专利名称：一种食物过敏原检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种食物过敏原检测盒，尤其涉及一种半定量或定量检测人血清中食物不耐受特异性IgG的免疫印记(Western Blot)检测试剂盒,本发明还涉及一种食物过敏原检测方法。
背景技术：
过敏性疾病是现代社会中最常见的一种疾病，其发病机理是机体受抗原物质(也称过敏原allergen或变应原)刺激后引起的组织损伤或生理功能紊乱。食物不耐受性是过敏性疾病的一种，其为复杂的变态反应性疾病，病变机理为人的免疫系统把进入体内的某种或多种食物当作是有害物质，从而针对这些物质产生过度的保护性免疫反应，产生食物特异性IgG抗体。 食物在进入消化道后，理论上应当被消化分解为氨基酸、甘油和单糖，然后转化为能量或者人体组织构成。但事实并非如此，很多食物(包括我们最常食用的某些食物)因为缺乏相应的酶而无法被人体完全消化，从而以多肽或其它形式进入肠道，其中一些会被机体作为外来物质识别而产生免疫反应，最后生成具有食物特异性的IgG抗体。当该IgG抗体与再次食物颗粒接触的时候，其将与食物颗粒形成免疫复合物(III型变态反应)，并被机体当作废物从肾脏排出。而并不是所有的免疫复合物都能通过肾小球滤膜，无法过滤的免疫复合物则会堵塞肾脏的滤过结构，导致肾小球滤过压升高，继而导致血压升高、血管壁扩张和胆固醇沉积。人体废液(尤其是脂肪细胞)不能正常通过肾脏排出而潴留在组织中，最终会导致水肿和肥胖。如果不及时改变饮食结构，不耐受的食物会继续形成复合物，加重原有的症状并不断持续。从而导致免疫系统超负荷，致使人体各系统出现如高血压、月巴胖、头痛或偏头痛、慢性腹泻、疲劳、感染等一系列症状疾病。目前确定过敏原的方法主要皮内试验和点刺试验，该方法一般半小时即可获得检测结果，具有简便、快速、价廉的优点。但缺陷在于假阳性高并受其他药物的影响较大，试验前24小时内服用抗过敏药物会影响测定结果，甚至严重过敏反应的患者进行皮肤试验还会有一定的生命危险。当然也可以有通过体外实验检测出过敏原的种类，如通过抽取少量血清，然后检测样品中对某些过敏原产生的特异性IgG的含量，完成过敏原筛查及特异性过敏原的检测。但该方法往往操作起来极为不便。

发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明第一方面提供一种灵敏度高，使用方便、安全的食物过敏原检测试剂盒；第二方面提供了使用该检测盒检测食物过敏原的方法。为解决第一方面问题，本发明提供如下技术方案一种食物过敏原检测试剂盒，其特征在于食物过敏原检测试剂盒包括包被有过敏原蛋白及人IgG标准品的硝酸纤维膜试纸条及反应槽，所述试纸条位于反应槽的底部。
进一步,所述食物过敏原检测试剂盒还包括生物素标记的抗人IgG抗体试剂瓶，亲和素-辣根过氧化物酶试剂瓶，TMB底物显色瓶，样本稀释液瓶。进一步，所述硝酸纤维膜试纸条不同位置包被有若干种食物过敏原蛋白，此不同位置区域定义为检测区域。进一步，所所述食物过敏原蛋白为奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类的之中的若干种。进一步，所述硝酸纤维膜试纸条在特定位置还包被有若干不同浓度的人IgG标准品，此特定位置区域定义为标准品区域。为解决第二方面问题，本发明提供了如下技术方案一种运用如上所述试剂盒检测食物过敏原方法，该方法包括以下步骤步骤一提取血清制备样本液并加以稀释，加入所述样本液到带有硝酸纤维膜试纸条的反应槽中，使样本液中的食物不耐受IgG抗体与试纸条上固相过敏原蛋白结合成 IgG抗体-过敏原蛋白复合物；步骤二 向反应槽中加入生物素标记的抗人IgG抗体，使IgG抗体-过敏原蛋白复合物与生物素标记的抗人IgG抗体结合成生物素标记的抗人IgG抗体-IgG抗体-过敏原蛋白复合物；同时，生物素标记的抗人IgG抗体与试纸条上固相人IgG标准品结合成生物素标记的抗人IgG抗体-人IgG标准品复合物；步骤三向反应槽中加入亲和素-HRP，使其与生物素标记的抗人IgG抗体-IgG抗体-过敏原蛋白复合物及生物素标记的抗人IgG抗体-人IgG标准品复合物相结合；步骤四向反应槽中加入TMB底物显色液，根据试纸条标准品区域产生颜色的位置及颜色的深浅得到特定IgG浓度所对应颜色的参考值；或使用适配生物信号分析仪得到食物不耐受IgG浓度-颜色标准曲线，根据试纸条检测区域产生颜色的位置判断样本液中食物不耐受IgG的种类；根据纸条检测区域颜色的深浅结合特定IgG浓度所对应颜色的参考值半定量判断样本液中食物不耐受IgG的浓度；或使用适配生物信号分析仪分析样本液中食物不耐受IgG的种类及定量检测样本液中食物不耐受IgG的浓度。进一步，所述步骤一前所述反应槽在室温下平衡10分钟，用稀释的清洗液快速湿润，在所述步骤一中所述样本液在带硝酸纤维膜试纸条的反应槽中室温下孵育45分钟后清洗反应槽除去杂质蛋白。进一步，在所述步骤二中反应槽中加入生物素标记的抗人IgG抗体在室温中孵育45分钟后清洗反应槽除去多余抗人IgG抗体。进一步，在所述步骤三中亲和素-HRP在反应槽中室温孵育20分钟，清洗反应槽除去多余的亲和素-HRP。进一步，在所述步骤四中向反应槽中加入TMB底物显色液后避光反应15分钟。本发明的第一方面，由于反应槽内底部设硝酸纤维膜试纸条，该硝酸纤维膜试纸条被有若干种过敏原蛋白，试剂盒中还盛放有检测所需的其他试剂组分，加入检测者的血清样本于反应槽中，按照本发明第二方面的步骤检测，即可方便的检测出检测者食物过敏原的种类及程度，灵敏度高，使用方便、安全。


下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中图I是本发明中反应槽结构示意图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明进一步详细说明。请参阅附图1，本发明提供了一种食物过敏原检测试剂盒，可用于对人体食物过敏原进行检测，包括包被有过敏原蛋白及人IgG标准品的硝酸纤维膜试纸条200及反应槽100，所述试纸条位于反应槽100的底部。该试剂盒还包括生物素标记的抗人IgG抗体试剂瓶，亲和素-辣根过氧化物酶试剂瓶，TMB底物显色瓶，样本稀释液瓶，其在盒中的位置没有特别要求。
该试纸条上检测区域210包被有若干食物过敏原蛋白211，该食物过敏原蛋白211分居于硝酸纤维膜试纸条200的不同位置，即硝酸纤维膜试纸条不同位置包被有若干种食物过敏原蛋白，此不同位置区域定义为检测区域。按照人体日常进食，该食物过敏原蛋白211包括为奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类的之中的若干种。例如奶类食物过敏原可以包括牛奶、羊奶等提取蛋白；蛋类食物过敏原可以包括家禽蛋白、家禽蛋黄等提取蛋白；肉类食物过敏原可以包括猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉、鸡肉、鹅肉、火鸡肉、驴肉等提取蛋白；谷物类食物过敏原蛋白可以包括玉米、小麦、燕麦、大麦、乔麦、大米、小米等提取蛋白；坚果类食物过敏原蛋白可以包括杏仁、花生、榛子、腰果、核桃、开心果、巴西坚果、芝麻等提取蛋白；水果类食物过敏原蛋白可以包括西瓜、菠萝、橙子、芒果、香蕉、柑桔、胡袖、拧橡、苹果、葡萄、梨、草莓、桃等提取蛋白；蔬菜类过敏原蛋白可以包括萝卜、芹菜、菠菜、洋葱、茄子、大蒜、辣椒、土豆、西红柿等提取蛋白；水产类食物过敏原蛋白可以包括带鱼、黄鱼、比目鱼、三文鱼、鲳鳊鱼、鲫鱼、草鱼、链鱼、龙虾、河奸、蟹、蛘、贝类、牡蛎、黄鳝、鲤鱼等提取的蛋白；豆类食物过敏原蛋白可以包括扁豆、蚕豆、黄豆、豌豆等提取的蛋白；一般情况所述过敏原蛋白应尽可能种类全，以便搜寻出过敏原蛋白种类；当然如果需要检查某人对特定食物是否过敏，则只需包被该特定食物过敏原蛋白即可。食物过敏原的制备方法为将含过敏原蛋白的食物经粉碎、脱脂、提取、浓缩、SDS-PAGE电泳鉴定、洗脱、然后冷冻贮存备用。该试纸条上标准品区域220包被有若干人IgG标准品221,该人IgG标准品221分居于硝酸纤维膜试纸条200的不同位置，即硝酸纤维膜试纸条在特定位置还包被有若干不同浓度的人IgG标准品，此特定位置区域定义为标准品区域。人IgG标准品221由商品化的人IgG稀释为不同浓度获得。以上食物过敏原蛋白211的制备方法为奶类食物过敏原蛋白奶类必须新鲜,经巴氏灭菌的奶类不能用于制作奶类食物过敏原蛋白。奶类过敏原蛋白分为乳清白蛋白(Iactalbumin)和酪蛋白(casein)两类,具体制备方法包括以下步骤(a)先用离心法(2400转/分钟)离心15分钟，用小匙除去上层脂肪，取400ml脱脂乳，加入5ml 1%凝乳酶或乳冻片，不搅拌，放入37°C恒温水浴或孵箱内30分钟，如乳清白蛋白与酷蛋白分离，用干净纱布过滤，再用普通滤纸过滤。按I : 2(W/V)的比例，用缓冲盐水提取液(buffer saline solution)稀释乳清蛋白即为乳清蛋白提取液。其中所述缓冲盐水提取液(buffer saline solution) (pH = 8)具体配方为氯化钠5. Og ;磷酸二氢钾0. 36g ;磷酸氢二钠7. Og ;结晶酚4. Og ;蒸馏水1000ml，将上述质量的成分混合后水浴加热至完全溶解后备用，如PH低于或高于8，可用氢氧化钠或盐酸调正。(b)将含有乳清的滤液加3倍丙酮，放入冰箱24h，使乳清沉淀；用离心法除去上清液，再用丙酮浸洗几次，干燥后研细成粉未贮存。提取时按I : 50 (W/V)用缓冲盐水提取液在冰箱内提取48小时，每日搅拌或振荡2小时。酪蛋白用丙酮和乙醚反复脱脂、最后研磨，用3号或4号筛筛出，按I : 50(W/V)比例提取。蛋类食物过敏原蛋白取鲜蛋一个，用肥皂水洗刷干净，两端各打一个小孔，小端朝下使蛋白流出，与蛋黄分离。蛋白和蛋黄均按I : 20(W/V)的比例用缓冲盐水提取液稀释，充分混匀后直接过滤和除菌，不需提取，亦无需作毒性试验。蛋黄也可制成干粉，方法是加入丙酮脱脂2-3小时，倾去丙酮层，待挥发干燥后，用打碎机打碎，再用乙醚脱脂4小时备用。蛋黄干粉按I : 50比例(W/V)用缓冲盐水提取液提取。肉类食物过敏原蛋白取新鲜瘦肉，去掉脂肪和结缔组织，剁成碎末，或用绞肉机绞碎。交替用甲苯、二甲苯、丙酮及乙醚等不同溶剂反复脱脂，室温下干燥，过筛，贮存于密闭玻璃瓶中备用。按I : 25(W/V)的比例用缓冲盐水提取液提取48小时。粗滤后如滤液混浊，可用分液漏斗加乙醚再脱脂。谷物类食物过敏原蛋白将谷物类种子粉碎，过筛，乙醚脱脂2次(4小时)备用。按I : 10(W/V)比例用缓冲盐水提取液提取48小时，在此过程中，每日搅拌或振荡2小时。先用布氏漏斗抽滤或用离心法分离沉淀粉，再用常压过滤。坚果类食物过敏原蛋白取生的未经加工的原材料，取出皮壳，捣碎，以甲苯、丙酮和乙醚反复脱脂，过2号或3号筛，贮存于密闭的玻璃瓶中备用。按I : 25(W/V)的比例用缓冲盐水液在冰箱中提取48小时，在此过程中，每日搅拌或振荡2小时。滤液如果混浊，应再用分液漏斗加乙醚脱脂。水果类食物过敏原蛋白新鲜材料洗净，去外皮及枝叶，切碎或捣烂，挤出汁液，或制成果酱。果汁按2 I的比例(W/V)用缓冲盐水提取液稀释即可；果酱按I : I的比例(W/V)加入缓冲盐水提取液在冰箱中提取48小时，在此过程中，每日振荡2小时。蔬菜类食物过敏原蛋白新鲜材料洗净，带皮者去皮，切成细末，或用捣碎机打碎。按I : I的比例(W/V)用缓冲盐水在冰箱中提取48小时，在此过程中，每日搅拌或振荡2小时，普通滤纸过滤。如含脂肪的蔬菜，需用分液漏斗加乙醚脱脂。水产类食物过敏原蛋白材料清洗，去掉鳞、壳、内脏，将肉取下，剁碎，在干燥器中干燥，交替用丙酮、甲苯、乙醚脱脂，干燥后研磨，3号或4号筛过筛备用。按I : 25(W/V)的比例用缓冲盐水提取液提取48小时。粗滤后如滤液混浊，可用分液漏斗加乙醚再脱脂。豆类食物过敏原蛋干燥、去壳、脱皮、磨粉贮存；在索氏提取器中按粉正己烷=I 10(W/V)的比例脱脂6小时，干燥脱脂粉再磨细贮于_20°C下的密封容器中备用。脱脂粉用提取缓冲液(含20mmol NaH2P04, lmol/L NaCl，pH7.0)提取蛋白；脱脂粉提取缓冲液的比例为Ig 10ml(W/V)，室温提取1.5小时，然后41下2000(^离心30分钟，保存上清液。抗原、标准条带预包被硝酸纤维膜的制备方法如下
(a)选取提取的17种食物过敏原蛋白用抗原包被液(0. 01mol/L磷酸缓冲液，PH5. 5)分别稀释到合适浓度(选取的过敏原蛋白分别为牛奶、虾、鸡蛋白、牛肉、羊肉、花生、腰果、苹果、葡萄、芹菜、大蒜、鲫鱼、草鱼、蟹、蛘、蚕豆、辣椒)，以条带方式包被硝酸纤维膜特定位置(但不限于条带方式)；将实施例I得到的3种人IgG标准品以条带方式包被于硝酸纤维膜特定位置(但不限于条带方式)，晾干。当然应当知道，提取的食物过敏原蛋白种类不限于17种；人IgG标准品不限于3种。其包被情况可参阅附图I。(b)封闭将已包被有过敏原抗原及人IgG标准品的硝酸纤维膜浸泡于含5%牛血清白蛋白的封闭液中，4 °C过夜，倒掉封闭液。(C)干燥将封闭后的硝酸纤维膜浸泡于含15%蔗糖和5%甘油的磷酸缓冲液中室温保护3小时，倒掉保护液，至干燥室干燥。(d)将干燥后的硝酸纤维膜200粘贴于双面带胶的PVC胶板表面，将胶板切割成合适尺寸并粘贴于反应槽100的底部，装入含干燥剂的包装中保存。 其他试剂的制备生物素标记抗体的制备用长臂活化生物素sulfo-NHS-LC-LC-biotin标记纯化的抗人IgG抗体；亲和素-辣根过氧化物酶的制备用辣根过氧化物酶标记亲和素；TMB底物显色液配制采用商品化的TMB显色剂。样本稀释液配制选取0. 01mol/L PBS,1% BSA, pH :7. 2。浓缩洗涤液的制备:将80gNaCl ；3. 8g KCl ；5. 85g Tris Base ；31. 75g Tris HCl ；5ml Tween-20,用1000ml蒸懼水配成浓缩洗漆液。试剂盒的组装如下按每盒12份粘贴于反应槽100底部的硝酸纤维膜试纸条200，一瓶生物素标记抗体(4ml)瓶亲和素-辣根过氧化物酶(4ml);—瓶TMB底物显色液(4ml);—瓶(25X)浓缩清洗液(20ml)瓶样本稀释液(IOml)。本发明还揭示一种使用该检测盒检测食物过敏原的方法，其具体检测步骤为步骤一提取血清制备样本液，加入所述样本液到带硝酸纤维膜试纸条200的反应槽100中室温下孵育45分钟，使样本液中的食物不耐受IgG抗体与试纸条上固相过敏原蛋白结合成IgG抗体-过敏原蛋白复合物，清洗反应槽100除去杂质蛋白；步骤二 向反应槽100中加入生物素标记的抗人IgG抗体在室温中孕育45分钟后，使IgG抗体-过敏原蛋白复合物与生物素标记的抗人IgG抗体结合成生物素标记的抗人IgG抗体-IgG抗体-过敏原蛋白复合物；使人IgG标准品与生物素标记的抗人IgG抗体结合成生物素标记的抗人IgG抗体-人IgG标准品复合物。清洗反应槽100除去多余抗人IgG抗体；步骤三向反应槽100中加入亲和素-HRP室温孵育20分钟，使其与生物素标记的抗人IgG抗体-IgG抗体-过敏原蛋白复合物及生物素标记的抗人IgG抗体-人IgG标准品复合物相结合，清洗反应槽100除去多余的亲和素-HRP ；步骤四向反应槽100中加入TMB底物显色液避光反应15分钟，根据试纸条标准品区域产生颜色的位置及颜色的深浅得到特定IgG浓度所对应颜色的参考值。或使用适配生物信号分析仪得到食物不耐受IgG浓度-颜色标准曲线，根据试纸条检测区域产生颜色的位置判断样本液中食物不耐受IgG的种类；根据纸条检测区域颜色的深浅结合特定IgG浓度所对应颜色的参考值半定量判断样本液中食物不耐受IgG的浓度。或使用适配生物信号分析仪分析样本液中食物不耐受IgG的种类及定量检测样本液中食物不耐受IgG的浓度。步骤一前所述反应槽100在室温下平衡10分钟，用稀释的清洗液快速湿润。本发明的第一方面，由于反应槽100内底部设有硝酸纤维膜试纸条200，该硝酸纤维膜试纸条200包被有若干种过敏原蛋白211及若干种人IgG标准品221，试剂盒中还盛放有检测所需的其他试剂组分，加入检测者的血清样本于反应槽100中，按照本发明第二方面的步骤检测，即可方便的检测出检测者食物过敏原的种类及程度，灵敏度高，使用方便、安全。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种食物过敏原检测试剂盒，其特征在于食物过敏原检测试剂盒包括包被有过敏原蛋白及人IgG标准品的硝酸纤维膜试纸条及反应槽，所述试纸条位于反应槽的底部。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述食物过敏原检测试剂盒还包括生物素标记的抗人IgG抗体试剂瓶，亲和素-辣根过氧化物酶试剂瓶，TMB底物显色瓶，样本稀释液瓶。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述硝酸纤维膜试纸条不同位置包被有若干种食物过敏原蛋白，此不同位置区域定义为检测区域。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述食物过敏原蛋白为奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类的之中的若干种。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述硝酸纤维膜试纸条在特定位置还包被有若干不同浓度的人IgG标准品，此特定位置区域定义为标准品区域。
6.一种运用如权利要求I 5所述试剂盒检测食物过敏原的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 步骤一提取血清制备样本液并加以稀释，加入所述样本液到带有硝酸纤维膜试纸条的反应槽中，使样本液中的食物不耐受IgG抗体与试纸条上固相过敏原蛋白结合成IgG抗体-过敏原蛋白复合物； 步骤二 向反应槽中加入生物素标记的抗人IgG抗体，使IgG抗体-过敏原蛋白复合物与生物素标记的抗人IgG抗体结合成生物素标记的抗人IgG抗体-IgG抗体-过敏原蛋白复合物；同时，生物素标记的抗人IgG抗体与试纸条上固相人IgG标准品结合成生物素标记的抗人IgG抗体-人IgG标准品复合物； 步骤三向反应槽中加入亲和素-HRP，使其与生物素标记的抗人IgG抗体-IgG抗体-过敏原蛋白复合物及生物素标记的抗人IgG抗体-人IgG标准品复合物相结合； 步骤四向反应槽中加入TMB底物显色液，根据试纸条标准品区域产生颜色的位置及颜色的深浅得到特定IgG浓度所对应颜色的参考值；或使用适配生物信号分析仪得到食物不耐受IgG浓度-颜色标准曲线，根据试纸条检测区域产生颜色的位置判断样本液中食物不耐受IgG的种类；根据纸条检测区域颜色的深浅结合特定IgG浓度所对应颜色的参考值半定量判断样本液中食物不耐受IgG的浓度；或使用适配生物信号分析仪分析样本液中食物不耐受IgG的种类及定量检测样本液中食物不耐受IgG的浓度。
7.根据权利要求6所述的检测食物过敏原方法，其特征在于所述步骤一前所述反应槽在室温下平衡10分钟，用稀释的清洗液快速湿润，在所述步骤一中所述样本液在带硝酸纤维膜试纸条的反应槽中室温下孵育45分钟后清洗反应槽除去杂质蛋白。
8.根据权利要求7所述的检测食物过敏原方法，其特征在于在所述步骤二中反应槽中加入生物素标记的抗人IgG抗体在室温中孵育45分钟后清洗反应槽除去多余抗人IgG抗体。
9.根据权利要求8所述的检测食物过敏原方法，其特征在于在所述步骤三中亲和素-HRP在反应槽中室温孵育20分钟，清洗反应槽除去多余的亲和素-HRP。
10.根据权利要求9所述的检测食物过敏原方法，其特征在于在所述步骤四中向反应槽中加入TMB底物显色液后避光反应15分钟。
全文摘要
本发明提供一种食物过敏原检测试剂盒及检测方法，第一方面提供一种灵敏度高，使用方便、安全的食物过敏原检测试剂盒；第二方面提供了使用该检测盒检测食物过敏原的方法。食物过敏原检测试剂盒包括包被有过敏原蛋白及人IgG标准品的硝酸纤维膜试纸条及反应槽，所述试纸条位于反应槽的底部。由于反应槽内底部设有试纸条，该试纸条包被有若干种过敏原蛋白，试剂盒中还盛放有检测所需的其他试剂组分，加入检测者的血清样本于反应槽中，按照本发明第二方面的步骤检测，即可方便的检测出检测者食物过敏原的种类及程度，灵敏度高，使用方便、安全。
文档编号G01N33/558GK102798721SQ20121017108
公开日2012年11月28日 申请日期2012年5月28日 优先权日2012年5月28日
发明者王永昌, 李光星 申请人:上虞常春生物技术有限公司