性基因)选择包含整合到染色体同源位点(局部二倍体)中的质粒的重组子。
pCVD442质粒在受体多杀巴斯德氏菌菌株中不复制因此只有在质粒整合到染色体中时才能获得抗生素抗性菌落。该自杀载体还包含sacB基因，它编码酶果聚糖蔗糖酶，在存在蔗糖时对大多数革兰氏阴性细菌有毒。因此可以采用蔗糖选择作为反向选择来分离发生了第二次重组事件导致质粒由染色体丧失的菌落。这第二次重组时间能够导致两种结果，即野生型等位基因的再生或缺失突变体的生成。
于37℃保温2-4天后出现菌落。将菌落在相似板上划线以分离单个转化子。通过菌落PCR鉴定包含缺失突变的菌落。
实施例10疫苗和功效测试将实施例8或9中获得的减毒的缺失突变体在CDM培养基(Hu等人，Infection and Immunity，1986，804-810)中在振摇条件下培养24-48小时。
生长停止后收获培养物，随后测量光密度(OD)或pH。
通过光密度测定细菌浓度，并在需要时用新鲜培养基将浓度调至终浓度109CFU/ml。
通过接种疫苗和攻击，在三周龄火鸡中测试疫苗的功效。
在接种疫苗之前通过ELISA检查火鸡血样中是否不含巴斯德氏菌抗体。
第一组火鸡通过眼途径在0.1ml中注射108CFU来进行接种疫苗。
第二组不接种疫苗(对照组)。
所有动物在第21天或第23天通过眼途径(每只动物0.1ml，108CFU)用多杀巴斯德氏菌P-1059菌株进行攻击。
每天观察死亡率，直到第35天。
与对照相比，在接种动物中观察到较低死亡率。
下面的段落进一步描述了本发明1.革兰氏阴性细菌突变体，其中所述细菌在核苷酸序列中具有突变，且所述核苷酸序列编码的多肽与由选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示核苷酸序列，所述突变导致细菌的毒力减弱。
2.第1段的突变体，其中细菌是巴斯德氏菌科。
3.第2段的突变体，其中细菌选自多杀巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鸭瘟巴斯德氏菌、或大叶性肺炎放线杆菌。
4.第3段的突变体，其中细菌是多杀巴斯德氏菌。
5.第1-4段之任一的突变体，其中突变是核苷酸序列中的缺失、插入或核酸替代。
6.第5段的突变体，其中突变是整个核苷酸序列的缺失。
7.第5段的突变体，其中插入是在SEQ ID NO2的第180-181位或第182-183位或第190-191位核苷酸、SEQ ID NO6的第77-78位或第1026-1027位或第1027-1028位核苷酸、SEQ ID NO9的第416-417位核苷酸、SEQ ID NO12的第389-390位核苷酸、SEQ ID NO16的第381-382位核苷酸、SEQ ID NO19的第219-220位核苷酸、SEQID NO22的第1353-1354位核苷酸、SEQ ID NO25的第136-137位核苷酸、SEQ ID NO28的第384-385位核苷酸、SEQ ID NO31的第222-223位或第225-226位核苷酸、SEQ ID NO34的第217-218位核苷酸、SEQ ID NO37的第1411-1412位核苷酸、SEQ ID NO40的第943-944位核苷酸、SEQ ID NO43的第855-856位核苷酸、SEQ IDNO46的第369-370位核苷酸、SEQ ID NO49的第111-112位核苷酸、SEQ ID NO52的第443-444位核苷酸、SEQ ID NO55的第4-5位核苷酸、紧挨着SEQ ID NO58的第1位核苷酸的上游、SEQ ID NO61的第573-574位核苷酸、SEQ ID NO64的第875-876位核苷酸、紧挨着SEQ ID NO67的第1位核苷酸的上游、SEQ ID NO70的第218-219位核苷酸、SEQ ID NO75的第1072-1087位核苷酸、SEQ ID NO78的第64-65位核苷酸、SEQ ID NO81的第282-283位核苷酸、SEQID NO84的第1431-1432位核苷酸、SEQ ID NO87的第974-975位核苷酸、SEQ ID NO90的第802-803位核苷酸、或SEQ ID NO92的第850-851位核苷酸之间进行。
8.第1-7段之任一的突变体，它包含编码来自致病病毒性、寄生物性或细菌性因子的免疫原、治疗性蛋白质、变应原、生长因子或细胞因子的的异源核酸序列。
9.包含依照第1-8段之任一的减毒突变体以及制药学可接受稀释剂、载体、介质、或赋形剂的免疫原性组合物。
10.还包含佐剂的第9段的免疫原性组合物。
11.包含依照第1-8段之任一的减毒突变体以及制药学可接受稀释剂、载体、介质、或赋形剂的疫苗。
12.还包含佐剂的第11段的疫苗。
13.包含多肽以及制药学可接受稀释剂、载体、介质、或赋形剂和任选的佐剂的免疫原性组合物，所述多肽与由选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示核苷酸序列。
14.包含对多肽特异的抗体的抗体制剂，所述多肽与由选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示核苷酸序列。
15.使用多肽或对所述多肽特异的抗体来检测革兰氏阴性细菌感染的诊断方法，所述多肽与由选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示核苷酸序列。
16.依照第14段的抗体制剂用于制备针对革兰氏阴性细菌的被动免疫组合物或治疗性组合物的用途。
17.选自下组的核苷酸序列作为PCR引物用于在介质中检测革兰氏阴性细菌的用途SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示核苷酸序列或其至少20个核苷酸的片段。
***由此详细描述本发明的优选实施方案后，应当理解由上述段落定义的本发明不限于上文描述中所列出的具体细节，因为有可能对它们进行许多明显的变化且不违背本发明的精神或范围。
序列表<110>MERIAL LIMITED<120>减毒的革兰氏阴性细菌<130>454313-3171.1WO<150>60/370,282<151>2002-04-05<160>118<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>775<212>DNA<213>多杀巴斯德氏菌<220>
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权利要求
1.在编码第一多肽的第一核苷酸序列中具有突变并导致细菌的毒力减弱的革兰氏阴性细菌突变体，其中第一多肽具有氨基酸序列；第二多肽具有由SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；且第一多肽的氨基酸序列与第二多肽的氨基酸序列相同，或者第一多肽的氨基酸序列与第二多肽的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。
2.权利要求1的突变体，其中细菌是巴斯德氏菌科。
3.权利要求2的突变体，其中细菌是多杀巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鸭瘟巴斯德氏菌、或大叶性肺炎放线杆菌。
4.权利要求3的突变体，其中细菌是多杀巴斯德氏菌。
5.权利要求1的突变体，其中突变是第一核苷酸序列中的缺失、插入或核酸替代。
6.权利要求5的突变体，其中突变是整个第一核苷酸序列的缺失。
7.权利要求5的突变体，其中突变是在SEQ ID NO2的第180-181位核苷酸或第182-183位核苷酸或第190-191位核苷酸、SEQ IDNO6的第77-78位核苷酸或第1026-1027位核苷酸或第1027-1028位核苷酸、SEQ ID NO9的第416-417位核苷酸、SEQ ID NO12的第389-390位核苷酸、SEQ ID NO16的第381-382位核苷酸、SEQ IDNO19的第219-220位核苷酸、SEQ ID NO22的第1353-1354位核苷酸、SEQ ID NO25的第136-137位核苷酸、SEQ ID NO28的第384-385位核苷酸、SEQ ID NO31的第222-223位核苷酸或第225-226位核苷酸、SEQ ID NO34的第217-218位核苷酸、SEQ ID NO37的第1411-1412位核苷酸、SEQ ID NO40的第943-944位核苷酸、SEQID NO43的第855-856位核苷酸、SEQ ID NO46的第369-370位核苷酸、SEQ ID NO49的第111-112位核苷酸、SEQ ID NO52的第443-444位核苷酸、SEQ ID NO55的第4-5位核苷酸、SEQ ID NO61的第573-574位核苷酸、SEQ ID NO64的第875-876位核苷酸、SEQID NO70的第218-219位核苷酸、SEQ ID NO75的第1072-1087位核苷酸、SEQ ID NO78的第64-65位核苷酸、SEQ ID NO81的第282-283位核苷酸、SEQ ID NO84的第1431-1432位核苷酸、SEQ ID NO87的第974-975位核苷酸、SEQ ID NO90的第802-803位核苷酸、SEQID NO92的第850-851位核苷酸之间；或紧挨着SEQ ID NO58的第1位核苷酸的上游；或紧挨着SEQ ID NO67的第1位核苷酸的上游的插入。
8.权利要求1的突变体，它包含异源核酸序列。
9.权利要求9的突变体，其中异源核酸序列编码来自致病病毒性、寄生物性或细菌性因子的免疫原、治疗性蛋白质、变应原、生长因子或细胞因子。
10.包含依照权利要求1的突变体以及制药学或兽医学可接受稀释剂、载体、介质、或赋形剂的免疫原性组合物或疫苗。
11.权利要求10的免疫原性组合物或疫苗，还包含佐剂。
12.包含依照权利要求9的突变体以及制药学或兽医学可接受稀释剂、载体、介质、或赋形剂的免疫原性组合物或疫苗。
13.权利要求12的免疫原性组合物或疫苗，还包含佐剂。
14.具有氨基酸序列的分离第一多肽，其中第二多肽具有由SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；且第一多肽的氨基酸序列与第二多肽的氨基酸序列相同，或者第一多肽的氨基酸序列与第二多肽的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。
15.包含权利要求14的分离第一多肽以及制药学或兽医学可接受稀释剂、载体、介质、或赋形剂和任选的佐剂的免疫原性或疫苗组合物。
16.包含对权利要求14的分离第一多肽特异的抗体的抗体制剂。
17.用于检测革兰氏阴性细菌感染的诊断方法，包括在样品中检测权利要求14的分离第一多肽或对所述分离第一多肽特异的抗体。
18.被动免疫方法，包括施用依照权利要求16的抗体制剂。
19.具有SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示序列的分离核酸分子。
20.用于检测革兰氏阴性细菌的PCR引物，包含具有SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示核苷酸序列至少10个连续核苷酸的序列的分离核酸分子。
21.权利要求1的突变体，其中突变体是在编码多肽的核苷酸序列中具有突变并导致细菌的毒力减弱的革兰氏阴性细菌突变体，其中多肽具有由SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。
22.权利要求14的分离多肽，具有由SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。
23.权利要求1的突变体，其是可以以编号CNCM I-2999获得的突变体4G11或具有它的所有鉴定特征的细菌；可以以编号CNCM I-3000获得的突变体5D5或具有它的所有鉴定特征的细菌；可以以编号CNCMI-3001获得的突变体9C8或具有它的所有鉴定特征的细菌；可以以编号CNCM 1-3002获得的突变体9H4或具有它的所有鉴定特征的细菌；或者可以以编号CNCM I-3003获得的突变体13E1或具有它的所有鉴定特征的细菌。
24.具有SEQ ID NO1、4、5、8、11、14、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、86、89、92、95、96、或97所示序列的分离核酸分子。
25.用于检测革兰氏阴性细菌的PCR引物，包含具有SEQ ID NO1、4、5、8、11、14、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、86、89、92、95、96、或97所示核苷酸序列至少10个连续核苷酸的序列的分离核酸分子。
26.在SEQ ID NO1、4、5、8、11、14、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、86、89、92、95、96、或97所示核苷酸序列中具有突变的革兰氏阴性细菌突变体。
27.权利要求26的突变体，其是巴斯德氏菌科。
28.权利要求26的突变体，其中细菌是多杀巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鸭瘟巴斯德氏菌、或大叶性肺炎放线杆菌。
29.权利要求26的突变体，其中细菌是多杀巴斯德氏菌。
30.权利要求26的突变体，它包含异源核酸序列。
31.权利要求30的突变体，其中异源核酸序列编码来自致病病毒性、寄生物性或细菌性因子的免疫原、治疗性蛋白质、变应原、生长因子或细胞因子。
32.包含依照权利要求26的突变体以及制药学或兽医学可接受稀释剂、载体、介质、或赋形剂的免疫原性组合物或疫苗。
33.权利要求32的免疫原性组合物或疫苗，还包含佐剂。
34.包含依照权利要求30的突变体以及制药学或兽医学可接受稀释剂、载体、介质、或赋形剂的免疫原性组合物或疫苗。
35.权利要求34的免疫原性组合物或疫苗，还包含佐剂。
36.由权利要求24的核酸分子编码的分离多肽。
全文摘要
本发明公开并要求保护革兰氏阴性细菌的突变体，其中所述细菌在核苷酸序列中具有至少一处突变，且由所述核苷酸序列编码的多肽与由选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性SEQ ID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、和93所示核苷酸序列，所述突变导致细菌的毒力减弱。本发明还公开并要求保护包含这种突变体的免疫原性组合物和疫苗。
文档编号G01N33/569GK1934240SQ03812380
公开日2007年3月21日 申请日期2003年4月4日 优先权日2002年4月5日
发明者H·R·科鲁克, J·E·施, R·G·费尔德曼, S·G·科特布罗泽, F-X·里格罗斯 申请人:梅瑞尔有限责任公司