专利名称：生化分析装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用标记物质检出受体或配体的生化分析装置。
噪音技术目前在临床检查等的领域中要进行各种检测物的分析，为了在短时间内正确地进行分析这些检测物，开发了在各种分析试剂盒、分析仪器中使用的分析用具。例如特许第3298836号公报记载了在多孔质检测物导入部的平均孔径比分析部的平均孔径大的检测物分析用具，由于其多孔质检测物导入部的平均孔径大，分析部的平均孔径小，可进行检测物成份的分离并且可以在短时间内处理检测物。
另外在基因表达解析等的分子生物学领域，在膜上设制多个含有DNA等生物高分子的点(dot)而形成的宏阵列是公知的。因为这种宏阵列能够在一片膜上一次分析多个不同种类的样品，在分子生物学和医疗领域有很多应用，例如将各种DNA片断(探针)以点配制在阵列上，在该阵列上加入由mRNA等制备的靶进行杂交等，就可能一次分析多个基因的行为。
目前的宏阵列是由硝酸纤维素等的有机高分子膜构成的，因为非常柔软，操作时出现障碍容易发生弯曲，目前已经开发了在膜状硬质多孔体中配制多个含有被检物质点的宏阵列(特开2001-83164号公报)。
另一方面，已经开发了以下系统(特开2002-355036号公报)在微阵列解析系统或宏阵列解析系统中，在膜过滤器等的生化分析装置的表面的不同位置上，滴上可与激素类，肿瘤标记物，酶，抗体，抗原，抗体催化剂，其它的蛋白质，核酸，cDNA，DNA，RNA等以及来自生体的物质进行特异结合且含有碱基序列或碱基的长度、组成、特性等已知的配体或受体的溶液，形成多个吸附性区域，由于和放射性标记物质、荧光物质、化学发光基质接触产生化学发光的标记物质标记的受体或配体(根据激素类，肿瘤标记物，酶，抗体，抗原，抗体催化剂，其它的蛋白质，核酸，DNA，mRNA等从生物中提取、分离等得到的，或者取样后进行了化学处理的物质)，与吸附性区域中所含的配体或受体杂交而特异性的与配体或受体结合，根据在多个吸附性区域选择性含有的放射性标记物质，将蓄积性荧光体片材的辉光性荧光体层曝光，激发曝光的辉光性荧光体层(PSL photositmulated luminescence)，进行扫描，激发含有在辉光性荧光体层中的辉光性荧光体，将从辉光性荧光体层中放出的辉光进行光电检出，生成化学解析用数据，或者对多个吸附性区域的激发光进行扫描，激发选择性包含在多个吸附性区域中的荧光物质，将从荧光物质放出的荧光进行光电检出，生成生物化学解析用数据；或者将选择性包含在多个吸附性区域的标记物质和化学发光物质接触，光电检出从标记物质放出的化学发光，生成生物化学解析数据的系统。
这种系统中，在生化分析装置上形成多个结合了配体或受体的高密度吸附性区域，与由标记物质标记的受体或配体杂交，具有在短时间内可以分析受体或配体的优点。
但是，上述生化分析装置的吸附性区域结合的配体或受体被结合并固定在全部吸附性区域，存在与固定于离检测面远的吸附性区域中的配体或受体结合的受体或配体的信号衰减的问题。在上述微阵列或宏阵列系统中，要求能够更正确地分析受体或配体，信号衰减成为防碍生成正确的生物化学分析数据的原因之一。

发明内容
鉴于上述问题，本发明的目的是提供能够抑制来自受体或配体的信号衰减的生化分析装置。
另外，特开2001-83164号公报中记载了膜状硬质多孔体由有平均孔径相对小的贯通孔的表层部和有平均孔径相对大的贯通孔的基层部构成。膜状硬质多孔体与本发明的在有多个孔的基板上的孔内填充吸附性材料构成的生化分析装置是明显不同的，而且由于膜状硬质多孔体由有平均孔径相对小的贯通孔的表层部和有平均孔径相对大的贯通孔的基层部构成，是为了在滴下含有探针的溶液时，能够使溶液更快地浸透，在这一点上与本发明不同。
本发明的生化分析装置是由有多个孔的基板，和在所述多个孔内填充形成吸附性区域的多孔性的吸附性材料构成，其特征是上述吸附性区域具备有平均孔径相对小的孔的层和有平均孔径相对大的孔的层。
上述孔径是指某一孔的最长孔径和最短孔径的平均值。相对小的孔的层和相对大的孔的层的平均孔径的差，由于其相对小的孔的层和相对大的孔的层各层的厚度不同，不能一概而言，当相对大的孔的层的平均孔径为1时，相对小的孔的层的平均孔径优选0.7以下，更优选0.5以下，最优选0.4以下。
对于在上述基板的一面连续有形成上述吸附性区域的上述层的情况，优选设置吸收从通过上述基板的下层的孔传向该孔邻近的孔信号的信号吸收层。
本发明的生化分析装置由有多个孔的基板，和在上述多个孔内填充形成吸附性区域的吸附性材料构成，其特征是上述吸附性区域具备由能与该吸附性区域结合的配体或受体结合的官能基相对多的材料构成的层，和由上述官能基相对少的材料构成的层。
和吸附性区域结合的配体或受体结合的官能基，虽然根据与吸附性区域结合的配体或受体不同而有所不同，但是可以举出例如羧基，氨基，通过紫外线照射能够结合的酰胺基，通过皂化处理能够形成酯键的基，以及基于硅烷偶合剂能够结合的羟基等。
由官能基相对多的材料形成的层和由官能基相对少的材料形成的层含有的官能基量的差别，由于由官能基相对多的材料形成的层和由官能基相对少的材料形成的层各层的厚度、官能基的种类等的不同不能一概而言，当由官能基相对多的材料形成的层的官能基密度为1时，由官能基相对少的材料形成的层的官能基密度优选0.7以下，更优选0.5以下，最优选0.4以下。
对于在上述基板的一面连续有形成上述吸附性区域的上述层的情况，选设置吸收从通过上述基板的下层的孔传向该孔邻近的孔信号的信号吸收层。
本发明的由有多个孔的基板，和上述多个孔内填充形成吸附性区域的吸附性材料构成的生化分析装置，因为上述吸附性区域具备有平均孔径相对小的孔的层和有平均孔径相对大的孔的层，有平均孔径相对小的孔的层，比表面积大，可使配体或受体固定化；而有平均孔径相对大的孔的层能够使反应液在全部生化分析装置中均匀分配，同时能够提高吸附性材料的自身保持性，即有平均孔径相对小的孔的层和有平均孔径相对大的孔的层能够各自分担吸附性区域的功能。
因为被固定化的配体或受体集中在平均孔径相对小的孔的层，利用来自标记物质的信号检出与固定化的配体或受体特异结合的受体或配体时，若从平均孔径相对小的孔的层一侧检出时，来自受体或配体的信号不会衰减，可以检出。
而且本发明的由有多个孔的基板和在多个孔内填充吸附性材料形成吸附性区域的生化分析装置中，因为上述吸附性区域具备由和在该吸附性区域被结合的配体或受体结合的官能基相对多的材料构成的层，和由上述官能基相对少的材料构成的层，因此，官能基相对多的材料构成的层中配体或受体被固定化，而对于官能基相对少的材料构成的层，反应液在生化分析装置中全部被均匀分配，能够提高吸附性材料自身的保持性，同时由于受体或配体的静电相互作用或极性相互作用，能够防止非特异的吸附，即官能基相对多的材料层和官能基相对少的材料层能够各自分担吸附性区域的功能。
因为固定化的配体或受体集中在官能基相对多的材料层，利用来自标记物质的信号检出与固定化的配体或受体特异结合的受体或配体时，若从官能基相对多的材料层一侧检出时，受体或配体的信号不会衰减，可以检出。
另外，对于基板下形成吸附性区域的层连续的情况下，通过设置吸收从通过基板下的层的某一孔传向邻近的孔信号的信号吸收层，因为某一孔检出的受体或配体的信号传导到基板下连续着的形成吸附性区域的层，可以抑制所述信号传向其邻近孔传播的效果，由此可仅仅检出本来所要检出的受体或配体的信号，从而能够正确地检出来自各个孔的信号。


图1是本发明生化分析装置的示意立体图；
图2是本发明生化分析装置的示意剖面图；图3是制造本发明生化分析装置的实施方式示意图；图4是制造本发明生化分析装置的另一实施方式示意图；图5是使反应液强制流动的反应器的一实施方式的示意剖面图。
图中1生化分析装置；2基板；3孔；4吸附性区域；4a有平均孔径相对小的孔的层；4b有平均孔径相对大的孔的层；5信号吸收层具体实施方式
以下参照

本发明的实施方式，图1是本发明生化分析装置的示意立体图，图1所示的生化分析装置1由设置多个孔3的基板2和孔3内填充的构成与基板2连接的吸附性区域4的多孔性材料构成。
图2是本发明生化分析装置的示意剖面图，如图2所示的吸附性区域4由有平均孔径相对小的孔的层4a和有平均孔径相对大的孔的层4b构成，在有平均孔径相对大的孔的层4b的下层，设置吸收从通过基板2下侧部6的孔3a传向邻近的孔3b信号的信号的吸收层5，在基板2的下侧部6，形成吸附性区域的层4a及层4b连续，是通过基板2压缩层4a及层4b和信号吸收层5的部分。
固定在吸附性区域的配体或受体集中结合在平均孔径相对小的层4a，几乎不与平均孔径相对大的层4b结合，因此使用该生化分析装置利用标记物质检出受体或配体时，受体或配体集中在平均孔径相对小的层4a中，因此若从4a侧检出信号，受体或配体的信号不被衰减而能够检出。
另外，在基板2的下侧部6形成吸附性区域的层4a和层4b连续的生化分析装置中，虽然从孔3a向邻近的孔3b传播信号，但因为配体或受体集中结合在平均孔径相对小的层4a，因此与配体或受体全部分散结合在吸附性区域的情况比较，能够抑制在孔之间传播的信号量，而且由于设置信号吸收层5，能够有效地吸收从孔3a向孔3b传播信号，能够使邻近孔彼此相互传播的信号影响最小。
图2虽然表示出有平均孔径小的层4a和有平均孔径大的层4b两层组成吸附性区域，但是吸附性区域层也不限定为两层，例如可以在有平均孔径相对小的孔的层4a和有平均孔径相对大的孔的层4b两层之间加入该两层平均孔径中间的平均孔径的层。
如图2中所示，在基板的下侧全部设置了相应的信号吸收层，或仅在4a层和4b层中间设置信号吸收层，或者如塞住孔3那样仅设置在4b层的下部，而且也可以仅在层4a、层4b和信号吸收层5被压缩的部分6上，或者其一部分上设置成吸收从某一孔传向邻近孔传播的信号的状态。
作为基板2的材质，为了防止在生化分析装置内部的光散射，以及防止放射线或光透过，优选使用衰减材料，可以使用金属，陶瓷等。另外在使用开孔容易的塑料作为基板时，为了进一步衰减放射线或光，优选在塑料内部分散一些颗粒。
作为金属优选举出铜，银，金，锌，铅，铝，钛，锡，铬，铁，镍，钴，钽，或者不锈钢或黄铜等的合金；作为陶瓷，可以举出氧化铝，氧化锆，氧化镁，石英等；作为塑料优选可以举出聚乙烯或聚丙烯等的聚烯烃类，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯等的丙烯酸树脂，聚氯乙烯，聚偏氯乙烯，聚氟亚乙烯，聚四氟乙烯，聚氯三氟乙烯，聚碳酸酯，聚萘二甲酸乙二酯或聚对苯二甲酸乙二酯等的聚酯，尼龙6或尼龙6，6等的脂肪族聚酰胺，聚酰亚胺，聚砜，聚亚苯基亚磺酸酯，聚二苯基硅氧烷等的硅树脂，线性酚醛树脂等的酚醛树脂，环氧树脂，聚氨酯，醋酸纤维素，或硝化纤维素等的纤维素类，丁二烯-苯乙烯共聚物等的共聚物，以及塑料混合物等等。
而且向在吸附性区域结合的配体或受体特异地结合受体或配体，利用标记物质检出受体或配体时，为了能够抑制从标记物质发出的放射线或光，从基板的孔透过基板壁，为了使放射线或光等衰减，优选在塑料中填充金属氧化物颗粒或玻璃纤维等。作为金属氧化物颗粒可以举出二氧化硅，氧化铝，二氧化钛，氧化铁，氧化铜等，但是没有必要限定。
作为放射线或光衰减的状态，从标记物质发出的放射线或光从基板的孔透过基板壁，达到邻近的孔时的强度优选变为1/5以下，更优选变为1/10以下。
为了有效地遮蔽来自放射性标记物质的电子线等的放射线，基板的平均密度一般为0.6g/cm3以上，优选1-20g/cm3，更优选2-10g/cm3的范围。因为电子线的透过距离和密度成反比，若放射性物质是32P，33P，35S，14C等的一般放射性同位素(RI)，通过使基板2的平均密度在上述范围内，来自固定在各孔3中的样品的RI的电子线能够被基板2的隔壁遮蔽，因此能够防止基于电子线的透过、散射使放射线图像分解能的降低。
基板2的厚度通常优选为50-1000μm范围，更优选100-500μm范围。
对于基板2上孔3的开口部的面积(大小)，为了提高孔3的密度，一般低于5mm2，优选低于1mm2，更优选低于0.3mm2，最优选低于0.01mm2，而且优选在0.001mm2以上。
孔3的间距(邻近两孔中心之间的距离)优选0.05-3mm范围，孔3的间隔(邻近两孔从端部到端部之间的距离)优选0.01-1.5mm范围，孔3的数量(密度)一般为10个/cm3，优选100个/cm3，更优选500个/cm3，最优选1000个/cm3以上，而且优选在100000个/cm3以下，最好在10000个/cm3以下。另外，孔3没有必要如图1那样全部是等间隔的，划分为几个区间(单位)每个区间分别有不同数量的多个孔也是可以的。
作为在基板2上开多个孔3的方法，可以举出用销打孔的冲孔法，在电极上脉冲状外加高电压而使基板挥发的放电加工法，蚀刻法，激光照射方法等。当基板的材料是金属材料或塑料时，在基板表面进行电晕放电或实施等离子体放电，涂覆黏合剂后，将用于形成吸附性区域的吸附性材料用压延的方法贴合来制造生化分析装置。作为黏合剂，优选使用苯乙烯-丁二烯橡胶，丙烯腈-丁二烯橡胶。作为涂覆黏合剂的方法，优选举出辊涂，金属线涂覆，浸渍涂覆，叶片涂覆等的方法。在基板上压延用于形成吸附性区域的吸附性材料时，可以将基板和形成吸附性区域的材料事先分割成片以后，间歇压延。可以将基板和形成吸附性区域的材料各自以长尺寸的带状在两个辊筒之间连续传送。
作为形成吸附性区域的多孔材料，优选使用多孔质材料或纤维材料，而且可以将多孔质材料或纤维材料一起使用形成吸附性区域。本发明中为形成吸附性区域使用的多孔性材料，优选使用任何有机材料或无机材料，也可以使用有机/无机材料的复合材料。
对于为形成吸附性区域使用的有机多孔质材料，没有特别的限制，优选使用活性炭等的碳多孔质材料或能够形成膜过滤器的多孔质材料。作为能够形成膜过滤器的多孔质材料，优选使用在溶剂中可以溶解的聚合物。作为可以在溶剂中溶解的聚合物，可以使用纤维素衍生物(例如硝化纤维素，再生纤维素，纤维素乙酸酯，醋酸纤维素，酪酸醋酸纤维素等)，脂肪族聚酰胺类(例如尼龙6，尼龙66，尼龙410等)，聚烯烃类(例如聚乙烯，聚丙烯等)，含氯聚合物类(例如聚氯乙烯，聚偏氯乙烯等)，含氟树脂类(例如聚氟亚乙烯，聚四氟化物等)，聚碳酸酯，聚砜，藻酸及其衍生物(例如藻酸，藻酸钙，藻酸/聚赖氨酸多离子配合物等)及骨胶原等，也可以使用上述聚合物的共聚物或复合体。
作为形成吸附性区域的纤维材料，没有特别的限制，优选可以举出上述的纤维素衍生物，脂肪族聚酰胺类等。
作为形成吸附性区域的无机多孔质材料，没有特别的限制，优选可以举出金属(例如铂，金，铁，银，镍，铝等)，金属氧化物(例如氧化铝，二氧化硅，氧化钛，沸石)，金属盐(例如磷灰石，硫酸钙等)及其复合体。
适当选择上述形成吸附性区域的多孔性材料，形成有平均孔径相对小的孔的层和有平均孔径相对大的孔的层，或者形成能与在吸附性区域结合的配体或受体结合的官能基相对多的材料构成的层和官能基相对少的材料构成的层。
另外，信号吸收层可以由上述多孔性材料中的吸收光或放射线等的物质混合形成，对于信号是化学发光或荧光的场合，可以混合吸收所述光波长的色素等，对于信号是放射线的场合，可以混合作为放射线遮蔽物质的铅或钨等的重金属的颗粒来形成。
吸附性区域具备有平均孔径相对小的孔的层和有平均孔径相对大的孔的层，或者由可与吸附性区域结合的配体或受体结合的官能基相对多的材料的层和所述官能基相对少的材料的层构成，为此将含有不同种类的多孔质材料的溶液(以下称为原液)顺次流延或涂布在支持体上后，在多孔性聚合物的不良溶剂，或良溶剂和不良溶剂的化合物中浸渍以后，水洗干燥；或者将不同种类的原液分别流延或涂布在支持体上，通过慢慢干燥用另外的方法制造。
图3是制造本发明生化分析装置的一个实施方式的略图，图3所示的生化分析装置是将孔径不同的两层的多孔性膜21和基板2重合压延，通过将多孔性膜21压入基板2的孔3的方法制造。虽然压延，孔3中压入的部分的多孔性膜的孔的孔径在压入孔中时几乎没有变化。
如图3(a)所示，形成孔3的基板2和多孔性膜21重合，在压延辊22和支持辊23之间传送压延；如图3(b)所示，将多孔性膜21压入到基板2的孔3中。此时通过加热压延辊22和支持辊23的方法可以将多孔性膜21软化。
另外本发明的生化分析装置可以通过注入原液的方法制造，图4是制造本发明生化分析装置的另一种实施方式的略图。在连续或间歇地传送的基板2的上方，配置将原液31和33注入基板2的孔3中的分配器30和32。另外为了明确图4中原液和层的形成的关系，绘制了相应的形成原液内容物的层。分配器30向各孔间歇地注入原液31，分配器32继续将原液31注入以后向各孔间歇注入原液33。注入原液31、33以后，提供一定风速的风控制基板12的温度和湿度，慢慢挥发溶剂，能够形成两种不同种类的层。
本发明的生化分析装置能够广泛用于利用标记物质检出受体或配体的鉴定方法，该方法中，在具有结合了配体或受体的多个多孔性吸附性区域的生化分析装置中的配体或受体上，与添加了受体或配体的反应液中的受体或配体进行特异结合。
作为一个实施方式，本发明生化分析装置，能够广泛用于检出标记受体或标记配体的鉴定方法，在该方法中，在具有结合了配体或受体的多个多孔性吸附性区域的生化分析装置中的配体或受体上，与添加了由标记物质标记的标记受体或标记配体的反应液中的受体或配体进行特异结合。
标记受体或标记配体是和在多孔性吸附性区域中结合的配体或受体特异结合的激素类、肿瘤标记物、酶、抗体、抗原、抗体催化剂、其它蛋白质、核酸、DNA、mRNA等的从生物中采集提取、分离的物质，或者是采集后经过化学处理的、由标记物质标记的物质。
作为标记物质可以举出放射线标记物质，荧光标记物质，通过使与化学发光基质接触而产生化学发光的标记物质等，标记物质自身可以是利用放射线，发光，发色或光照射会放出荧光的物质，也可以是使标记物质与任何化学物质接触，标记物质使化学物质分解或反应等而发光，发色或放出荧光的物质。作为前者的标记物质，可以使用放射线同位素，发光物质中的吖啶鎓酯等，发色物质中的金胶体粒子等，荧光物质中的荧光素等；作为后者的标记物质可以使用酶，例如优选使用碱性磷酸酯酶，过氧化物酶，荧光素酶，β-半乳糖苷酶，在这些酶中，通过和化学发光物质或色素基质或荧光物质接触，能够各自放出化学发光，发色或荧光。
作为化学发光基质在是碱性磷酸酯酶，过氧化物酶，荧光素酶的场合，没有特别的限制，可以使用双环氧乙烷(dioxetane)，鲁米诺，虫荧光素；作为色素基质，在酶是碱性磷酸酯酶的场合，可以使用对硝基苯酚磷酸，在酶是过氧化物酶的场合，可以使用4-氨基安替比林和陶粒达(トリンダ-)试剂的组合，二氨基联苯胺，四甲基联苯胺；在酶是β-半乳糖苷酶的场合，可以使用对硝基苯酚β-D-半乳糖苷等。作为荧光物质，在酶是碱性磷酸酯酶的场合使用4-甲基umbelli(ウンベリ)苯基磷酸，在酶是过氧化物镁的场合，可以使用3(4-羟基苯基)丙酸，在酶是β-半乳糖苷酶的场合，可以使用4-甲基umbelli(ウンベリ)苯基β-D-半乳糖苷。
作为其它实施方式，本发明生化分析装置也能够应用于检出受体或配体的鉴定方法，该方法中，在具有结合了配体或受体的多个多孔性吸附性区域的生化分析装置中的配体或受体上，与添加了受体或配体的反应液进行特异结合、受体或配体与由标记物质标记的标记体特异结合。
这也适合用于将检出的受体或配体夹入到吸附性区域的配体或受体和标记体之间，即所谓称为夹层法的方法。此处所述的受体或配体是与多孔性吸附性区域中结合的配体或受体特异结合的激素，肿瘤标记物，酶，抗体，抗原，抗体催化剂，其它蛋白质，核酸，DNA，mRNA等的从生物中采集提取、分离的物质，或者是采集后经过化学处理的物质。
所谓标记物质标记的标记体是上述标记物质标记的、能与受体或配体的反应部位特异结合的抗原，抗体，激素，肿瘤标记物，抗体催化剂，其它的蛋白质，核酸、cDNA，DNA，RNA等，其特性，组成，结构或碱基序列或碱基的长度等是公知的。
另一种形式的本发明生化分析装置，能够用于检出辅助物质结合受体或辅助物质结合配体的鉴定方法，该方法中，在具有结合了配体或受体的多个多孔性吸附性区域的生化分析装置中的配体或受体上，与添加了结合辅助物质的辅助物质结合受体或辅助物质结合配体的反应液中的辅助物质结合受体或辅助物质结合配体进行特异结合，使可与辅助物质特异结合的可结合标记物质与辅助物质结合受体或辅助物质结合配体进行特异结合。
辅助物质是可能结合标记物质的结合物质，可以优选举出异羟基异羟基毛地黄毒苷元，生物素，卵白素，荧光素等的抗原及其所述抗原的抗体。也可以是相对于生物素的卵白素那样的生物学结合配体(partner)。可能结合的标记物质是可能特异结合辅助物质的上述标记物质标记的物质。
其次举例说明利用本发明化学解析用装置的生物化学解析的化学发光法。
对于利用本发明化学分析用装置的化学发光法，首先是在有吸附性区域的生化分析装置中的吸附性区域中结合配体或受体。生化分析装置的吸附性区域，对于由有平均孔径相对小的孔的层和有由平均孔径相对大的孔的层构成的场合，从平均孔径相对小的孔的层侧结合配体或受体。而且生化分析装置的吸附性区域，对于由与配体或受体可能结合的官能基相对多的材料的层和所述官能基相对少的材料的层构成的场合，从和配体或受体可能结合的官能基相对多的材料的层侧结合配体或受体。将配体或受体滴加到吸附性区域后，通过紫外线照射等固定在吸附性区域。
因此从平均孔径相对小的孔的层侧或和从配体或受体可能结合的官能基相对多的材料的层侧，通过结合配体或受体，配体或受体能够在吸附性区域的平均孔径相对小的孔的层或与配体或受体可能结合的官能基相对多的材料的层集中固定。
其次使在吸附性区域中结合的配体或受体特异结合标记受体或标记配体。在这种特异结合时，可以使用以横切吸附性区域的方式使反应液强制流动的反应器，图5是能够使反应液强制流动的反应器的实施方式的示意剖面图。
所述反应器由反应容器41、和溶液循环管42及泵43组成。反应器41内放置生化分析装置40，同时有防止液漏的具有封闭功能的生化分析装置保持部44，反应器本体45由反应器上半部46和反应器下半部47组成，反应器上半部46可以从反应器本体45拆卸下来，生化分析装置40可以通过拆卸反应器上半部46而安装，反应器下半部47的底壁设置可以流通溶液的溶液流入口48，在反应器46的上部顶壁同样设置可以流通溶液的溶液流出口49，流入口48和流出口49及溶液循环管42可以分别拆卸和安装。在反应器中通过泵43将溶液从流入口48泵入反应器本体45，通过生化分析装置40以后，从流出口49流出，通过溶液循环管线构成循环。
在该反应器中安装吸附性区域中结合配体或受体的生化分析装置40，在反应器41内加入添加了标记受体或标记配体的反应液，泵驱动反应液强制横切吸附性区域流动，使标记受体或标记配体与在吸附性区域中结合的配体或受体能够特异结合，配体或受体集中在生化分析装置的吸附性区域一方的层侧，可以使强制性流动的反应液向任何方向流动。
另外，对于图5所示的反应器，泵驱动反应液向一个方向强制流动，例如使用压油器和活塞代替泵可以使反应液在反应器内往复流动，而且反应液仅仅从生化分析装置的下部向上部(或者从上部向下部)通过，也可以使用反应液不循环类型的反应器。
虽然以使用能够使反应液横切吸附性区域强制流动的反应器进行特异结合作为示例进行了说明，但是本发明生化分析装置的使用不受此限制，将生化分析装置和反应液加入到杂交袋中，使杂交袋振动，同时使标记受体或标记配体对流或扩散移动进行特异结合，即所谓的以振荡方式进行。
但是对于生化分析装置的吸附性区域，在将由有平均孔径相对小的孔的层和有平均孔径相对大的孔的层构成的生化分析装置，安装在如上述那样能够使反应液横切吸附性区域强制流动的反应器中进行反应，则在平均孔径相对大的孔的层，反应液的压力抵抗可能小，因此反应液的流动速度高，有希望提高反应效率。
在生化分析装置的吸附性区域结合的配体或受体，因为集中在生化分析装置的吸附性区域的一面的层中，与在吸附性区域结合的配体或受体特异结合的标记受体或标记配体，也在生化分析装置的吸附性区域的一面的层集中结合。
对于安装在反应容器中的生化分析装置，为了除去与在多孔性吸附性区域被结合的配体或受体未特异结合的标记受体或标记配体，优选将所谓的清洗液强制流过吸附性区域进行清洗。因为清洗液强制流过吸附性区域，能够将与在多孔性吸附性区域被结合的配体或受体未特异结合的标记受体或标记配体有效地洗脱除去，能够大大提高清洗效率。
对于上述清洗过程，也优选以横切吸附性区域的方式使下述的酶标记抗体强制流动并与标记受体或标记配体特异结合后，除去未特异结合的酶标记抗体。因此将未能与标记受体或标记配体特异结合的酶标记抗体有效地剥离除去，能够大大提高清洗效率。
在吸附性区域所结合的配体或受体上特异结合的标记受体或标记配体与酶标记抗体结合之前，优选以横切吸附性区域的方式使针对酶标记抗体的封闭缓冲剂强制流动，封闭吸附性区域。通过封闭可以防止酶标记抗体不和标记受体或标记配体的抗原结合而直接结合在吸附性区域。
然后，以横切吸附性区域的方式使酶标记抗体强制流动，与标记受体或标记配体特异结合。酶标记抗体是用酶标记针对标记受体或标记配体的抗体的标记物质(在标记受体或标记配体是抗体时为抗原)。
酶标抗体与标记受体或标记配体特异结合后，在吸附性区域使清洗液强制流动，除去未与标记受体或标记抗体特异结合的酶标抗体。然后将化学发光基质送入吸附性区域，使与标记受体或标记抗体特异结合的酶标抗体接触。
通过化学发光基质和酶的接触，从各吸附性区域发生可见光波长区的化学发光，因此将其从生化学解析用单元的吸附性区域结合的配体或受体集中的一侧用光电检出，可以得到生物化学分析用图象的数据。由于标记物质的信号不衰减，可以检出测定标记受体或标记配体。
以下使用实施例具体说明本发明。
实施例实施例1在尺寸50mm×50mm，厚100μm的SUS304片材(基板材料片材)上，开孔径0.3mm的圆形微孔，通过蚀刻形成间距0.45mm的2500个孔。
然后，使用ALDRICH社制的聚合度不同的尼龙66(以下称为低聚合度和高聚合度尼龙66)作为填充材料填充吸附性区域，准备高聚合度尼龙66和低聚合度尼龙66各10g溶解在甲酸52g中的两种溶液，溶解高聚合度尼龙66得到溶液黏度是6.25Pa·s，溶解低聚合度尼龙66的溶液黏度是0.94Pa·s。在每85g上述两种溶液的各中添加15g水，在清洁的玻璃板上首先将低聚合度的尼龙66按照潮湿厚度均匀流延，然后再将高聚合度尼龙66按照潮湿厚度均匀流延，低聚合度的尼龙66湿厚度是300μm，高聚合度尼龙66的湿厚度是100μm，合计湿厚度是400μm。
在甲酸和水的比例为45∶55的甲酸水溶液中浸渍，形成细孔后干燥，根据膜断面的电子显微镜观察，由低聚合度尼龙66溶液形成较大细孔(1μm)的层，由高聚合度尼龙66溶液形成较小细孔(0.4μm)的层(以下称为细孔层)，重层结构的膜厚度为180μm。
在上述基板的一面涂覆黏合剂，将进入基板孔内部的黏合剂吸引除去以后，干燥，然后在涂覆了黏合剂的面上压入贴合上述两层结构的吸附性区域结构材料，压入使用压延机(压片侧的辊筒温度是150℃，另一面的辊筒温度是50℃)，压力是100kPa/cm。
将热变性的浓度25ng/μl的单链pBR328-DNA溶液(罗氏公司制造)从上述制造的生化分析装置的吸附性区域的细孔层侧每10nl滴下，之后用紫外线照射(254nm，33mJ/cm2)，固定单链pBR328-DNA。
将磷酸二氢钠(无水)71g溶解在灭菌的纯水800ml中，加入磷酸3-4ml调整pH达到7.2，加入无菌纯水到1000ml，制成1M的磷酸缓冲液，向制成的磷酸缓冲液50ml和灭菌纯水43ml中加入十二烷基硫酸钠7g，一边加热一边搅拌溶解，加入200μl的0.5MEDTA，调制杂交溶液。
将异羟基毛地黄毒苷元(DIG)标记的浓度为5ng/μl的pBR328-DNA溶液(罗氏公司制造)用TE缓冲液(ニツポンジ-ン社制造10mM Tris-HCl和1mMEDTA混合溶液)稀释，将用DIG标记的pBR328-DNA溶液热变性做成单链后，通过上述杂交溶液稀释调制含有DIG标记pBR328-DNA的杂交反应液，使浓度为10pg/ml。
将上述生化分析装置放入杂交袋中，向袋内加入杂交反应液10ml，于68℃振荡18小时进行杂交反应，杂交反应后，向袋中加入清洗液，将生化分析装置清洗。
将清洗缓冲液(罗氏公司制造)用灭菌纯水稀释到1/10浓度配制化学发光用清洗液，向放入袋内的生化分析装置提供清洗液，振荡5分钟，使用由灭菌纯水稀释到浓度1/10的马来酸缓冲液(罗氏公司制造)将封闭缓冲液(罗氏公司制造)稀释到1/10浓度后，用聚醚砜制造的过滤器(φ＝0.2μm)过滤作为封闭剂，弃去清洗液后将封闭剂加入袋中，振荡1小时，进行封闭反应。
然后将反式-异羟基毛地黄毒苷元-AP-复合体(罗氏公司制造碱性磷酸酯酶标记的异羟基毛地黄毒苷元抗体)用聚偏氟乙烯制造的过滤器(φ＝0.2μm)离心过滤，使用上述封闭剂稀释成浓度0.075U/ml，调制酶标记抗体溶液，向弃去封闭剂后的袋内加入5ml，振荡1小时进行抗原抗体反应。
抗原抗体反应完成后，向袋中加入上述化学发光用的清洗液，清洗生化分析装置，取下生化分析装置，使和含有作为化学发光基质的CDP-star(CDP-star，备用，罗氏公司制造)溶液接触，将从生化分析装置的吸附性区域放出的化学发光从生化分析装置的细孔层侧使用冷却CDD照相机(LAS1000富士胶片株式会社制造)进行光电检出，得到数字信号。
实施例2除了生化分析装置的吸附性区域形成为低聚合度的尼龙66溶液湿厚度是200μm，高聚合度尼龙66溶液的湿厚度是200μm，合计湿厚度是400μm以外，和实施例1同样进行化学发光，得到数字信号。
实施例3除了生化分析装置的吸附性区域形成为低聚合度的尼龙66溶液的湿厚度是100μm，高聚合度尼龙66溶液的湿厚度是300μm，合计湿厚度是400μm以外，和实施例1同样进行化学发光，得到数字信号。
实施例4将DIG标记的浓度为5ng/μl的pBR328-DNA溶液用TE缓冲液稀释，将用DIG标记的pBR328-DNA溶液热变性后形成单链，用实施例1制作的杂交溶液稀释到浓度1pg/ml，调制含有DIG标记pBR328-DNA的杂交反应液。
将在吸附性区域中固定了单链链pBR328-DNA的实施例2制作的生化分析装置放入如图5的反应器中，向反应器中加入杂交反应液4ml，驱动泵并于68℃杂交18小时，杂交反应后驱动泵清洗生化分析装置的吸附性区域。
将实施例1配制的化学发光用清洗液加入放入了生化分析装置的反应器内，驱动泵工作5分钟，将生化分析装置中的吸附性区域置换为化学发光用清洗液，向弃去了清洗液后的反应器内加入实施例1制作的封闭剂，驱动泵工作10分钟，用封闭剂置换生化分析装置的吸附性区域的所有部分后，停止泵，静置50分钟。
将5ml实施例1制作的酶标记抗体溶液加入到弃去了封闭剂后的反应器内，驱动泵1分钟，用酶标抗体溶液置换生化分析装置的吸附性区域的所有部分后，停止泵，静置1小时。
抗原抗体反应完成后，向反应容器中加入上述清洗缓冲液，驱动泵清洗生化分析装置。然后通过泵驱动使作为化学发光基质的CDP-star(CDP-star，备用罗氏公司制造)与生化分析装置的吸附性区域接触，将从生化分析装置的吸附性区域放出的化学发光从细孔层侧使用冷却CDD照相机(LAS1000富士胶片株式会社制)进行光电检出，得到数字信号。
比较例1除了将实施例1中所用的高聚合度尼龙66以与实施例1同样的方式制成溶液，在清洁的玻璃板上流延至潮湿厚度400μm，由此构成吸附性区域以外，和实施例1同样制造生化分析装置，和实施例1同样进行化学发光，得到数字信号。
比较例2除了将实施例1中所用的低聚合度尼龙66以与实施例1同样的方式制成溶液，在清洁的玻璃板上流延至潮湿厚度400μm，构成吸附性区域以外，和实施例1同样制造生化分析装置，和实施例1同样进行化学发光，得到数字信号。
比较例3使用比较例1制作的生化分析装置，和实施例4一样地使用图5所示的反应器进行化学发光，得到数字信号。
对于实施例1-3和比较例1和2的生化分析装置，将信号，噪音的发光量和S/N列于表1。
表1

从表1可以看出，和吸附性区域由相同大小的细孔构成的比较例相比，对于吸附性区域由有平均孔径相对小的孔的层和有平均孔径相对大的孔的层构成的本发明生化分析装置，在任何场合下，其检出的数字信号大、噪音小。对于实施例的生化分析装置，在吸附性区域固定的pBR328-DNA(配体或受体)，集中在细孔层(具有平均孔径相对小的孔的层)，因为特异结合的DIG标记pBR328-DNA(受体或配体)也集中在细孔层，将DIG标记pBR328-DNA中结合的碱性磷酸酯酶标记异羟基毛地黄毒苷元抗体接触CPD-star而得到的化学发光，也在细孔层上集中，由于从细孔层侧对此进行检出，所以信号不衰减，可以得到好的检出结果。
另外，与pBR328-DNA在整个吸附性区域分散结合的比较例的生化分析装置相比，实施例1-3的生化分析装置在基板下形成吸附性区域的层连续，从通过基板下的层的某孔向邻近的孔传播信号，但是由于吸附性区域固定的pBR328-DNA集中结合在细孔层，因此能够抑制在该孔间传播的信号量，减小其噪音。
对于实施例4和比较例3的生化分析装置，将信号，噪音的发光量和S/N列于表2。
表2

对于实施例4和比较例3，同样是使用图5所示的反应器，使反应液强制横切吸附性区域流动，进行化学发光，但此时，如表2所示，和吸附性区域由相同大小的细孔构成的比较例相比，由有平均孔径相对小的孔的层和有平均孔径相对大的孔的层构成的本发明生化分析装置，其检出的数字信号大，噪音小。
另外，在本实施例中，显示了具有由有平均孔径相对小的孔的层和有平均孔径相对大的孔的层构成的吸附性区域的生化分析装置，但是由与在吸附性区域结合的配体或受体可能结合的官能基相对较多的材料构成的层和官能基相对较少的材料构成的层构成的吸附性区域生化分析装置，也可以得到同样的效果。
权利要求
1.一种生化分析装置，由有多个孔的基板和在所述多个孔内填充形成吸附性区域的多孔性吸附性材料构成，其特征是，上述吸附性区域具备有平均孔径相对小的孔的层和有平均孔径相对大的孔的层。
2.根据权利要求1所述的生化分析装置，其特征是，在上述基板的一面上，形成上述吸附性区域的上述层连续，并设置对从通过上述基板下的层的某孔传向该孔邻近的孔的信号进行吸收的信号吸收层。
3.一种生化分析装置，由有多个孔的基板和在所述多个孔内填充形成吸附性区域的多孔性吸附性材料构成，其特征是，上述吸附性区域具备由与结合于该吸附性区域的配体或受体结合的官能基相对多的材料构成的层和由上述官能基相对少的材料构成的层。
4.根据权利要求3所述的生化分析装置，其特征是，在上述基板的一面上，形成上述吸附性区域的上述层连续，并设置对从通过上述基板下的层的某孔传向该孔邻近的孔的信号进行吸收的信号吸收层。
全文摘要
本发明提供一种生化分析装置，能够抑制来自受体或配体的信号衰减。该装置由有多个孔(3)的基板(2)，在该多个孔(3)内填充形成吸附性区域(4)的多孔性吸附性材料构成，该生化分析装置(1)的吸附性区域(4)具备有平均孔径相对小的孔的层(4a)和有平均孔径相对大的孔的层(4b)。
文档编号G01N35/00GK1696703SQ20041005954
公开日2005年11月16日 申请日期2004年5月11日 优先权日2004年5月11日
发明者中嶌贤二, 嘉藤彰史 申请人:富士胶片株式会社