专利名称：一种血清总胆汁酸的测定试剂及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于体外定量测定血清中总胆汁酸含量的检测技术，包括用于胆汁酸检测的测定试剂及利用这种试剂进行检测的方法，特别是这种测定试剂既可以是溶液形态的，也可以是固定化形态的。
背景技术：
目前研究发现多种疾病对胆汁酸代谢都有干扰作用，研究这种作用时经常对生物标本进行严格的分级分离，并运用层析技术对各个胆汁酸组分进行详尽的研究。但是，在临床实践中，大多数情况下，如对肝胆疾病(肝炎、肝硬化、肝癌等)、胃肠疾病(胃溃疡、肠炎、肠胃癌等)以及引起胆汁酸代谢发生改变的其它疾病，只需对总胆汁酸水平进行测定。早在20世纪70年代，挪威科明公司采用3 α -羟基类固醇脱氢酶(3 a -HSD)成功的生产出第一代酶法胆汁酸试剂，使胆汁酸的测定真正的进入了临床领域。后来，挪威科明公司和日本第一化学进行了改进，采用启动试剂，成为了第二代胆汁酸试剂。之后，日本第一化学又开发出第三代胆汁酸测试试剂盒，其具体原理是血清中总胆汁酸在NAD+存在下，3 a-HSD作用于3-α羟基生成中间产物3_酮类固醇，NAD+被还原为NADH ;在黄素酶的存在下，NADH氧化为NAD+，而共存的NBT还原为甲潜衍生物，产物蓝紫色结晶在OD540处有特异性吸收，甲潜衍生物的生成量与血清中总胆汁酸含量成正比。由于生成的色素水溶性较差，导致仪器污染严重，并且该试剂反应易受血液中还原性物质及酶的干扰，因此逐渐被新的检测方法所替代。随后又先发发展了第四、第五代胆汁酸检测技术，其原理是胆汁酸被3 α -羟基类固醇脱氢酶(3a_HSD)及Thio-NAD+特异性的氧化，生成3_酮类固醇及Thio-NADH0此外，新生成的3-酮类固醇在3a-HSD及NADH的存在下，生成胆汁酸及NAD+。这样血清中的微量胆汁酸在多次酶循环的过程中被放大，同时可使生成的Thio-NADH扩增。在405nm波长处Thio-NADH有特异性的吸收，测定Thio-NADH吸光度值的变化，可以通过计算公式获得血清中胆汁酸的含量。目前的五代循环酶法胆汁酸测试试剂盒，均采用游离的酶以及辅酶，酶和辅酶的用量都非常大，因为要一次性加入多种试剂，所以检测程序相对比较复杂，而且酶与辅酶的稳定性较差，不利于长期保存，必须保存在冰箱中，即使这样稳定性还是较差，再加上酶与辅酶的价格昂贵，这样在一定程度上增加了胆汁酸检测成本。目前，涉及到胆汁酸检测的专利主要有[99116566. 7]提供了一种用于血清总胆汁酸测定的组合试剂，包括含有硝基四唑蓝、氧化性辅酶I、黄递酶、丙酮酸钠、磷酸缓冲液的溶液构成的试剂I ;有3 α -羟基类固醇脱氢酶、人血清白蛋白、EDTA、磷酸缓冲液构成试剂II。通过耦合多酶反应来检测胆汁酸浓度。在这一体系中，主反应是3 a -HSD氧化胆汁酸，同时还原NAD+ ;硝基四唑蓝染料NTB在黄递酶的催化下转化成蓝紫色的结晶，起到放大信号的作用。
提供了一种总胆汁酸的测定试剂及测定方法，利用3 α -羟基类固醇脱氢酶及Thio-NAD+特异性氧化胆汁酸，氧化后生成3-酮类固醇、还原型辅酶和酮类固醇硫代氧化性辅酶，再次生成的3-酮类固醇在3 α -羟基类固醇脱氢酶及还原型辅酶存在下，又生成胆汁酸及氧化性辅酶，如此循环往复，从而放大微量的胆汁酸量，产生大量的水溶性黄色非染料酮类固醇硫代氧化性辅酶，最后测定生成Thio-NADH的吸光度变化，即测得胆汁酸值。[200410093556. 6]提供了一种胆汁酸的测定试剂，试剂一甘氨酸、Thio-NAD,NaN3、Triton X_100、丙酮酸钠、亚铁氰化钾；试剂二 二乙醇胺、苯基或烷基二醇、硼氢化物、3a-HSD、TritoNX-100, a-糊精、NADH0通过酶反应检测胆汁酸含量。[201010145678. O]提供了一种血清总胆汁酸的测定方法，其特征在于毛细管电泳血清样品聚集胆汁酸，进入柱端检测池的胆汁酸在氧化性辅酶 共存下经3a-HSD催化脱氢，同时NAD+被还原成NADH ;而生成的NADH在恒定电位作用下被三联吡啶氧化成NAD+，同时释放光子被记录，从而按常规定量总胆汁酸。由以上临床应用以及专利的胆汁酸检测方法来看，目前，对血清中总胆汁酸含量的测定主要集中在酶法，原理主要基于3 α -羟基类固醇脱氢酶氧化胆汁酸，同时需要氧化型辅酶参与，针对辅酶的再生，由以上提到的各种方法，但无论哪种方法都是采用的游离酶以及辅酶，由于酶和辅酶的价格昂贵，稳定性差，为了保证使用有效期内的酶活达到检测灵敏度的要求，往往需要大量增加试剂盒中昂贵的酶和辅酶的添加量，因此在一定程度上增加了胆汁酸检测成本。各种专利都致力于提供一种更加方便快捷而且成本低的检测方法，但是还是没有很好的解决这一问题，势必使检测的成本维持在很高的水平上。为了在保证高的检测灵敏度的同时，降低检测试剂中酶的使用量、提高酶的稳定性，本发明设计一种新的总胆汁酸检测试剂，并提供利用这种试剂进行胆汁酸检测的方法。

发明内容
为了达到上述目的，本发明致力于开发一种新的用于体外定量测定血清中总胆汁酸含量的检测技术，包括用于胆汁酸检测的测定试剂及利用这种试剂进行检测的方法，其中这种测定试剂既可以是溶液形态的，也可以是固定化的形态的。本发明提供一种用于血清总胆汁酸检测的组合试剂Α，其特征在于包含由Tris-HCl缓冲液、3α-羟基类固醇脱氢酶、氧化型辅酶(NAD+)或还原型辅酶(NADH)构成的试剂I ;和由心肌黄酶、2，6-二氯酚靛酚(DCPIP)、Tris-HCl缓冲液构成的试剂II。利用这种组合试剂进行血清总胆汁酸检测的测定方法，其特征在于将所述的试剂I和试剂II按照等体积混合，得到组合试剂Α，将已知浓度的胆汁酸溶液样品加入到A中，利用紫外分光光度法连续检测600nm处吸光度的变化，计算出反应速率，绘制已知胆汁酸浓度和反应速率之间的工作曲线；将待检测的含有胆汁酸的血清样品加入到A中，同样利用紫外分光光度法连续检测600nm处吸光度的变化，计算出反应速率，即可根据工作曲线定量计算血清样品中的总胆汁酸浓度。该检测方法的原理如下其中3 α -羟基类固醇脱氢酶以NAD+为辅酶，特异性地将胆汁酸氧化为3-酮类固醇，并生成还原型辅酶NADH ;心肌黄酶利用还原型辅酶(NADH)Jf蓝色的DCPIP还原为无色的还原型产物，并使还原型的辅酶NADH转换为NAD+ ;通过辅酶在反应体系中的循环再生，使DCPIP不断地转化为无色的还原型产物，从而使微量胆汁酸的信号得到放大。
该组合试剂与第三代胆汁酸检测试剂相比，由于使用水溶性的2，6- 二氯酚靛酚作为显示剂，通过辅酶循环再生反应不断被还原为无色的产物，使检测体系的吸光度值降低。因此具有灵敏度高，而且不会污染仪器的优点。上述用于血清总胆汁酸检测的组合试剂A，其中试剂I中，所包含的辅酶既可以是氧化型NAD+，也可以是还原型的NADH。当试剂I中为氧化型辅酶NAD+时，试剂I、试剂II中各组分含量如下I)每升试剂I中各组分的含量 3α-羟基类固醇脱氢酶0· 02-0. 05g/L
氧化型辅酶 NAD+ 5-30mMρΗ8· O 的 Tris-HCl 缓冲液50mM2)每升试剂II中各组分的含量心肌黄酶0·02-0. 05g/LDCPIP 0. 2-0. 5mMρΗ8· O 的 Tris-HCl 缓冲液50mM当试剂I中为还原型辅酶NADH时，组合试剂I、试剂II中各组分含量如下I)每升试剂I中各组分的含量3α-羟基类固醇脱氢酶0· 005-0. 05g/L还原型辅酶NADH 0. 5-1. OmMρΗ8· O 的 Tris-HCl 缓冲液50mM2)每升试剂II中各组分的含量心肌黄酶0·005-0. 05g/L2，6- 二氯酚靛酚0· 2-0. 5mMρΗ8· O 的 Tris-HCl 缓冲液50mM其中所用的3 α -羟基类固醇脱氢酶比活为30KU/mg，心肌黄酶的比活为20KU/mg。为了提高胆汁酸检测试剂的稳定性，并使检测步骤更加简化，本发明还提供一种用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B，以及利用固定化组合试剂B进行胆汁酸检测的方法，其特征在于通过如下步骤制备出固定化组合试剂B，进行胆汁酸的分析检测I)将一定质量的3 α -羟基类固醇脱氢酶、心肌黄酶、还原型辅酶(NADH)或氧化型辅酶(NAD+)溶解于水中得到组合试剂B溶液；将该组合试剂溶液与甘油充分混合，其中溶液与甘油的体积比为10 90-5 95 ;将该混合液作为同轴共纺静电纺丝的内相溶液，加入到微量进样器中；2)将一定质量高分子聚合物溶于有机溶剂中充分溶解，得到的透明溶液作为同轴共纺静电纺丝的外相电纺液，加入到另一微量进样器中。其中外相电纺液是溶于N，N- 二甲基乙酰胺的重量百分比为10 30%的聚氨酯溶液、溶于N，N-二甲基乙酰胺的重量百分比为10 30%的聚偏氟乙烯溶液、溶于氯仿的重量百分比为10 30%的聚乳酸溶液、溶于水的重量百分比为3 10%的聚环氧乙烷溶液、或溶于N，N-甲基乙酰胺的苯乙烯马来酸酐共聚物溶液；3)将内、外相电纺液分别通过管线连接至同轴电纺喷丝头的进液口，将喷丝头的出液口与高压电源的正极连接，用铝箔纸或不锈钢网连接至高压电源的负极作为接收板；
4)利用两台注射泵分别控制内、外相电纺液的流速，进行同轴静电纺丝，在接收板上得到具有中空结构的聚合物纳米纤维，其中用于血清总胆汁酸检测的组合试剂被原位包埋在这种中空纳米纤维的空腔中，从而制备出用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂；5)在含有已知浓度胆汁酸的Tris-HCl缓冲液中，添加DCPIP溶液使其终浓度为O. 04mM，然后再加入上述步骤4)中所制备出的用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B，采用分光光度计连续每隔30s检测600nm处吸光度值的改变，计算出反应速率，绘制已知胆汁酸浓度和反应速率之间的工作曲线；在待检测的含有胆汁酸的血清样品中，添加DCPIP溶液使其终浓度为O. 04mM，然后加入上述步骤4)中所制备出的用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B，同样利用紫外分光光度法连续检测600nm处吸光度的变化，计算出反应速率，即可根据工作曲线定量计算血清样品中的总胆汁酸浓度。
本发明所提供的一种用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B，以及利用固定化组合试剂B进行胆汁酸检测的方法，其特征在于所制备出的固定化组合试剂B具有无纺布膜的形态，原位包埋在中空纳米纤维中的3α-羟类固醇脱氢酶、心肌黄酶、还原型辅酶(NADH)或氧化型辅酶(NAD+)在中空纳米纤维的腔室中，保持游离分散的状态。由于本发明所提供的用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B具有无纺布膜的形态，还可以和24孔板或96孔板相结合，将包埋有3 α -羟类固醇脱氢酶、心肌黄酶、还原型辅酶(NADH)或氧化型辅酶(NAD+)的纳米纤维膜铺设在孔板的表面，构建Microarray微阵列，通过在孔板内依次滴加2，6- 二氯酚靛酚溶液和待检测的含胆汁酸血清溶液，从而可以用于血清中总胆汁酸的高通量检测。本发明所制备出的用于胆汁酸检测的固定化组合试剂Β，3α_羟类固醇脱氢酶、心肌黄酶、还原型辅酶(NADH)或氧化型辅酶(NAD+)被包埋的中空纳米纤维的空腔内，纳米微环境为酶和辅酶提供特殊的稳定性机制，因此其稳定性得到了大幅度的提高。


下面结合附图及具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图I实施例I的胆汁酸检测工作曲线，在Unico2800UV-ViS分光光度计上获得。图2实施例2的胆汁酸检测工作曲线，在Unico2800UV-ViS分光光度计上获得。图3实施例5所述原位装载了 3 α -羟基类固醇脱氢酶、心肌黄酶、以及NADH的中空聚氨酯纳米纤维，即用于胆汁酸检测的固定化组合试剂B的扫描电镜照片(断面图)。图4实施例5所述的胆汁酸检测工作曲线。图5实施例5所述的用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B的储存稳定性。图6实施例6所述，利用固定化组合试剂B检测待测样品中胆汁酸浓度过程中，反应体系溶液颜色随时间的变化情况。
具体实施例方式下面以具体化的形式阐述本发明的实施方式，但本发明并不限制于该实施方式中。实施例I用于胆汁酸检测的溶液形态组合试剂A和检测方法本实施例描述一种用于总胆汁酸检测的测定试剂A和检测方法，试剂分为两个组分试剂I和试剂II。试剂I :3 α -羟基类固醇脱氢酶0. 02g/L氧化型辅酶NAD+ IOmMρΗ8· O 的 Tris-HCl 缓冲液50mM
试剂II 心肌黄酶0·02g/L2，6- 二氯酚靛酚0. 4mMρΗ8· O 的 Tris-HCl 缓冲液50mM其检测方法是采用Unico 2800 Uv-Vis分光光度计进行检测，操作如下
加入物参比管检测管I 检测管2 检测管3 检测管4 检测管5 检测管6
试剂 IΙΟΟμΕ ΤοδμΕ IOOjiL ΙΟΟμΕ ToojZ IOOpL ΙΟΟμΕ
试剂 IIΤοομ ΙΟΟμ-L IOOpL TooJxL 00μΕ IOOpL οδμΙ
加入 800 μ 胆汁酸 O μτηοΙ/L 10 μιηοΙ/L 25μτηο 50 μιηοΙ/L 75 μιηο ^ 100 μπιοΙ/L 150^imoI/L
样品后，胆汁酸浓度
快速混合后在600mn波长处连续检测吸光度值的变化，计算ΔΑ60ο(η ι—I通过测定不同胆汁酸浓度下的ΔΑβοο η Γ1)’绘制^—胆；I'酸浓度的标准曲线。ΛΑ_OnirT1mg)-胆汁酸浓度的工作曲线如下ΛA_(mirT1) =0. 00039*胆汁酸浓度 / μ mol/L+0. 06971 ；R2=0. 997，检测线性范围:0-150 μ mol/L。血清样品中胆汁酸浓度的检测在检测管中加入100 μ L试剂I和100 μ L试剂II，混合得到组合试剂Α，然后向A中加入800 μ L待检测的含有胆汁酸的血清样品，快速混合后在利用紫外分光光度法在600nm波长处连续检测吸光度值的变化，计算出反应速率，根据工作曲线定量计算血清样品中的总胆汁酸浓度。实施例2用于胆汁酸检测的溶液形态组合试剂A和检测方法本实施例描述一种用于总胆汁酸检测的测定试剂A和检测方法，试剂分为两个组分试剂I和试剂II。试剂I :3 α -羟基类固醇脱氢酶0. 01g/L还原型辅酶NADH : I. OmMρΗ8· O 的 Tris-HCl 缓冲液50mM试剂II 心肌黄酶0.01g/L2，6- 二氯酚靛酚0. 4mMρΗ8· O 的 Tris-HCl 缓冲液50mM其检测方法是采用Unico 2800 Uv-Vis分光光度计进行检测，操作如下
权利要求
1.一种用于血清总胆汁酸检测的组合试剂A，其特征在于包含由Tris-HCl缓冲液、3 a-羟基类固醇脱氢酶、氧化型辅酶NAD+或还原型辅酶NADH构成的试剂I ;和由心肌黄酶、2，6- 二氯酚靛酚DCPIP、Tris-HCl缓冲液构成的试剂II。
2.如权利要求I所述一种用于血清总胆汁酸检测的组合试剂A，其特征在于所述的试剂I、试剂II中各组分含量 试剂I中为氧化型辅酶NAD+时 1)每升试剂I中各组分的含量 3 a -羟基类固醇脱氢酶0. 02-0. 05g/L 氧化型辅酶NAD+ 5-30mM pH8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液50mM 2)每升试剂II中各组分的含量 心肌黄酶0. 02-0. 05g/L DCPIP 0. 2-0. 5mM pH8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液50mM 试剂I中为还原型辅酶NADH时 1)每升试剂I中各组分的含量 3 a -羟基类固醇脱氢酶0. 005-0. 05g/L 还原型辅酶NADH :0. 5-1. OmM pH8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液50mM 2)每升试剂II中各组分的含量 心肌黄酶0. 005-0. 05g/L 2，6- 二氯酚靛酚0. 2-0. 5mM pH8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液50mM。
3.一种用于血清总胆汁酸检测的测定方法，其特征在于将权利要求I所述的试剂I和试剂II按照等体积混合后，得到组合试剂A，将已知浓度的胆汁酸溶液样品加入到A中，利用紫外分光光度法连续检测600nm处吸光度的变化，计算出反应速率，绘制已知胆汁酸浓度和反应速率之间的工作曲线；将待检测的含有胆汁酸的血清样品加入到A中，同样利用紫外分光光度法连续检测600nm处吸光度的变化，计算出反应速率，即可根据工作曲线定量计算血清样品中的总胆汁酸浓度。
4.一种用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B，其特征在于制备步骤包括 1)将一定质量的3a -羟基类固醇脱氢酶、心肌黄酶、还原型辅酶(NADH)或氧化型辅酶(NAD+)溶解于水中得到组合试剂B溶液；将该组合试剂B溶液与甘油充分混合，其中溶液与甘油的体积比为10 90-5 95 ;将该混合液作为同轴共纺静电纺丝的内相溶液，加入到微量进样器中； 2)将一定质量高分子聚合物溶于有机溶剂中充分溶解，得到的透明溶液作为同轴共纺静电纺丝的外相电纺液，加入到另一微量进样器中，其中外相电纺液是溶于N，N-二甲基乙酰胺的重量百分比为10 30%的聚氨酯溶液、溶于N，N-甲基乙酰胺的重量百分比为10 30%的聚偏氟乙烯溶液、溶于氯仿的重量百分比为10 30%的聚乳酸溶液、溶于水的重量百分比为3 10%的聚环氧乙烷溶液、或溶于N，N-二甲基乙酰胺的苯乙烯马来酸酐共聚物溶液； 3)将内、外相电纺液分别通过管线连接至同轴电纺喷丝头的进液口，将喷丝头的出液口与高压电源的正极连接，用铝箔纸或不锈钢网连接至高压电源的负极作为接收板； 4)利用两台注射泵分别控制内、外相电纺液的流速，进行同轴静电纺丝，在接收板上得到具有中空结构的聚合物纳米纤维，其中用于血清总胆汁酸检测的组合试剂B被原位包埋在这种中空纳米纤维的空腔中，从而制备出用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B。
5.如权利要求4所述的用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B，其特征在于所制备出的固定化组合试剂B具有无纺布膜的形态，原位包埋在中空纳米纤维中的3 α -羟基类固醇脱氢酶、心肌黄酶、还原型辅酶(NADH)或氧化型辅酶(NAD+)在中空纳米纤维的腔室中，保持游离分散的状态。
6.利用权利要求4所述的固定化组合试剂B进行胆汁酸检测的方法，其特征在于在含有已知浓度胆汁酸的Tris-HCl缓冲液中，添加DCPIP溶液使其终浓度为O. 04mM，然后再加入所述步骤4)中所制备出的用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B，采用分光光度计连续每隔30s检测600nm处吸光度值的改变，计算出反应速率，绘制已知胆汁酸浓度和反应速率之间的工作曲线；在待检测的含有胆汁酸的血清样品中，添加DCPIP溶液使其终浓度为O. 04mM，然后加入步骤4)中所制备出的用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B，同样利用紫外分光光度法连续检测600nm处吸光度的变化，计算出反应速率，即可根据工作曲线定量计算血清样品中的总胆汁酸浓度。
全文摘要
本发明提供了一种用于血清中总胆汁酸测定的组合试剂A和检测方法，组合试剂A包含由Tris-HCl缓冲液、3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSD)、辅酶(NAD+或NADH)构成的试剂I；和由心肌黄酶、2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)、Tris-HCl缓冲液构成的试剂II。通过辅酶循环不断地将蓝色的DCPIP还原为无色的产物，定量检测胆汁酸浓度。本发明还利用同轴共纺静电纺丝技术，将3α-HSD、心肌黄酶和辅酶原位包埋在中空的聚合物纳米纤维的腔室内，制备出一种固定化形态的组合试剂B。在待检测的含胆汁酸的血清样品中添加DCPIP，然后加入固定化组合试剂B，启动反应，进行胆汁酸的检测。固定化组合试剂具有储存稳定性高的突出优点，在临床准确快速胆汁酸测定方面具有应用前景。
文档编号G01N21/33GK102768190SQ20121023031
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月4日 优先权日2012年7月4日
发明者姬晓元, 张松平, 王平, 苏志国 申请人:中国科学院过程工程研究所