专利名称：具有由石墨烯支持的人工脂质膜的纳米孔装置的制作方法
具有由石墨烯支持的人工脂质膜的纳米孔装置
与相关申请的交叉引用 本申请要求于2010年6月8日提交的美国临时申请号61/352,636和61/352，791的权利，所述美国临时申请各自通过引用合并进入本文。
关于联邦资助研究的声明 本发明在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的HG003703之下由政府支持进行。政府在本发明中拥有一定权利。
发明背景 本发明涉及人工脂质双层膜领域。
人工脂质单层和双层频繁用于发现细胞表面和胞内膜蛋白质的生理学和药理学性质。人工单层和双层也是许多商业装置包括灵敏的生物传感器的关键组分，所述生物传感器正被用于或正被开发以用于检测生物战试剂，发现调节人疾病或病原体功能的膜受体，以及筛选药物试剂以揭示其功能、身份和浓度。在过去四十年中，对重构在无支持的脂质双层中的蛋白质进行的电生理学研究已产生关于膜蛋白质功能、配体结合和动力学的详细信息。因为膜蛋白质的功能在发育、器官功能和健康的所有方面中起关键作用，所以对重构在脂质双层中的蛋白质的研究广泛地用于筛选潜在有用的药物以及鉴定用于药物治疗的靶。
电生理学研究已用于表征可以通过跨膜蛋白质例如α-溶血素易位的单一分子例如DNA分子的性质。
单层通常在疏水表面上形成且由疏水表面支持，双层则较通常被装配为自支撑膜。脂质单层和双层是容易被损害的易变的脆弱结构。特别适合用于获取来自膜蛋白质和灵敏的纳米孔检测方法的电生理学数据的自支撑双层膜特别容易受破裂影响。因此，本领域存在对有弹性的人工脂质膜的需求。
发明概述 一般而言，本发明的特征在于包括在具有一个或多个开口的石墨烯上的人工膜，所述开口例如具有小于IOym的尺度(例如排列成阵列中的多个开口)。人工膜包括两个脂质单层，所述两个脂质单层各自接触石墨烯的一个面并且在石墨烯中的开口内形成脂质双层。脂质双层可以进一步包括蛋白质(例如跨膜蛋白质)。跨膜蛋白质可以是离子通道、多抗药性泵、细胞因子受体、来自免疫球蛋白大家族的受体、来自肿瘤坏死因子受体家族的受体、趋化因子受体、受体酪氨酸激酶或TGFP受体。
装置还可以包括设置于至少一个开口中的至少一个孔(例如α-溶血素)，其例如在每个开口中设置至多一个孔。分子马达可以与至少一个孔邻近，并且可以能够使聚合物相对于孔移动。在其中聚合物是核酸的实施方案中，分子马达的例子是DNA聚合酶(例如大肠杆菌(疋coli 聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(克列诺夫(Klenow)片段)、曬菌体 T7 DNA 聚合酶、Ph1-29 DNA 聚合酶、水生栖热菌(Taq)DNA 聚合酶、黄栖热菌flavus) (Tfl)DNA 聚合酶、嗜热栖热菌ThermophiIus )(Tth) DNA聚合酶、岸边热球菌iThermococcus Iitora I is、(Tli) DNA聚合酶、激烈热火球古菌OdJtococcw1S furiosus) (Pfu) DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、嗜热嗜脂肪芽抱杆菌{Bacillus stearothermophiIus) (Bst) DNA 聚合酶、AMV 逆转录酶、MMLV 逆转录酶、和HIV-1逆转录酶)、RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶)、核糖体、外切核酸酶(例如外切核酸酶λ、Τ7外切核酸酶、Exo IIKRecJ1外切核酸酶、Exo I和Exo Τ)、或解旋酶(例如大肠杆菌噬菌体Τ7 gp4和Τ4 gp41基因蛋白质、大肠杆菌蛋白质DnaB、大肠杆菌蛋白质RuvB和大肠杆菌蛋白质rho)。在上述任何中，装置可以进一步包括支持石墨烯的框架(例如包括陶瓷或氮化硅的非导电性框架)和/或设置在石墨烯的相反侧上的第一电极和第二电极。框架可以置于石墨烯的一个面上，为每个开口形成用于容纳液体的区室。多个区室可以各自包括电极(或其他传感器)且一般是流体分离的。在另一个方面，本发明的特征在于分析靶聚合物的方法，其包括将靶聚合物引入本发明的含孔的装置，允许靶聚合物相对于孔移动以产生信号，以及监控对应于靶聚合物移动的信号。在这些方法中使用的示例性装置包括分子马达，例如外切核酸酶，以控制聚合物例如核酸的移动。信号监控可以包括测量靶聚合物的单体依赖性特征(例如聚合物中的单体身份或单体数目)。在一个实施方案中，聚合物的移动速率可以在信号监控之前、过程中或之后改变。该方法可以替代地用于研究聚合物对孔或分子马达的作用。在另一个方面，本发明的特征在于鉴定与跨膜蛋白质相互作用的化合物的方法，通过使置于任何前述装置中的跨膜蛋白质与化合物接触，以及测量在该化合物存在下该蛋白质的至少一种活性(直接或间接地通过其对该化合物的作用)，由此在该化合物的存在下活性的变化指示该化合物与该蛋白质相互作用。在与蛋白质相互作用的过程中，化合物可以与蛋白质结合，抑制蛋白质，激活蛋白质，与蛋白质反应，或化合物被改变。替代地，该化合物可以影响双层的完整性或刚性，从而与蛋白质间接相互作用。在一个实施方案中，施加电场，以及测量跨膜蛋白质的至少一种活性包括测量跨膜蛋白质的电阻。类似地，该些方法可以用于测量化合物与其他膜分子例如双层中的脂质或与脂质缀合的化合物的相互作用。在这样的方法中，脂质双层可以包括或不包括孔。“跨越”意指不是从一个面到另一个面，例如在与石墨烯的面基本上相同的平面的测量或移动。“穿过”意指从石墨烯的一个面到相反面的测量或移动。“活性变化”意指当与在不存在候选化合物的情况下开口的性质相比较时，在候选化合物的存在下对开口的相同性质进行测量所得差异。活性变化可以是例如1%、5%、10%、25%、50%、75%、100%或更多的增加或减少。“顺”意指聚合物穿过其进入开口的侧或聚合物移动跨越其面的开口的侧。“反”意指聚合物(或其片段)穿过其离开开口的侧或聚合物不移动跨越其面的开口的侧。“分子马达”意指与聚合物例如多核苷酸物理性相互作用且能够相对于固定位置物理移动聚合物的分子(例如酶)。尽管不预期受理论束缚，但分子马达利用化学能以产生机械力。分子马达可以以序贯方式与聚合物的每个单体相互作用。从下述附图、详细说明和权利要求书将可看到本发明的其他特征和优点。附图简述

图1 是显示采用从 Montal 和 Muller (Proc Nat Acad Sci 69,3561-3566 (1972))适应的方法用于在石墨烯上产生脂质双层的示意图。
图2是在框架上固定石墨烯从而使得石墨烯的两个面都是可接近的示意图。插贗..已在其内钻出单个开口的类似的固定的石墨烯。
图3是用于形成由石墨烯支持的脂质双层阵列的结构的示意图(未按比例)。显示了六个纳米孔的2 X 3阵列，其各自支持脂质双层。在非导电性陶瓷框架下面的每个区室可以形成配备电极(例如Ag-AgCl)的分开的溶液区室，具有在由石墨烯支持的双层的相反侧上的共同接地电极。
图4是显示通过石墨烯中的开口插入脂质双层内的跨膜蛋白质α-溶血素的示意图。如果开口钻至合适尺度(对于α-溶血素为约5 nm)，那么其与跨膜蛋白质的茎(stem)(箭头)接近，使得能够将高度局限性场应施加于被插入的蛋白质的跨膜部分的周围，并且使得进一步能够通过石墨烯的面内导电性和/或其他电学性质中的变化感应构象和其他功能性蛋白质改变。
图5是使用膜融合形成由石墨烯支持的双层的示意图。
图6是显示在所示条件下电流作为跨越石墨烯中8 nm的开口的电压的函数的曲线图。
图7是固定在SiNx/Si框架上的石墨烯的示意图。已除去接近开口的石墨烯部分。该简图还显示了固定在石墨烯的相同面上的两个电极。
发明详述 石墨烯是键合碳原子的一个原子厚的平面片。我们已发现石墨烯是用于生成人工脂质单层和双层的优良疏水性支持，原因例如石墨烯可以制造成原子薄的、强的、相对化学惰性和机械稳定的片。尽管石墨烯不将离子或电子从一个面导向另一个面，但它在每个面的平面中是导电性的。这种面内导电性对于石墨烯暴露于其中的环境是敏感的。
石墨烯可以塑造为含有例如具有宽以毫米计到单纳米(或更少)尺度的小开口，其允许形成脂质双层。石墨烯的每个面支持脂质单层，并且两个单层可以接触且形成在石墨烯中的开口中的脂质双层。因为石墨烯是原子薄的，所以石墨烯的每个面上支持的脂质分子和形成脂质双层的脂质分子之间的位错是最低限度的。这种构型产生在双层和石墨烯之间的结实的千兆欧姆密封。
分子(例如膜蛋白质)可以掺入石墨烯中的开口中的双层内。这样的结构对于研究和测定例如掺入的膜蛋白质的结构性质和功能性质是有用的。此外，孔可以掺入石墨烯中的双层开口内。这样的结构对于研究和测定聚合物的结构(例如核酸的序列)是有用的。为了监控这样的结构性质和功能性质，本发明可以包括适当模式化(patterned)的、电连接的石墨烯，其可以传递电学电流，包括面内电流量度例如隧道电流，以横过跨膜蛋白质的中心疏水区，以监控或改变膜活性。
替代地,通过在开口的一侧上具有油或另一种疏水介质和在另一侧上具有水或另一种亲水介质，可以在石墨烯的一个面上形成脂质单层。在石墨烯中的开口内的脂质单层随后分开疏水和亲水介质。分子与介质之间的这个界面的相互作用可以例如使用如本文描述的电学或光学检测进行测量。
脂质双层本发明的特征在于设置在石墨烯开口内的脂质双层。在制备双层的一种方法中，脂质单层被设置在石墨烯的两个面上，导致石墨烯中的开口内自然形成脂质双层。在另一种方法中，设置在石墨烯的两侧上的脂质体被诱导以重排成在开口内的脂质双层。
在一个实施方案中，双层可以使用从Montal和Muller (Proc Nat Acad SciU.S.A.69,3561-3566 (1972))适应的方法来产生。在本发明中，可以在刚性框架上支持的石墨烯缓慢浸入在Langmuir-Blodgett槽中的溶液内，具有维持在恒压的由脂质单层覆盖的溶液-空气界面(参见图1)。图2和3显示了固定在合适框架上的石墨烯。当固定在其框架上的石墨烯穿过脂质覆盖的溶液-空气界面时，脂质的单层转移至石墨烯的两个面中的每一个。此外，脂质双层(其小叶与目前覆盖石墨烯每侧的两个小叶连续)可以被诱导以跨越石墨烯中的开口(大小为纳米到微米)自装配。石墨烯可以通过框架支持以形成两个水性区室。此处，在石墨烯开口中的脂质双层将代表分开两个水性区室的最薄部分。
在另一个实施方案中，由石墨烯支持的双层通过使石墨烯的两个面暴露于含有单层脂质体的溶液产生，脂质体的直径大于石墨烯中的开口的直径。因为完整的脂质体(其外表面是未水的)不太可能与疏水石墨稀表面结合，所以一些脂质体跨越石墨稀中的开口彼此融合(图5，上)。这种融合导致分子重排和结构破坏，产生在石墨烯的每个面上的脂质单层和在开口内的双层(图5,下)。
在这个实施方案中，触发的融合可能是渴望的，以致使得在加入触发试剂(例如Ca++)之前，可以将完整 的融合前脂质体引入溶液中的石墨烯膜的两侧上。可以将毫摩尔浓度的Ca++加入由磷脂酰乙醇胺(phospatidylethanolamine):磷脂酰丝氨酸以1:1摩尔比组成的脂质体，以触发两种脂质体的融合。通过本领域已知的标准方法，例如Cooper (J.Mol.Recognit.17，286-315 (2004))中公开的方法，也可以在石墨烯的仅一个面上形成脂质双层和单层。
脂质双层可以包括饱和及不饱和脂质。脂质的另外例子是磷脂(例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油)、糖脂和鞘脂(例如鞘磷脂(sphingomylein)和固醇)。脂质还可以例如在极性头上缀合至其他分子。
双层在它们不附着至活细胞的意义上是人工的。可以采用或不采用来自生物体例如真核生物(例如植物、真菌、原生生物或动物)、原核生物或病毒的膜或组分。
石墨烯开口 在石墨烯中的开口是例如具有纳米至微米大小的洞。在本发明中有用的开口一般具有以下的宽度(即跨越开口)范围:1-1000 nm，例如至多750、500、400、300、250、200、150、100、90、80、70、60 50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3 或 2 nm 和至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500 或 750 nm。贯穿尺度通过石墨烯的厚度控制。这个厚度可以通过采用石墨烯片的叠例如2-5片得到增加。采用的开口的尺度和形状将取决于预期应用。
在特定实施方案中，开口具有使在跨 旲蛋白质和石墨稀之间的接近和接触达到最大的大小。例如，宽在4.5 - 5.5 nm之间的开口适合于容纳α -溶血素的4.4 nm直径的跨膜茎(图4)。因此，开口可以具有比跨膜蛋白质的直径宽不超过5、4、3、2、1、0.5,0.25或0.1 nm的尺度。开口的区域中的过量石墨烯也可以用聚焦的电子束或离子束去除，如图7中所示。因此，在特定实施方案中，开口是设置在石墨烯中比开口宽不超过0.5、1、2、3、4、5、10、20、30、40 或 50 nm 的区域中。开口可以具有适应特定聚合物通过的大小，所述聚合物例如多核苷酸、多肽和多糖。例如，宽约0.5-2.0 nm的开口适合于单链DNA的通过；宽1.0-3.0 nm的开口适合于双链DNA的通过；并且宽1.0-4.0 nm的开口适合于多肽的通过。因为跨膜蛋白质仅可在双层区域中完全插入或自装配，所以石墨烯中的开口阵列将产生这样的脂质双层阵列，所述脂质双层阵列含有以与石墨烯开口的阵列相同模式(pattern)以及相同的分子间间隔插入这些双层内的膜蛋白质。此外，因为石墨烯可以是电接触且在每个面的面内是导电性的，所以可以对插入这些无支持的脂质双层内的跨膜蛋白质的中心疏水区实施高度局限性电场，而不破坏脂质环境(图4)。因为石墨烯的强度和机械稳定性，所以可以制成(使用例如电子或离子束)单独或在阵列中的具有任何所需间隔的单纳米宽的开口(图3)，且能够支持稳定的脂质双层。膜分子
分子可以设置在石墨烯中的开口中形成的脂质双层内。分子可以是成孔蛋白质(例如离子通道和电压门控通道)或跨膜蛋白质(例如跨膜受体)。可以在本发明中使用的成孔蛋白质的例子包括短杆菌肽(例如来自短芽孢杆菌(,Bacillus brevis、的短杆菌肽A ;可从Fluka, Ronkonkoma, N.Y.获得)；来自大肠杆菌、志贺氏菌属(Shigella)和其他肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的LamB (麦芽糖孔蛋白)、OmpF、OmpC或PhoE, α -溶血素(来自金黄色葡萄球菌(51 aareiAs)), Tsx, F-菌毛，λ外切核酸酶，MspA,和线粒体孔蛋白(VDAC)。还可以采用这些孔的同系物(homologs)和旁系同源物(paralogs)。经修饰的电压门控通道也可以用于本发明中。电压门控通道包括电压依赖性钙通道、电压门控的钠通道、电压门控的钾通道和电压门控的质子通道。改变电压门控通道的失活特征的方法是本领域众所周知的(参见例如，Patton等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,89:10905-09 (1992);West 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,89:10910-14 (1992)；Auld等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，87:323-27 (1990) ;Lopez 等人，Neuron，7:327-36(1991) ；Hoshi 等人，Neuron，7:547-56 (1991) ；Hoshi 等人，Science，250:533-38 (1990)，都通过引用合并进入本文)。孔可以使用如全细胞膜片钳(“穿孔膜片”技术)领域众所周知的化学品(或肽)例如制霉菌素和肽通道例如丙甲菌素在脂质双层中形成。成孔蛋白质也可以连接至分子马达(例如聚合酶或外切核酸酶)。此处，可以将编码融合蛋白的合成/重组DNA转录且翻译，随后插入本发明的人工膜的脂质双层区域内。例如，大肠杆菌DNA聚合酶I (并且通过同源性，T7 DNA聚合酶)的C末端非常接近于新近合成的DNA的大沟表面。如果聚合酶的C末端融合至成孔蛋白质例如大肠杆菌素El的N末端，并且大肠杆菌素插入人工膜内，那么大肠杆菌素孔的一个孔口应面对DNA的大沟并且一个孔口应面对脂质双层的相反侧。大肠杆菌素分子可以进行修饰，以达到与聚合酶相容的最适pH，参见Shiver等人(J.Biol.Chem.，262:14273-14281 1987，在此通过引用合并进入本文)。孔和聚合酶结构域两者可以进行修饰，以含有在点上的半胱氨酸替换，以致使得形成二硫键，以稳定化迫使孔的孔口更接近于大沟表面且在聚合物经过孔的孔口时使聚合物稳定的几何学。在这个表面上的孔结构域的环可以进行系统修饰，以使对于DNA序列中的变化的敏感性达到最大。
跨膜受体包括细胞因子受体(例如IL-2受体、干扰素α / β受体、干扰素Y受体、促红细胞生成素受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、生长激素受体、促乳素受体、制瘤素M受体和白血病抑制因子受体)、免疫球蛋白大家族成员(例如白细胞介素-1受体、CSFl、C-kit受体和白细胞介素18受体)、肿瘤坏死因子受体家族成员(例如⑶27、⑶30、⑶40、⑶120和淋巴毒素β受体)、趋化因子受体(白细胞介素-8受体、CCR1、CXR4、MCAF受体和NAP-2受体)、受体酪氨酸激酶(例如促红细胞生成素受体、胰岛素受体、Eph受体、和胰岛素样生长因子I受体)、TGF0受体(例如TGFP受体I和2)、和其他G蛋白偶联受体。
另外的分子包括离子通道和泵例如多抗药性泵。
分子马达 能够移动目的聚合物(例如多核苷酸)的任何分子马达可以用于本发明中。分子马达的期望性质包括:序贯作用，例如每周转一个核苷酸的添加或去除；沿着靶聚合物无倒行(backtracking);马达没有因用于驱动聚合物至马达的力例如来自电场的力而在聚合物上滑动；当邻近开口设置时，催化功能的保留；高持续合成能力，例如保持与靶聚合物结合且在解离前执行至少1，000轮催化的能力。
分子马达包括例如聚合酶(即DNA和RNA)、解旋酶、核糖体和外切核酸酶。根据本文描述的方法使用的分子马达将部分取决于待分析的靶聚合物的类型。例如，当靶多核苷酸是DNA时，分子马达例如DNA聚合酶或解旋酶是有用的，并且当靶多核苷酸是RNA时，分子马达例如RNA聚合酶是有用的。此外，使用的分子马达将部分取决于靶多核苷酸是单链还是双链的。本领域普通技术人员将能够鉴定根据具体应用有用的合适分子马达。
DNA聚合酶已证实充当有效的分子马达。示例性DNA聚合酶包括大肠杆菌DNA聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(克列诺夫片段)、噬菌体T7 DNA聚合酶、Ph1-29 DNA聚合酶、嗜热聚合酶(例如水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶、黄栖热菌(Tf I )DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Tth) DNA聚合酶、岸边热球菌(Tli) DNA聚合酶、激烈热火球古菌(Pfu) DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、或嗜热嗜脂肪芽孢杆菌(Bst) DNA聚合酶)、和逆转录酶(例如AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶、或HIV-1逆转录酶)。其他合适的DNA聚合酶是本领域已知的。在一个实施方案中，每秒约300个核苷酸以棘齿样(ratchet-like)线性方式穿过DNA聚合酶的钳，其减少多核苷酸向后移动的可能性。在特定实施方案中，大肠杆菌DNA聚合酶1、克列诺夫片段、噬菌体T7 DNA聚合酶、Taq聚合酶和Stoffel片段从本发明中采用的分子马达中排除。
RNA聚合酶如同DNA聚合酶也可以充当有效的分子马达。示例性RNA聚合酶包括T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、和大肠杆菌RNA聚合酶。在特定实施方案中，T7 RNA聚合酶从本发明中采用的分子马达中排除。
分子马达还可以包括单链特异性或双链特异性外切核酸酶。自身形状为具有类似于α-溶血素尺度的孔的λ外切核酸酶可以作为马达操作，控制核酸聚合物穿过通道的移动。外切核酸酶λ是从大肠杆菌噬菌体λ中分离的三聚酶，并且由于许多原因，特别良好地适合于在本发明的方法和装置中使用。它作用于双链DNA，其是用于遗传分析的优选底物。此外，它是高度连续性酶，并且仅作用于双链DNA的一条链，其促进给定DNA分子相对于开口的移动。此外，消化速率是每秒约10-50个核苷酸(van Oijen等人Science 301:1235(2003);Perkins等人Science 301:1914 (2003))。当双链聚合物穿过孔时，外切核酸酶抓住第一条链的5’单链突出端(经双链DNA末端的内切核酸酶消化或通气)，且在其3’末端上序贯地切割互补的第二条链。在序贯切割过程中，外切核酸酶沿着第一条链5’至3’向下进行，以受控制的速率拉动双链DNA穿过通道。因此，外切核酸酶可以作为孔以及用于牵引核酸聚合物穿过通道的马达操作。外切核酸酶λ也可以从本发明中采用的分子马达中排除。另外的外切核酸酶包括例如Τ7外切核酸酶、Exo IIKRecJ1外切核酸酶、Exo I和ExoΤ。另一类型的分子马达是解旋酶。解旋酶是蛋白质，其沿着多核苷酸主链移动且展开多核苷酸，以致使得可以发生DNA复制、修复、重组、转录、mRNA剪切、翻译和核糖体装配的过程。解旋酶包括RNA和DNA解旋酶两者。解旋酶先前已在美国专利号5，888，792中描述。示例性解旋酶包括六聚体解旋酶，例如大肠杆菌噬菌体Τ7 gp4和Τ4 gp41基因蛋白质，以及大肠杆菌蛋白质DnaB、RuvB和rho (关于综述参见:West SC，化77，86，177-180(1996))。六聚体解旋酶以5' -3'方向展开双链DNA，其确保DNA靶分子的定向分析。此夕卜，一些解旋酶具有每秒超过1000个核苷酸的进行性(processive)易位速率(Roman等人J.Biol.Chem.267:4207 (1992)。此外，这些六聚体解旋酶形成具有大小范围为2_4纳米的内部洞尺度和约14纳米的外部环尺度的环结构，其在有用的分子马达的尺度限制内。六聚体环结构在Mg+2和一些类型的核苷酸(NMP、NDP或NTP)的存在下形成且被稳定化。具体分子马达的固有移动速率可以例如通过下述进行改变:马达的化学修饰，温度、pH、离子强度的改变、必需辅因子、底物、抑制剂、激动剂或拮抗剂的存在，介质的性质(例如非水溶剂的存在或粘度)，外源场(例如电场或磁场)和流体动压力。这样的改变可以用于起始、停止、增加、减少或稳定移动速率，其可以在特定表征过程中发生。此外，这样的改变可以用作开关、制动器或加速器，例如以起始、停止、增加或减少多核苷酸的移动。在替代实施方案中，由分子马达以外产生的外力(例如电场或磁场或流体动压力)可以用于控制移动速率。在对特定多核苷酸分析之前、过程中或之后，移动速率可以基本上被减慢或甚至停止(例如暂停)。分子马达可以设置在由石墨烯支持的脂质双层的顺侧或反侧上。在任一情况下，分子马达可以邻近孔或与孔顺排(inline)。分子马达也可以完全地或部分地设置在石墨烯开口内。分子马达可以缀合至双层中的脂质或设置于双层中的另一种分子，例如非成孔蛋白质或固醇。检测系统
本发明的特征在于使用脂质双层检测化合物性质的测定和装置。在一系列实施方案中，本发明的双层含有膜分子(例如跨膜蛋白质和孔)。化合物随后施用于双层，并且测量分子的至少一种性质(直接或间接地通过对该化合物的作用)。这样的性质可以包括电学性质，例如对电导的作用。在另一系列实施方案中，本发明的双层用于鉴定聚合物的性质(例如多核苷酸的序列或长度)。在这个系列的实施方案中，将成孔分子设置在脂质双层中，并且当聚合物相对于孔移动(例如跨越经过或穿过孔)时，测量性质例如跨越或穿过孔的导电率。本发明还可以用于对具有双层或其组分的生物体(例如细胞或病毒)的研究中。典型的检测系统包括当化合物例如多核苷酸与孔或其他膜分子相互作用时，能够测量该化合物的特征的电子设备，能够控制特征的测量且贮存或展示相应数据的计算机系统，和能够测量在装置中的化合物、孔、其他膜分子或石墨烯的至少一种性质的一个或多个检测器。
检测系统可以测量转运性质，例如但不限于平面电流例如隧道电流中个别电导或电子在跨越或穿过开口或孔的在振幅或持续时间中的变化。
在一个实施方案中，检测系统可以用于测定聚合物(例如多核苷酸)的性质或长度。孔的电学性质中的变化可以鉴定序列中的单体，因为每个单体具有特有的电导变化标记，或跨膜蛋白质构象中的变化。例如，每种单体的体积、形状或电荷可以以特有的方式影响电导。同样地，整个聚合物的大小可以通过观察单体依赖性电导变化发生的时间长度(持续时间)进行测定。替代地，聚合物中的单体数目(也是大小的量度)可以根据其作为给定聚合物穿越开口的单体依赖性电导改变的数目的函数来测定。单体数目可能不是确切地对应于电导变化数目，因为当聚合物的每个单体序贯穿过或跨越开口时，可以存在超过一个电导水平变化。然而，可以通过用具有已知序列的聚合物制定标准来测定该两个值之间的比例关系。其他检测方案在本文中描述。
示例性检测组分已在WO 2009/045473、WO 2009/045472、WO 2008/124107、WO2007/084163,WO 06/052882,WO 06/028508,WO 05/061373,WO 04/077503,WO 03/003446、WO 03/000920,WO 01/42782,WO 00/28312 和 WO 00/79257 中描述，其各自通过引用合并进入本文，并且可以包括但不限于与开口处或附近的结构直接结合的电极，和置于顺和反池内的电极。电极可以能够例如检测跨越或穿过孔或开口的两个池之间或平面电流例如电子隧道电流内的离子电流差异。如上所述，框架可以设置为在石墨烯的一个或两个面上产生不连续室，并且每个室可以包括电极。在这个实施方案中，可以分开测量设置在阵列中的个别开口的电学性质例如电导，允许同时检测与众多聚合物或跨膜蛋白质相关的活性。
开口的时间依赖性性质可以通过任何合适的技术进行测量。性质可以是在测定中使用的介质、液体中的溶质(例如离子)、聚合物(例如单体的化学结构)、或聚合物上的标记的函数。示例性转运性质包括电流、电导、电阻、电容、电荷、浓度、光学性质(例如荧光和拉曼散射)和化学结构。
期望地，转运性质是电流。用于检测含开口系统中的电流的合适方法是本领域已知的，例如如美国专利号 6，746，594,6, 673，615,6, 627，067,6, 464，842,6, 362，002、6，267，872,6, 015，714 和 5，795，782 以及美国公开号 2004/0121525,2003/0104428 和2003/0104428中所述的，其各自通过引用合并进入本文。在另一个实施方案中，转运性质是跨越开口的电子流，其可以通过设置于邻近或邻接开口边界的电极进行监控。
适合在本发明的装置和方法中使用的检测化合物与孔蛋白的相互作用的另外方法在Bayley和Cremer, Nature 413:226-229 (2001)中概述,其在此通过引用合并进入本文。
介质 设置在石墨烯的任一侧上的区室中的介质可以是允许足够的底物相互作用(例如多核苷酸迁移率(mobility))的任何流体。一般地，介质是液体，通常为聚合物或化合物可以在其中分布的水溶液或其他液体或溶液。当使用导电介质时，它可以是能够携带电学电流的任何介质。这样的溶液一般含有离子作为导电剂(例如钠、钾、氯化物、钙、镁、铯、钡、硫酸盐或磷酸盐)。跨越或穿过开口的电导可以通过测量经由导电介质跨越或穿过开口的流动电流进行测定。替代地，可以通过两个池的介质的离子组成中的差异建立电化学梯度，其中在每个池中具有不同离子，或在该些池的溶液或介质中至少一种离子不同浓度。电导变化通过检测系统进行测量。
表征聚合物的方法 一般而言，本发明的特征在于涉及使用介质的两个分开的池和在池之间的界面表征聚合物。在池之间的开口一般能够与其中一个池中存在的聚合物的个别单体残基序贯相互作用。当聚合物的个别单体残基与开口序贯相互作用时，随着时间过去继续测量转运性质，获得适合于测定聚合物的单体依赖性特征的数据。通过测序达到的单体依赖性表征可以包括鉴定特征例如但不限于以序贯次序构成每个个别聚合物的单体的数目和组成。
待表征的聚合物可以保留在其最初的池中，或者它或包括其或其片段的反应产物可以越过孔进入另一个池内。在任一情况下，聚合物相对于孔移动，并且个别单体与孔序贯相互作用，引起测量的转运性质例如孔的电导变化。当聚合物不越过装置的反侧内时，它保持邻近孔，以致使得它的单体与孔通道相互作用且造成转运性质中的变化，其指示聚合物特征。
聚合物可以在或不在分子马达的帮助下被驱动穿过孔。速率通过使用至少对于在表征过程中的部分时间以基本上恒定的速率移动聚合物的分子马达进行控制。在不存在分子马达的情况下，可以使用例如电学电流或电压驱动聚合物穿过孔。
鉴定与跨膜蛋白质相互作用的化合物的方法 本发明的双层也可以用于鉴定与膜分子(例如成孔蛋白质或跨膜受体)相互作用的化合物。此处，可以在候选化合物的存在和不存在下测量设置在石墨烯开口内的跨膜蛋白质的性质(例如导电率)。如果化合物的添加改变跨膜蛋白质的性质，那么该化合物被鉴定为与跨膜蛋白质相互作用的化合物。这种方法可以包括使跨膜蛋白质与阳性或阴性对照化合物(例如跨膜受体的已知配体)接触。在这些实施方案中，可以测量在对照化合物的存在下跨膜蛋白质的性质，并且增强或破坏这样的性质的候选化合物可以被鉴定为与跨膜蛋白质相互作用的化合物。
在另一个实施方案中，跨膜蛋白质可以是成孔蛋白质且可以测试候选化合物，以破坏穿过孔的分子流动。穿过孔的分子流动可以使用例如测量穿过或跨越开口的电学电流进行测量。
已知相互作用的化合物也可以用于测量跨膜蛋白质的性质。
此外，本发明的方法可以用于研究化合物与脂质例如糖脂、缀合至其他化合物的脂质或双层中的其他非蛋白质化合物的相互作用。本发明的方法也可以用于研究化合物例如在转染或药物递送中穿过脂质双层或单层(直接穿过脂质层或穿过该层中的孔)的能力。这样的化合物可以是在溶液中游离的或是复合物的部分，例如包囊在微团、小泡或脂质体中。实施例
可以触发脂质体以形成脂质双层膜，其形成跨越石墨烯膜中的开口的高电阻千兆欧姆密封，该石墨烯膜分开两个填充了溶液的室(图5)。
如图2中所示，将0.5 X 0.5 mm CVD生长的石墨烯片固定在硅底物框架上的厚250 nm的自支撑绝缘SiNx层中的200 X 200 nm开口上方。将支片固定的膜插入流体池中，以致使得它分开两个区室，各自随后填充离子溶液(250 mM KCl, 2.5mM TRIS，pH 7.8)与Ag/AgCl电极电接触。随后通过使由支片固定的石墨烯分开的两个室之间的偏压从-100mV扫到+100 mV，测量开口对离子电流流动的电阻。在加入脂质体前，开口电阻是46 ΜΩ，其是石墨烯中的8 nm开口的预期接触电阻(access resistance)。将脂质体加入石墨烯的一侧上的室(未显示)或石墨烯的两侧上的室产生很少作用，直至通过加入2 mM Ca++触发脂质融合。在Ca++添加后数以秒计内观察到增加至720 ΜΩ的电阻，尽管在室温温育四小时进一步使电阻增加至超过3.6 GQ (图6)。其他实施方案
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度与每个独立出版物或专利申请特别且个别指出通过引用并入一样。虽然本发明已结合其具体实施方案进行描述，但应当理解它能够进一步修改，并且本申请预期涵盖本发明的任何变动、用途或适应，其根据一般而言的本发明原理且包括来自本公开内容的背离，所述背离在本发明所属领域内的已知或习惯实践内，且可以应用于上文阐述的基本特征，且在附上的权利要求的范围内。其他实施方案在权利要求中。
权利要求
1.包含在具有一个或多个开口的石墨烯上的人工膜的装置，其中所述人工膜包括两个脂质单层，每个所述脂质单层接触所述石墨烯的一个面，以及其中所述两个脂质单层在所述石墨烯中的所述一个或多个开口内形成脂质双层。
2.权利要求1的装置，其中所述脂质双层进一步包含蛋白质。
3.权利要求2的装置，其中所述蛋白质是跨膜蛋白质。
4.权利要求3的装置，其中所述跨膜蛋白质选自离子通道、多抗药性泵、细胞因子受体、来自免疫球蛋白大家族的受体、来自肿瘤坏死因子受体家族的受体、趋化因子受体、受体酪氨酸激酶和TGFii受体。
5.权利要求1的装置，其进一步包含设置在所述一个或多个开口的至少一个中的至少一个孔，其中至多一个孔被设置在每个所述一个或多个开口中。
6.权利要求5的装置，其进一步包含分子马达，其中所述马达邻近所述一个或多个孔中的至少一个，且能够使聚合物相对于所述一个或多个孔中的至少一个移动。
7.权利要求6的装置，其中所述分子马达包含DNA聚合酶、RNA聚合酶、核糖体、外切核酸酶，或解旋酶并且所述聚合物是多核苷酸。
8.权利要求7的装置，其中该DNA聚合酶选自大肠杆菌(疋coli聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(克列诺夫片段)、噬菌体T7 DNA聚合酶、Ph1-29 DNA聚合酶、水生栖热菌aquaticus) (Taq)DNA 聚合酶、黄栖热菌flavus) (Tfl)DNA 聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus ThermophiIus) (Tth) DNA聚合酶、岸边热球菌(Thermococcuslitoral is.、(Tli) DNA 聚合酶、激烈热火球古菌furiosus) (Pfu) DNA 聚合酶、Vent DNA 聚合酶、嗜热嗜脂肪芽抱杆菌 Cfeci77w5.5tearothermophiIus ) (Bst) DNA聚合酶、AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶、和HIV-1逆转录酶。
9.权利要求7的装置，其中所述RNA聚合酶选自T7RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、和大肠杆菌RNA聚合酶。
10.权利要求7的装置，其中该外切核酸酶选自外切核酸酶λ、T7外切核酸酶、ExoIIKRecJ1外切核酸酶、Exo I和Exo Τ。
11.权利要求7的装置，其中所述解旋酶选自大肠杆菌噬菌体Τ7gp4和Τ4 gp41基因蛋白质、大肠杆菌蛋白 质DnaB、大肠杆菌蛋白质RuvB和大肠杆菌蛋白质rho。
12.权利要求5的装置，其中所述孔中的至少一个是α-溶血素。
13.权利要求1或5的装置，其进一步包含支持所述石墨烯的框架。
14.权利要求13的装置，其进一步包含设置在所述石墨烯的相反侧上的第一电极和第二电极。
15.权利要求13的装置，其中所述框架包含陶瓷或氮化硅。
16.权利要求1或5的装置，其中所述装置包含排列成阵列的多个开口。
17.权利要求16的装置，其进一步包含置于所述石墨烯的一个面上的框架，其中所述框架为每个所述开口形成用于容纳液体的分开的区室。
18.权利要求17的装置，其中所述框架是非传导性的。
19.权利要求17的装置，其中所述框架包含陶瓷或氮化硅。
20.权利要求17的装置，其中每个所述区室进一步包含电极，以及其中所述装置进一步包含在所述石墨烯的与所述区室相反的侧上的至少一个电极。
21.分析靶聚合物的方法，其包括将所述靶聚合物引入权利要求5-20中任一项的装置，允许所述靶聚合物相对于所述孔移动以产生信号，以及监控对应于所述靶聚合物相对于所述孔移动的信号，从而分析所述靶聚合物。
22.权利要求21的方法，其中所述信号监控包括当所述靶聚合物相对于所述孔移动时，测量所述靶聚合物的单体依赖性特征。
23.权利要求22的方法，其中所述单体依赖性性质是所述聚合物中的单体身份或单体数目。
24.权利要求20的方法，其进一步包括在所述信号监控之前、过程中或之后改变所述聚合物的移动速率。
25.鉴定与膜分子相互作用的化合物的方法，其包括使权利要求1-20中任一项的装置的膜分子与化合物接触，以及测量在所述化合物的存在下所述膜分子的至少一种活性，由此在所述化合物的存在下的活性变化指示所述化合物与所述膜分子相互作用。
26.权利要求25的方法，其中施加电场，以及所述测量所述膜分子的至少一种活性包括测量所述膜分子的电阻。
27.权利要求25 的方法，其中所述膜分子是跨膜蛋白质。
全文摘要
本发明的特征在于石墨烯在形成人工脂质膜中的用途，所述石墨烯是键合碳原子的一个原子厚的平面片。本发明的特征还在于这些膜在检测聚合物的性质(例如核酸的序列)以及鉴定与跨膜蛋白质相互作用的化合物中的用途。
文档编号G01N33/487GK103154729SQ201180039035
公开日2013年6月12日 申请日期2011年6月8日 优先权日2010年6月8日
发明者S·加拉, D·布兰顿 申请人:哈佛大学校长及研究员协会