专利名称：基于超声波辅助衍生技术分析血清代谢物的方法
技术领域：
本发明涉及超声波技术领域，具体地说，本发明涉及一种基于超声波辅助衍生技术分析血清代谢物的方法。
背景技术：
超声波技术是一门以物理、电子、机械及材料学为基础的通用技术之一，简便又安全。它是通过超声波产生、传播及接收的物理过程而完成的。超声波是一种频率高于20kHz 的声波。它在媒质中传播时可产生空化现象，空化中产生的极大压力造成被破碎物在瞬间破碎，同时，超声波产生的振动作用加强了被破碎物的扩散及溶解。超声波可传递很强的能量。利用超声的机械作用、空化作用、热效应和化学效应，超声振荡可促使或加速某些化学反应的发生。超声技术简便又安全，长时间超声并不会破坏样品的完整性。目前，超声波技术被广泛而有效地应用于酯化、硅烷化和糖基化等衍生化反应。传统的血清代谢物衍生方法反应时间长，副产物较多，反应速度慢，不适用于血清样本的批量分析。

发明内容
本发明提供了一种采用超声波辅助衍生技术分析血清中代谢物的方法，本发明提高了反应效率，节省了整个分析时间，有助于批量生物样本的快速测定。本发明通过以下技术方案实现一种利用超声波辅助衍生技术分析血清代谢物的方法，该方法包括如下步骤步骤一，选用血清样本，加入溶剂沉淀血清中蛋白，提取代谢物；步骤二，在超声条件下进行所述代谢物的衍生反应，获取所述代谢物的衍生产物；步骤三，对处理后的血清样品进行成分检测和分析，获取谱图中各物质的峰面积强度；步骤四，采用多维统计方法评估所述峰面积强度。优选的，所述血清选自人血清、小鼠血清、大鼠血清、兔子血清、犬血清或猴血清。优选的，所述超声条件为40kHz、350W功率、65°C下超声lOmin。优选的，所述衍生反应为甲氧胺反应和硅烷化反应。优选的，所述衍生反应为酰化反应和脂肪酸反应。优选的，在所述步骤三中，所述样品分析采用气相色谱质谱联用技术。在本发明提供的方法中，代谢物的衍生效率明显提高，反应速度明显提高，为血清样本的批量分析节省了反应时间。


图I是血清样本中超声波辅助葡萄糖甲氧胺反应的效率图。图2是超声波辅助TMS衍生反应条件的偏最小二乘法(PLS)示意图。
图3是超声辅助衍生方法与常规衍生方法比较的饼状图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例第一步，称取血清100 μ L，加入内标O. 311^/1111^-2-氯苯丙氨酸1(^1^混匀，然后加入300yL甲醇-氯仿(3 l，v/v)提取代谢物，12000rpm离心20分钟。离心后取300yL 上清液真空浓缩干燥后，加入15mg/mL甲氧胺吡啶溶液80 μ L，密封后进行甲氧胺反应；然后再加入硅烷化试剂和正己烷，密封后进行硅烷化反应。第二步，在超声波频率40kHz、350W 条件下设计了 2、5、7、10、15、20、30、45、60min
等不同反应时间的单因素试验，并以30°C下振荡反应90min和24h的常规条件作为参照，选择超声辅助条件下葡萄糖与甲氧胺溶液的最佳反应时间。第三步，在单因素试验的基础上，选取超声波频率、温度、时间、硅烷化试剂 (BSTFA+1% TMCS)体积、溶剂等参数对影响代谢物衍生效率进行L27 (313)正交方案设计，如表I所示。同时，以70°C反应15min和90min等常规的硅烷化衍生方法(N28和N29)作为对照，每一个条件重复2次。第四步，超声辅助方法与常规加热方法的比较(I)超声条件在第一步的基础上加入80 μ L 15mg/mL甲氧胺吡啶溶液混合均匀， 超声20min进行甲氧胺反应。然后加入100 μ LBSTFA(含1% TMCS)和20 μ L正己烷混合均匀，在40kHz、350W功率和65°C下超声IOmin进行硅烷化反应。(2)常规方法在第一步的基础上加入80 μ L 15mg/mL甲氧胺吡啶溶液混合均匀， 37°C下反应90min进行甲氧胺反应。然后加入100 μ L BSTFA (含I % TMCS)和20 μ L正己烷混合均匀后70°C下反应90min。第五步，气相色谱/飞行时间质谱(GC/T0FMS)分析条件和数据处理(I)分析条件进样口温度270°C ;色谱柱为DB-5MS毛细管柱(5% Diphenyl cross-linked 95% dimethylpolysiloxane 30mX250um i. d. , 0. 25 μ m);程序升温起始温度80°C，保留2分钟，IO0C /min升至180°C，以5°C /min升至240°C，再以25°C /min升至290°C，保留9分钟；流速lmL/min，载气为超纯氦气(彡99. 999% );不分流进样IyL; 接口温度220°C ;离子源温度220°C ;溶剂延时3分钟；电离方式EI ；电子能量70eV ;全扫描方式，质谱扫描范围m/z 30-550，以20张谱/秒方式采集。(2)原始GC/T0FMS数据文件通过ChromaTOF软件数据转换功能转换成Net⑶F的格式后直接导入MATLAB 7. O (The Mathfforks, Inc.，USA)脚本进行处理。数据处理包括基线矫正、去噪音、峰判别和匹配、内标和一些系统杂峰的排除以及峰面积归一化等，最终得到三维矩阵图样品信息、色谱峰的保留时间和色谱峰的峰面积。其中，一些假峰(如噪音、柱流失等)被去除。将上述经过MATLAB 7. O处理的矩阵导入到SMCA-P12. O软件包 (Umetrics, Umea, Sweden),经处理的数据进行中心化和pareto均一化处理(将各个色谱峰的峰面积进行开平方处理，以减少峰面积大的谱峰带来的偏差)。最后用于PLS多维统计分析。(3)数据确证和计算样本采用L-2-氯苯丙氨酸作为内标。利用NIST2005数据库(National Institute of Standards and Technology Library)鉴定代谢物，并米用标准品进行保留时间和质谱的确证。在145个鉴定的已知色谱峰中，根据不同标准品的特征离子进行提取并计算特征离子的峰面积，然后将得到的代谢物特征离子的峰面积除以内标的特征离子峰面积，其比值进行数据分析。第六步，数据分析如图I所示，Al代表环状葡萄糖硅烷化合物的峰面积；A2代表葡萄糖methoxime/ TMS衍生物的峰面积；误差棒为每个方法平行三次的偏差；1_9分别表示2，5，7，10，15，20， 30，45，60min ;10_11分别表示常规方法中反应90min和16h。在超声反应时间20_45min时葡萄糖与内标的峰面积比值降低，并逐渐平衡。与常规方法(90min和16h)相比，超声反应 20-45min时甲氧胺衍生效率更高(标准偏差< 0. 003)，这说明本实验在40kHz、350W功率和65 °C超声条件下仅需20min进行甲氧胺反应。如图2所示，其中图2a是PLS中GC/T0FMS中不同衍生条件的bi-plot图，图2b 是PLS中GC/T0FMS中不同衍生条件的tl_ul图。在图2a显示N06、N11、N13和N08等四个实验条件更靠近变量(测定的色谱峰)的大部分，这说明这四个条件很大程度上比其他条件更影响硅烷化效率。同样，在PLS模型的tl-ul得分图2b上，这四个条件更靠近图的右上角，可能是与相对较高的峰面积相关。特别是实验条件N08与所测成分获得的最大峰面积相关。实验条件N08为加入100 μ L BSTFA(含1% TMCS)和20 μ L正己烷于样品中混合均匀，在40kHz、350W功率和65°C下超声IOmin进行硅烷化反应。如图3所示，R(比值)=A%/B%，其中A代表超声辅助方法中色谱峰的峰面积与内标的峰面积比值，B代表常规衍生方法中每个色谱峰的峰面积与内标的峰面积比值，超声辅助方法改善了所有色谱峰中64. 0%成分的峰面积。在145个鉴定的已知峰中，71. 0% 峰得到改善，其中5. 5%峰面积增加了 3倍以上，2. 8%峰面积增加了 2-3倍以上，33. 8%峰面积增加了 1-1. 2倍以上。另外，26. 2%峰略有降低，其中2. 8%降低了 4倍以上。同时，常规方法中甲氧胺反应需90min，硅烷化反应需90min，相比之下超声辅助方法所需前处理时间仅30min，大大地节省了反应时间，有利于大批量样本的代谢组学研究。表I
权利要求
1.一种利用超声波辅助衍生技术分析血清代谢物的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤步骤一，选用血清样本，加入溶剂沉淀血清中蛋白，提取代谢物；步骤二，在超声条件下进行所述代谢物的衍生反应，获取所述代谢物的衍生产物； 步骤三，对处理后的血清样品进行成分检测和分析，获取谱图中各物质的峰面积强度；步骤四，采用多维统计方法评估所述峰面积强度。
2.根据权利要求I所述的利用超声波辅助衍生技术分析血清代谢物的方法，其特征在于，在所述步骤一中，所述血清选自人血清、小鼠血清、大鼠血清、兔子血清、犬血清或猴类血清。
3.根据权利要求I所述的利用超声波辅助衍生技术分析血清代谢物的方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述超声条件为40kHz、350W功率、65°C下超声lOmin。
4.根据权利要求I所述的利用超声波辅助衍生技术分析血清代谢物的方法，其特征在于，所述衍生反应为甲氧胺反应和硅烷化反应。
5.根据权利要求I所述的利用超声波辅助衍生技术分析血清代谢物的方法，其特征在于，所述衍生反应为酰化反应和脂肪酸反应。
6.根据权利要求I至5任一项所述的利用超声波辅助衍生技术分析血清代谢物的方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述样品分析采用气相色谱质谱联用技术。
全文摘要
本发明涉及一种利用超声波辅助衍生技术分析血清代谢物的方法，该方法包括如下步骤选用血清样本，加入溶剂沉淀血清中蛋白，提取代谢物；在超声条件下进行所述代谢物的衍生反应，获取所述代谢物的衍生产物；对处理后的血清样品进行成分检测和分析，获取谱图中各物质的峰面积强度；采用多维统计方法评估所述峰面积强度。与传统衍生反应方法相比，本发明提供的方法不仅快捷简便安全，而且反应效率明显提高。
文档编号G01N30/02GK102608229SQ201210059969
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者刘玉敏, 贾伟 申请人:上海交通大学