专利名称：稳定溶液的制作方法
技术领域：
本发明涉及血液凝固的领域。更确切地，本发明涉及稳定溶液及其作为凝血分析的对照材料的用途，以及有关凝血分析的方法。
背景技术：
凝血是ー个复杂的过程，通过该过程血液形成凝块。凝血是止血(中止从受损的血管失血)的重要部分，其中受损的血管壁被血小板和包含纤维蛋白的凝块覆盖，以停止流血并且开始受损的血管的修复。凝血的紊乱能够导致流血(出血)或者血液凝结(clotting)(血栓形成)的增加的危险。凝血是遍及生物界高度保守的；在所有哺乳动物中，凝血涉及细胞(血小板)组分和蛋白(凝血因子)组分二者。人类中的所述系统已经被最深入地研究，并且因此是最被 了解的。凝血在血管的损伤已经损坏内皮(血管的内层)之后几乎立即发生，这暴露或释放起始连锁反应(chain reaction)的膜蛋白组织因子。血小板粘附至内皮下的物质例如胶原蛋白和血管性血友病因子，被活化并且随后在损伤的位置形成栓塞(Plug);这被称为初级止血。次级止血同时发生被称为凝血因子或凝结因子(clotting factors/)的血衆中的蛋白质以复杂的级联反应响应，以形成纤维蛋白股(fibrin strands),所述纤维蛋白股強化所述血小板栓塞。图I示出人类中的凝血系统的概况，该图采纳自Rams_m，S的研究论文，2001，LinkopingUniversity Medical Dissertation 776 号(ISBN91-7373-535-3)。次级止血的凝血级联反应具有两个导致纤维蛋白形成的途径，接触活化途径(之前被称作内源性途径)，和组织因子途径(之前被称作外源性途径)。血液凝固的起始的主要途径是组织因子途径。组织因子途径和接触活化途径二者都激活因子X、凝血酶和纤维蛋白的最终关同途径(參见图I)。测试凝血系统大量的试验被用于评价凝血系统的功能，举例来说，aPTT(活化部分凝血活酶时丨、日」，activated partial thromboplastin timeノ、PT(凝血_原时间，prothrombin time,也用于确定INR)、纤维蛋白原测试(可以通过克劳斯法(Clauss method)来进行)、血小板计数、血小板功能测试(通常通过PFA-100)、TCT、流血时间、混合试验(mixing test,如果将患者的血浆与正常的血浆混合，患者的异常是否被修正)、凝血因子分析、抗磷脂抗体、D- ニ聚体、遗传试验(举例来说，因子V Leiden突变，凝血酶原突变G2021 0A)、稀释印度蜂蛇毒时间(dilute Russell' s viper nenom time, dRVVT)、各种血小板功能试验、凝血弾性扫描法(TEG或者Sonoclot)、优球蛋白溶解时间(euglobulin lysis time, ELT)。接触活化途径是通过血浆的接触因子的活化来被起始，并且可以由aPTT试验来測量。组织因子途径是通过暴露于血液或者组织因子或者组织因子(特定的细胞膜蛋白)的释放而被起始，并且可以由PT试验来測量。PT的结果通常被记录为标准化比值，SP国际标准化比值(International Normalised Ratio, INR)的值。疾病和测试取决于病理学的本质，凝血系统中的紊乱可以倾向于出血、血栓形成以及偶尔地为出血和血栓形成二者。因此，对精确的测试和测量的需要是被充分理解的，并且对凝血系统的评价中适当的对照材料的需要是显然的。同样，监护人员(care taking staff)对对照材料的适当的操作是重要的。在大多数情况下，就地(point of care)的凝血试验要么由患者自己进行，要么由医院的员エ进行，其中两组人员都没有在实验室技能方面被适当地训练。当前的对照材料主要是基于包括作为缓冲和作为螯合剂的柠檬酸盐缓冲液的冷冻干燥的血浆。所述冷冻干燥的血浆需要在临使用之前被稀释，并且需要加入钙以恢复所述冷冻干燥的血浆的凝血能力。因此，重构的溶液是短寿命的，并且应该被在4小时内使用，以保持高质量。进ー步地，由使用者(员エ或者患者)通过不慎延长使用之前的时间或者通过不正确的稀释对对照样品的不适当的操作是已意识到的问题，该问题将会影响分析的结果和随后基于所述结果的药物治疗。 因此，存在为凝血分析提供更稳定并且更可靠的对照的迫切需要，特别是在被分析的材料是新鲜的、天然的人类血液(即在分析之前不进行添加)的情况下的试验，以除去归因于可能的稀释错误或者过期的对照样品，在评价患者中的凝血系统的状态时的潜在的变化和不可靠的結果。因此，本发明满足了该需要和利益。

发明内容
本发明的ー个方面提供包括分离的血浆的稳定溶液，并且其中所述分离的血浆是被耗竭凝血因子XII的。进ー步的实施方案是其中凝血因子XII的耗竭是95% -100%。进ー步的实施方案是其中凝血因子XII的耗竭是100%或者接近100%。进ー步的实施方案是其中所述稳定溶液的条件是所述溶液不包括任何钙螯合剤。进ー步的实施方案是其中所述溶液包括生理量或者生理量以上的I丐。进ー步的实施方案是其中所述血浆是被耗竭血小板的。进ー步的实施方案是其中所述溶液在2-8°C或者在室温(RT)稳定> 4小吋。进ー步的实施方案是其中所述稳定溶液在2_8°C或者在室温稳定至少I周，例如I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或者甚至更长时间。本发明的进ー步的方面是根据本发明的稳定溶液作为凝血分析的对照材料的用途。本发明更进ー步的方面是产生稳定溶液的方法，所述方法包括以下步骤a)分离血浆；b)耗竭所述血浆的因子XII ；c)任选地，冻干分离的并且耗竭因子XII的所述溶液。本发明更进ー步的方面是可通过本文公开的方法获得的根据本发明的稳定溶液。本发明更进ー步的方面是评价受治疗者中的凝血系统状态的方法，所述方法包括以下步骤
a)提供根据本发明的稳定溶液，b)提供来自受治疗者的血液样品，c)測量所述受治疗者的凝血系统的状态，d)分析所述患者的凝血系统的状态，e)将所述受治疗者的凝血状态与阳性和/或阴性标准比较，从而评价所述患者中的凝血系统状态。阳性和/或阴性标准形成參照点，并且，如果合适，可以标绘为标准曲线。标准曲线和每个分别的參照点可以通过测量单独的參照点来制成，该单独的參照点由无因子XII (即经耗竭的血浆或者来自因子XII缺陷的受治疗者的血浆)、但具有所有其他补体因子存在的血浆，和汇合的包含因子XII的正常血浆的混合物构成。缺陷血浆和正常血浆以 不同比例混合，以形成不同的參照点。当被测量时，该參照点可以被以图表描绘以形成标准曲线。进ー步的实施方案是其中所述受治疗者是人类受治疗者。更进ー步的实施方案是其中所述方法还包括其中来自受治疗者的血液样品在测量和分析凝血系统的状态之前与根据本发明的稳定溶液混合。本发明更进ー步的方面涵盖包括根据本发明的稳定溶液的试剂盒。附图
简述
图I示出人类中的凝血系统的概况(采纳自Ramstrdm，s的研究论文，2001，Linkopillp. University Medical Dissertation 776 号(ISBN91-7373-535-3))。次级止血的凝血级联反应具有两个导致纤维蛋白形成的途径，接触活化途径(之前被称作内源性途径)，和组织因子途径(之前被称作外源性途径)。血液凝固的起始的主要途径是组织因子途径。组织因子途径和接触活化途径二者都活化因子X、凝血酶和纤维蛋白的最終关同途径。图2示出在高岭土处理的(条纹的)和ニ氧化钛(纯黑)处理的血浆中，因子XII在第0天、第I天、第2天和第4天的活性。结果以底物裂解率计算。图3示出0、1、2和4天之后的凝血酶生成，其被计算为以平均值+SD呈现的内源性凝血酶潜能(ETP)。数据代表分别与ニ氧化钛一起孵育5分钟(条纹的)和60分钟(纯黑)，以及与高岭土一起孵育5分钟(白色具黒点)和60分钟(黒色具白点)。图4示出使用来自4个不同供体的血浆在材料表面的凝血时间。数据以凝血时间的平均值+SD呈现，所述凝血时间是在Fe、Al、Ti和玻璃的表面測量。所述材料或者被直接测量(纯黑)或者在添加柠檬酸盐的(citrated)血浆中孵育60分钟随后被以HEPES冲洗之后測量(条纹的)。详述定义如本文所使用的，涉及溶液或组合物的“稳定的”意指所述溶液或组合物不易分解或者从ー种物质状态改变为另ー种物质状态，并且不经历自发的改变。如本文所使用的，“冻干(Iyophilization) ”、“冷冻干燥(freeze-drying) ”或者“冷冻忙存(cryopreservation) ”意指典型地用于保存易腐烂材料或者使所述材料运输更方便的脱水过程。冻干通过冷冻所述材料并且然后降低周围的压カ以及添加足够的热量以允许材料中的结冰水直接从固相升华为气体来起作用。如本文所使用的，“受治疗者”意为包括人类的患有或者被怀疑患有疾病的任何哺乳动物。如本文所使用的“受治疗者”表示哺乳动物，例如啮齿动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物。优选地，根据本发明的受治疗者是人类。如本文所使用的，“至少ー种”意为ー种或更多种，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等。如本文所使用的，“检测(detection)”、“检测(detect) ”、“检测(detecting) ”包括參照或不參照対照的定性的和/或定量的检测(測量水平)，并且还指给定的血液凝结过程的存在、不存在或者量的鉴定。如本文所使用的，単数形式“一 (a) ”、“一 (an) ”和“所述(the) ”包括复数指代对象，除非上下文明确指示为相反的。因此，举例来说，提及“抗体(an antibody)”则包括复 数个这样的抗体。如本文所使用的，“耗竭(cbpletion) ”意指部分地或者完全地除去所述组分或因子，或者以任何其他方式使所述组分或因子部分地或者完全地失去活性，举例来说，通过添加所述因子的抑制剂，这直接地或者间接地使所述因子或组分失去活性。类似地，“经耗竭的溶液”完全地或者部分地不存在某种因子或组分。如本文所使用的，“经耗竭的溶液”也包括因子或组分的部分的或者完全的功能性耗竭或失活。该功能性耗竭或失活可以直接地或者间接地通过例如抑制剂的添加。如本文所使用的，“灵敏性”在其应用于血液凝结的方法或分析的上下文中使用，指正确地鉴定为其本身的情况的全部受治疗者的比例。如本文所使用的，“治疗”被定义为通过内科的或外科的手段对患者的处置。所述治疗改善或减轻医学状况或疾病的至少ー个症状，并且被要求提供治愈。如本文所使用的，术语“治疗結果”或“治疗的結果”是所述治疗对患者身体上的影响。如本文所使用的，术语“算法”指提供两个或更多个数量之间的关系的数学公式。这样的公式可以是线性的或者非线性的，并且可以以各种数值的权重因子的形式存在于计算机内存中。如本文所使用的，“单克隆抗体”或者“ mAb ”指具有单ー氨基酸组成的抗体，所述抗体是针对特定抗原的，并且是由B细胞或杂交瘤的单克隆产生的。如本文所使用的，“多克隆抗体”指来源于不同的B细胞系的针对特定抗原的抗体。如本文所使用的，“ Fab”指在通过用ー种蛋白酶即木瓜蛋白酶处理IgG获得的片段之中，具有约50，OOODa的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中，约一半的H链N端侧和完整的L链是通过ニ硫键结合在一起的。如本文所使用的，“F(ab’)2”指在通过用ー种蛋白酶即胃蛋白酶处理IgG获得的片段之中，具有约100，OOODa的分子量和抗原结合活性的抗体片段，所述抗体片段通过铰链区的ニ硫键结合，稍大于Fab。如本文所使用的，“Fab””指具有约50，OOODa的分子量和抗原结合活性的抗体片段，所述抗体片段通过切割F(ab’ )2的铰链区的ニ硫键获得。如本文所使用的,单链Fv( “scFv”)多肽是共价连接的VH: :VL异ニ聚体,所述异ニ聚体通常表达自包括通过肽编码接头连接的VH和VL编码基因的融合基因。本发明的人类scFv片段包括保持恰当的构象的CDR，优选通过使用基因重组技木。
如本文所使用的，“杂交瘤”表示通过将用抗原免疫非人类哺乳动物制备的B细胞经受与来源于小鼠等等的骨髄瘤细胞的细胞融合获得的细胞，其产生具有抗原特异性的期望的单克隆抗体。如以上所掲示的，本发明提供稳定的对照样品溶液。根据本发明的溶液与本领域可获得的溶液相比是更加稳定的。进ー步地，根据本发明的稳定的对照样品溶液在2-8°C是液体，在2-8°C和甚至在更高的温度例如室温(即大约23°C )具有良好的稳定性，并且随时可用(ready to use)。因此，不要求或需要额外的稀释步骤，举例来说，稀释为确切体积的液体，从而降低和/或消除了由于稀释和人工操作的误差。进ー步地，使用时不需要添加额外的钙离子至根据本发明的稳定的对照样品溶液。更进一歩地，根据本发明的所述稳定的对照溶液在室温也是稳定的。举例来说，室温中的稳定性是> 4小时,例如5小时、10小时、20小时、I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天即I周、2周或甚至更长，例如I个月、2个月、3个月、4个月、5个月或甚至6个月或一年的室温。在2-8 0C，例如，举例来说，在2 °C或者4 °C，稳定性甚至是更长的，例如6个月，7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或者甚至 24 个月。因此，在本发明的ー个方面，提供包括分离的血浆的稳定溶液，并且其中所述分离的血浆是被耗竭凝血因子XII的。所述稳定溶液包括生理量或者生理量以上的钙。进ー步地，所述稳定溶液在2-8°C或者室温稳定至少4小时，例如5小时、10小时、10小时、20小时、I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天即I周、或甚至2周或甚至更长,甚至更长例如I个月、2个月、3个月、4个月、5个月或甚至6个月或一年的室温。在2-8°C，例如，举例来说，在2°C或者4°C，稳定性甚至是更长的，例如6个月，7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或者甚至24个月。因此，所述包括分离的血浆并且其中所述分离的血浆是被耗竭凝血因子XII的稳定溶液，条件是使用时不添加额外的钙，并且进一歩地，所述稳定溶液在2-8°C或者在室温稳定> 4小吋。凝血因子XII的耗竭可以根据本领域中已知的技术来进行。ー个方法是使用因子XII的免疫吸附。另一方法是使用因子XII的抗体利用免疫亲和层析(參见，举例来 说，Current Protocols in Immunology, ISBN 1934-3671,第 8 章，第 8. 2 单兀，2007, JohnWiley and Sons, Inc)从血衆免疫耗竭因子 XII,如 Braat 等人(Eur. J. Biochemistry,1999，263 =904-911)描述的。能够特异地结合至因子XII的抗体可以根据本领域已知的技术来产生。因子XII的抗体的例子在W089/11865中给出。测量纯化之后残留的因子XII的量的分析在以下给出，并且在，举例来说，Jones等人(Blood Coagul Fibrinolysis, 1998,9 (2) :183-7)、Stiirzebecher，J.等人(ThrombRes.，1989，55 (6) :709-15)中，以及在 Tankerslay 等人(Blood, 1983,62 :488-456)中给出。针对因子XII的定量的合适的分析的例子是不同的免疫分析，例如，举例来说，ELISA(酶联免疫吸附測定)分析。ELISA利用至少ー种特异地结合至因子XII的抗体。人类因子VII的抗体是从商业来源可获得的，所述商业来源例如，举例来说，Abeam、AbDberotech、Thermo Scientific、Pierce Antibodies、Acris Antibodies GmbH、AgriSera、AMERICAN DIAGN0STICA等。鉴定并且甚至定量蛋白例如因子XII的免疫分析，例如ELISA分析，在本领域是众所周知的，并且在举例来说，在由Harlow,E和Lane,D所著的Antibodies A laboratory Manual,第 14章，(Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,1988中描述。简言之，在经耗竭的血浆中的因子XII的活性可以进一歩地通过添加已知被耗竭因子XII(FXII-对照血浆)但包括凝血的所有其他相关的因子的血浆来测量。当钙被添加，凝血开始。凝结时间(clotting time)可以通过池度的变化例如在671nm的变化来测量。如本文所使用的，“特异地与......反应”意图等同干“能够选择性地结合”或“特
异地与......结合”。如本文所使用的，该表达方式意指抗体或抗原结合片段，或其变体、融
合体或衍生物，包括任何抗体来源的结合部分(binding moiety),能够结合至分子的抗原，并且进一歩地，比与其他蛋白的结合至少10倍更强地结合至因子XII，举例来说，至少50倍更强地或至少100倍更强地。所述结合部分可以是在生理条件下(举例来说，体内)能够 选择性地结合至蛋白。測量相对结合強度的合适方法包括免疫分析，举例来说，当所述结合部分是抗体时(參见 Harlow&Lamp ;Lane, " Antibodies A Laboratory" , Cold SpringHabor Laboratory Press, New York,该书通过引用被并入本文)。可替换地，结合可以使用竞争分析或使用Biacore 分析(Biacore International AB,瑞典)评价。将在免疫耗竭方法或者免疫亲和层析法中使用的特异地结合至因子XII的抗体可以是完整的抗体或其片段，举例来说，抗原结合片段，或其变体、融合体或衍生物，只要其能够在体外结合至期望的蛋白。这样的结合特异性可以通过本领域众所周知的方法来确定，例如，举例来说，ELISA、免疫组织化学法、免疫沉淀法、蛋白印迹法、色谱分析法和使用表达全部亚基或其异ニ聚体的被转染的细胞的流式细胞术(參见实施例)。如何測量抗体的特异性的例子在，举例来说，Harlow&Lane, " Antibodies A Laboratory" ,Cold SpringHabor Laboratory Press, New York中给出，该书通过引用被并入本文。“抗体”包括任何物种，例如啮齿类动物例如小鼠、大鼠、豚鼠或者非啮齿类动物例如兔、山羊、绵羊、狗、猪、骆驼、单峰骆驼、驴、马或鸡的大体上完整的抗体分子，以及嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体(其中与天然存在的人类抗体相比至少ー个氨基酸是突变的)、单链抗体、双特异性抗体、抗体的重链、抗体的轻链、抗体的重和/或轻链的同ニ聚体和异ニ聚体，以及其抗原结合片段及衍生物。举例来说，该抗体可以是单克隆抗体。抗原特异性是由可变域赋予的，并且不依赖于恒定域，如从涉及都包含一个或更多个可变域的抗体片段的细菌表达实验获知的。这些分子包括类Fab分子(Better等人(1988)，Science 240,1041) ;Fv 分子(Skerra 等人(1988)，Science 240，1038);单链Fv(ScFv)分子，其中VH和VL伴侣域(partner domain)通过柔性的寡肽连接(Bird等人(1988)，Science242，423 ；Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85，5879)，和包括分离的V域的单域抗体(dAb) (Ward等人(1989), Nature 341,544)。涉及合成保留其特异的结合位点的抗体片段的技术的综述在Winter和Milstein (1991)，Nature 349，293-299中找到。因此，“抗原结合片段”意为抗体的功能性片段，所述功能性片段能够特异地结合至因子XII (举例来说，Fab片段、Fab’片段和F (ab) 2片段)、单抗体链(举例来说，重链或轻链)、单可变域(举例来说，VH和VL域)和域抗体(domain antibody, dAb,包括单域抗体和双域抗体形式；即，dAb-接头-dAb)。术语“抗体”也包括全部类别的抗体，包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。然而，在一个实施方案中，所述抗体是IgG分子，例如IgGl、IgGl, IgG3或IgG4分子。产生抗体和抗体片段的方法是本领域众所周知的。举例来说，抗体可以通过以下几种方法的任一种来产生，所述方法采用抗体分子的体内生产的诱导，筛选免疫球蛋白库(Orlandi 等人，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.第 86 卷，第 3833-3837 页；ffinter 等人，1991，Nature 349 :293_299，以上通过引用被并入本文)，或者由培养的细胞系产生单克隆抗体分子。这些方法包括但不限干，杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术和EB病毒(EBV)-杂交瘤技术(參见 Kohler 等人，1975，Nature 256 :4950497 ；Kozbor 等人，1985，JTmmun01. Methods 81 :3ト42 ；Cote 等人，1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 :2026-2030 ；Cole等人，1984，Mol Cell. Biol. 62 :109-120,以上通过引用被并入本文)。抗体可以通过免疫法来进行，在所述免疫法中完整蛋白或其合适的片段可以被注射至非人类的哺乳动物(如小鼠或免)中，接着是加强注射，以产生抗体反应。可从被免疫的动物分离的血清分离其中含有的多克隆抗体，或者来自被免疫动物的脾脏可以被用于产生杂交瘤和单克隆抗体。 在一个示例中，一种蛋白质的单克隆抗体可以根据Kohler和Milstein(Nature,256 =495,1975)的经典方法或其衍生方法从小鼠杂交瘤来制备。简单地说，小鼠(例如Balb/c)在几周的时间内被重复地接种几微克选定的蛋白或其肽片段，或其合适的载体缀合物。然后将小鼠处死，并且分离脾脏的抗体产生细胞。该脾脏细胞通过聚こニ醇与小鼠骨髓瘤细胞融合，并且过量的未融合细胞通过将该体系在包含氨基喋呤的选择性培养基(HAT培养基)上生长而被毁灭。成功融合的细胞被稀释，并且稀释物的各等份(aliquotes)被放置在微量滴定板的多个孔中，在所述微量滴定板的多个孔中培养物继续生长。抗体产生克隆是通过用免疫分析程序和其衍生方法在孔的上清液中检测抗体而鉴定的，所述免疫分析程序例如ELISA,如最初由Engvall描述的(Enzymol. ,70 :419,1980)。可以扩增选定的阳性克隆，并且收获其单克隆抗体产物以备使用。抗体可以在使用前被纯化。抗体的纯化是使用本领域可获得的、并且在如"Monoclonal Antibodies A manual of techniques" , H Zola(CRC Press, 1988)中和在"Monoclonal Hybridoma Antibodies !Techniques and Applications " ,JGRHurrell (CRC Press, 1982)中描述的技术来进行，以上书籍通过引用被并入本文。抗体或其抗原结合片段或衍生物也可以通过重组的方式生产。选定的抗原和蛋白的合适的单克隆抗体可以由已知的技术制备，如在由"Monoclonal Antibodies A manual of techniques" , H Zola (CRC Press, 1988)中和在"Monoclonal HybridomaAntibodies !Techniques and Applications" , J GR Hurrell (CRC Press,1982)中，和在"Antibodies A Laboratory Manual" , Cold Spring Harbor Laboratory,New York 中所公开的那些技木，以上书籍通过引用被并入本文。抗体片段也可以使用本领域众所周知的方法来获得(參见，举例来说，HarloW和Lane,1988, " Antibodies A Laboratory Manual" , Cold Spring Harbor Laboratory,New York，该书通过引用被并入本文)。举例来说，抗体片段可以通过抗体的蛋白酶水解，或者通过在大肠杆菌中或哺乳动物的细胞(举例来说，中国仓鼠卵巢细胞培养物或其他蛋白表达系统)中表达编码该片段的DNA来制备。
可替换地，抗体片段可以以常规方法通过胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶消化完整抗体获得。因此，凝血因子XII的耗竭可以是与血液刚被从患者采出时的原始水平相比的95% -100%，举例来说，95%、96%、97%、98%、99%、99. 9%0相应地，根据本发明的溶液的进ー步的实施方案是其中凝血因子XII的耗竭是95% -100%，举例来说，95%、96%、97%、98%、99%、99. 9%0除了凝血因子XII的耗竭，接触活化系统的至少ー种另外的凝血因子可以被耗竭。另外的凝血因子的例子是因子XI、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK，又被称为Williams-Fitzgerald-Flaujeac 因子或 Fitzgerald 因子或 HMWK 激妝释放酶因子)。 因此，本发明所述的溶液的进ー步的实施方案是其中除了凝血因子XII，接触活化系统的至少ー种另外的凝血因子是被耗竭的。在根据本发明所述的溶液的一个进ー步的实施方案中，除了因子XII，因子XI是被耗竭的。因子XII和因子XI的每ー种的耗竭可以是以相同的水平，举例来说，约95% -100%，然而数值不相同。这意味着，举例来说，因子XII可以被耗竭至约99%，而因子XI可以被耗竭约96%，或者相反，即在所述范围内但具有在所述范围内的不同数值。当然，所述数值也可以是相同的。如果两种或更多种因子被耗竭，应理解不是所有的因子都需要被完全地耗竭，而是可以残留痕量的每种因子。举例来说，如果因子XII和因子VI 二者都被耗竭，它们可以二者都被耗竭约95% -96%，并且仍提供根据本发明的非常稳定的溶液。因此，在所述溶液的更进ー步的实施方案中，因子XII和因子XI各自被耗竭约95% -100%，举例来说，各自分别地约 95%,96%,97%,98%,99%,99. 9%0本发明所述的稳定溶液的更进ー步的实施方案是其中凝血因子XII的耗竭是100%，如通过，举例来说，最初由Engvall (Enzymol. ,70 =419,1980)描述的ELISA及其衍生的方法来测量的。除了本文中提到的定量測量以外，因子XII的量也可以被测量为活性量或者耗竭之后剰余的活性量。凝血因子XII的活性可以通过反映因子XII的活性的任何凝血因子分析来測量，例如本文描述的那些或者凝血分析领域技术人员已知的任何其他分析。最常见的分析是使用FXII缺陷型血浆的基于APTT的方法，举例来说，针对ACL Top (米兰，意大利)的IL方法。也存在使用显色底物的方法(參见，举例来说，Practical applicationof a chromogenic FXIIa assay. Zhuo R, Vogler EA.Biomaterials. 20060ct ；27 (28)4840—5 ；An automated chromogenic peptide substrate assay forcoagulation factorXII.Jones D ff, Gallimore MJ, Winter M. Blood Coagul Fibrinolysis,1998Mar ；9 (2)183-7)。相应地，本发明所述的溶液的进ー步的实施方案是其中凝血因子XII的活性是零(0)或接近零。除了耗竭以外，因子XII的零活性可以通过加入因子XII抑制剂来实现。这样的因子XII抑制剂可以是直接抑制剂或间接抑制剂。直接抑制剂直接作用于因子XII。间接因子XII抑制剂抑制如图I中所示的因子XII-级联反应。合适的直接或间接因子XII抑制剂的例子为玉米胰蛋白酶抑制剂(因子XII的直接抑制剂)。因此，如上所述，根据本发明的稳定溶液从而是稳定的溶液，其中由于因子XII的耗竭或失活，内部正常运作的凝血级联反应是无功能的或者功能紊乱的。致使正常运作的凝血级联反应不运作的方法可以是通过，举例来说，凝血因子XII的耗竭，或者通过如本文所描述的直接或间接的抑制。致使正常运作的凝血级联反应不运作的再进一步的方法是通过添加直接地或间接地作用于因子XII的抑制剂，举例来说，例如本文提及的，或其他在本领域已知的，或者通过添加可以直接地或间接地作用以阻滞因子XII的活性的抗体。正常的凝血级联反应也可以由于遗传缺陷而不运作。然而，因为该情况是罕见的，完全FXII缺陷少于1/10，000并且FXI缺陷更加罕见，从这样的供体无限制的取得或者大量的分离血浆是不方便的。因此，本发明的溶液的进一步的实施方案是其中根据本发明的稳定溶液是耗竭因子XII的，或者以如本文所描述的任何其他方式具有不运作、或者功能紊乱、或者失去功能 的凝血级联反应。所述不运作、或者功能紊乱、或者失去功能的凝血级联反应是通过与正常的、健康的受治疗者中的凝血级联反应相比较来鉴定的。用于评价正常的凝血级联反应的合适的分析是如本文所举例说明的，或者由本领域已知的凝血分析以任何其他方式评价(参见，举例来说，“Klinisk Biokemi i Norden，，，特别期刊 2008 :Coagulation. EdsStrandberg K, Hillarp A. Laboratory techniques in thrombosis-a manual, ACAT 分析程序的第二次修订版· Eds Jespersen J, Bertina RM, Haverkate F. Kluwer AcademicPublishers 2000)。因而，如本文所使用的，耗竭因子XII或者因子XII的耗竭，除了因子XII本身的耗竭以外，还涵盖通过直接或间接的手段耗竭因子XII的活性。用于因子XII活性的耗竭的直接或间接的手段的例子是，举例来说，通过添加直接或间接作用的因子XII抑制剂，或者通过添加特异地与因子XII或与如本文所描述的在凝血级联反应中在与因子XII相同的下游级联反应中作用的任何其他因子(参见图I)结合的抗体。在与因子XII相同的下游级联反应中作用的其他因子的例子为因子XI或前激肽释放酶、高分子量激肽原。另外的因子在图I中给出。对于适用于Coaguchek仪器和类似仪器的凝血分析，因子FX和下游因子不能被除去。如本文所描述的，本发明所述的因子XII被耗竭或被失活的稳定溶液是具有从约0.5mole/L及以上的钙水平(例如钙的生理水平或以上)的稳定溶液。因为大多数血液是伴随钙螯合剂被采出的，钙水平需要与因子XII的耗竭和/或失活共同地(优选之后)被立即调整以避免凝血。然后所述溶液将在室温和2-8°C保持稳定> 4小时。通常，当血液被采出时，并且特别是当为了后续的凝血分析而被采出时，钙螯合剂即螯合剂或化合物被过量地添加，通常是柠檬酸盐。举例来说，对于柠檬酸盐，如果以IOmmoI/L的最终浓度被添加到具有I. 3mmol/L的生理水平的钙浓度的采出的血液或血浆中，游离钙的最终浓度将会很低(如果有的话)(参见，举例来说，Rilby等人，ClinicalChemistry,45 8, pgll76_1180，特别是图 I)。进一步的实施方案是，其中没有额外的钙被添加到根据本发明的稳定溶液。当所采的血是来自具有凝血因子XII活性或表达的遗传缺陷的患者时，可以是这种情况。因此，针对因子XII或本文所提及的任何其他因子缺陷的患者或血液供体，不需要添加钙螯合剂至所述经耗竭的血液及其随后分离的血浆，并且钙水平将保持为生理水平并且溶液稳定。
因此，相应地，根据本发明的溶液的实施方案是其中如本文所描述的所述稳定溶液的条件是所述溶液不包括任何钙螯合剂。然而，通常，用于凝血分析的对照材料是基于血细胞血浆的抗凝血液(即，在采血后添加了螯合剂)，并且其中血 小板被进一步除去。为了除去全部血小板及其碎片，血小板的除去可以通过离心随后滤过孔径为O. 25 μ m的过滤器(MiniSart , Sartorius,德国)来进行。通常，在本领域被添加至对照材料的抗凝血剂是钙螯合物质，例如，举例来说，柠檬酸盐或异柠檬酸盐。本发明的稳定溶液也是这种情况。通常，所述抗凝血剂例如螯合剂如柠檬酸盐以1/lOv/v的约O. 105mol/L至O. 13mol/L的浓度(如果使用柠檬酸盐)被添力口。如果使用异柠檬酸盐，可以使用稍高的浓度，例如，举例来说，O. 3mol/l。因此，在正常情况中，当在制备本发明的稳定溶液时添加抗凝血剂或螯合剂时，钙水平需要如本文所描述的被调整至生理水平或生理水平以上使其稳定。因此，要使所述溶液稳定，在制备所述稳定溶液时钙水平必须是生理水平或以上。然而，在使用该溶液时，从而没有添加钙或者其他因子的进一步需要，如同用于凝血分析的所有已知对照材料的情况那样。相应地，所述稳定溶液将对于作为患者本人或患者的日间护理人员的最终使用者更容易执行。在使用时更少的操作、稀释以及额外的添加将使已知由于对现存的凝血对照材料的该额外操作而存在的误差最小化，并且将给出所述患者的正确得多的凝血值。相应地，更加正确的凝血值本身将为患者提供更精确的护理和药物。通常，因子XII然后通过免疫吸附法(免疫亲和层析)被除去，所述免疫吸附法可以被重复。同样，接触活化系统的其他组分也可以通过免疫吸附法被除去，举例来说，凝血因子XI(在如W02008/081025中所描述的)、因子X (在如W095/01571中所描述的)或前激肽释放酶(W02004/047859)。同样，稳定性可以通过(从血细胞)除去所有含磷脂的细胞膜来改进。作为另一选择，可以使用来自因子XII缺陷的供体的血液。然而，其供血量是十分有限的。因子XII缺陷型血浆的纯化可以以静脉穿刺方式从具遗传性因子XII缺陷的供体收集血液来进行。根据本发明的一个方面，本文描述的稳定溶液包括> O. 5mol/L的游离钙，例如生理量的钙或甚至生理量以上的钙。离子钙的生理量是约I. 17-1. 29mM(NORIP)。因此，进一步的实施方案是其中离子钙的量是约 O. 5,0. 75、1、1. 1,1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9、2、5、10、15或甚至是20mM。因此，在本发明的稳定溶液中，钙水平可以是约O. 1-0. 5 μ M或以上。在任何情况下，本发明的稳定溶液不具有O. 5mmol/L或以下的钙水平。相应地，进一步的实施方案涵盖了其中钙水平是至少不低于生理水平或者生理水平以上。在添加柠檬酸盐的血浆中，所述血浆是从具有常规添加的1/10体积的O. 11或
O.13mol/L的柠檬酸盐作为抗凝血剂的血液中制备，由于柠檬酸盐与离子钙形成I : I的复合物，游离钙的终浓度是极低的。由于生理水平是l-2mmol/L，当血液被从受治疗者采集时，以大量过量添加柠檬酸盐。离子钙的浓度已被报导为约1.25mmol/L(参见，举例来说，Laurells Klinisk kemi. Ed Nilsson-Ehle P.Studentlitteratur 2003,和 Brown EM 和MacLeod J， Extracellular calcium sensing and extracellular calcium signalling，Physiol Rev2001 ；81 :239-97 ；以及 Larsson L 和 Magnusson P，Ionized calcium orcorrected total calcium J Bone Miner Res 2003 ；18 :1554-5)。根据本发明的稳定溶液的进一步的实施方案是其中所述稳定溶液的血浆是耗竭血小板的。血小板的除去可以如上文所描述的，即，为了除去全部血小板及其碎片，通过离心随后滤过孔径为O. 25μ 的过滤器(MiniSart , Sartorius,德国)来进行。进一步的实施方案是其中稳定溶液还包括分离的和冲洗过的红细胞。红细胞可以通过从健康的供体以标准静脉穿刺法收集血液来分离。重要的是制备时添加冲洗过的红细胞以除去所有可能存在的因子XII。进一步地，应该除去尽量多的白细胞和血小板。通常，首先通过离心制造血小板富集的血浆，和然后接着除去血浆(包括血小板)和血沉棕黄层来进行。血沉棕黄层是经抗凝处理的血液样品在约SOOxg离心约20分钟之后含有大多数白血球和血小板的部分。离心后，透明液体(血浆)层、包含大多数红血球(红细胞)的红色液体层和在二者之间的薄层可以被分辨，该薄层构成少于I %的血液样品总体积，所述血沉棕黄层具有大多数的白血球和血小板。
添加至本发明的稳定溶液的冲洗过的红细胞的量主要是为了使可被用作凝血分析(检验)的对照材料的所述稳定溶液与血液更相似，因为血液是将被检验的样品。如果不添加冲洗过的红细胞，本发明的稳定溶液实质上将不同于来自患者的被检测的血液，并且从而校准和系数(factor)的添加需要通过算法来进行。这在本领域是已知的，并且以不同的分析进行，所述分析例如，举例来说，Roche的仪器(CoaguCheck XS系统、CoaguCheck XSPlus系统和CoaguCheck XS Pro系统)。由系数重新计算(举例来说，通过代码芯片)的其他例子也是方便的，并且对于例如Coagucheck XS系统(参见例如www. rochediagnostics.se/content/se/coaRUcheck/coaRuChekXS. html)、ProTime Microcoagulation 系统www. protimesystem. com 和 Abbott i-STAT 系统(参见例如 ffffff. abbottpointofcare. com)是已知的。因此，一个实施方案是其中冲洗过的红细胞被添加至本发明的稳定溶液。添加至本发明的稳定溶液的所述冲洗过的红细胞是以等同于血液中正常的红细胞的量的量，即，全血的约 45%，例如 40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%或甚至约50%。在进一步的实施方案中，如果红细胞被添加至本发明的稳定溶液，红细胞的量是约1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%或甚至约 60%。因此，根据本发明的稳定溶液可以进一步包括红细胞，以与新鲜的血液样品相似，并且从而在进行血液凝固分析(检验)时，不需要通过例如代码芯片上的算法或者仅归因于血浆和血液之间的差异的重新计算来进一步重新计算或校准分析的结果或数据。根据本发明的稳定溶液在2_8°C稳定>4小时或甚至在室温稳定>4小时，所述在室温稳定> 4小时当然是要求更高的。本发明的稳定溶液比本领域已知的溶液更加稳定，所述本领域已知的溶液通常需要在重构的4小时之内使用。本发明的稳定溶液不需要这样。在进一步的实施方案中，根据本发明的稳定溶液在室温或者在2-8°C稳定至少I周，例如I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或者甚至更长时间，如本文所描述和进一步举例说明的。本发明的稳定溶液在室温也稳定> 4小时，例如5、6、7、8、9、10小时，或者甚至13、14、15、16、17、18、19、20 或者甚至 24 小时，即，多于 I 天、2 天、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或者2周，3、4、5、6、7、8、9、10周或者甚至1个月、2个月、3个月、4个月、5个月，或者更长时间，如本文所描述和进一步举例说明的全部在室温(RT)中。根据本发明的稳定溶液是其中所述分离的血浆是任何哺乳动物的血浆，例如牛、猪、猫科动物、犬科动物、兔、鼠科动物或人类的血浆。在本发明的一个进一步的方面，所述稳定溶液包括分离的人类因子II、VII和X，即三种维生素K依赖性因子。所述稳定溶液还可以包括因子V。如果使用分离的人类因子II、VII和X，可以使用除人类之外的另外的血浆来源，例如，举例来说，禽类的血浆。
因此，在进一步的实施方案中，本发明的稳定溶液包括禽类的血浆，所述禽类的血浆具有分离的人类因子II、VII和X即三种维生素K依赖性因子，和任选地还有因子V以增加反应速率。如果这样，任何来源的血浆可以被用作血浆基底，举例来说，兔或牛的血浆。然而，如果使用除人类血浆之外的另外的来源，例如，举例来说，牛或者兔，则避免来自接触活化系统的因子即，前激肽释放酶、HMW激肽原、因子XI和因子XII的污染是十分重要的。因此，所述分离的因子II、VII和X不需要具有任何可检测量的来自接触活化系统的至少一种因子。所述因子，举例来说，人类因子II、VII和X，即凝血酶原时间的对照材料或者任何这些因子的分析的对照材料所需的维生素K依赖性因子，也可以是重组的并且被加入至，举例来说，禽类的血浆或来自哺乳动物的血浆。然而，后一种血浆必须被耗竭所述接触活化因子的至少一种。对于预期用于依赖于从纤维蛋白原生成纤维蛋白(以制造凝块)的凝血酶原时间方法的对照材料，如果纯的因子被用于生成所述对照材料，纤维蛋白原必须被添加。这样的方法的例子是 i-STAT (Abbott, US)、HemoSense INRatio 系统(Hemosense, US)和Hemochron Jr. Signature Whole Blood Microcoagulation 系统(由 ITC, US 制造)。将被添加至稳定溶液的纤维蛋白原的合适水平是生成约O. 5g/L或以上的终浓度，例如，I、I. 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4. 5g/L的纤维蛋白原终浓度。在进一步的实施方案中，根据本发明的稳定溶液是其中所述分离的血浆是人类的血浆。 在进一步的实施方案中，所述牛的血浆是来自奶牛。在进一步的实施方案中，本发明的稳定溶液包括具有分离的人类因子II、VII和IX即维生素K依赖性因子的禽类的血浆。如果这样，任何来源的血浆可以被用作血浆基底，举例来说，禽类的或牛的血浆，然而，那样的话则避免来自接触活化系统的因子即，前激肽释放酶、HMW激肽原、因子XI和因子XII的污染是十分重要的。因此，所述分离的因子II、VII和IX需要是纯的并且不具有任何可检测量的来自接触活化系统的因子。所述因子，举例来说，人类因子II、VII和IX即维生素K依赖性因子，也可以是重组的并且被加入至，举例来说，禽类的血浆或牛的血浆。可替换的从血浆清除接触因子的方法是这样的方法，其中凝血酶原时间的对照材料所需的凝血因子，即，凝血酶原、因子V、VII和X以及最终的纤维蛋白原(依赖于要控制的凝血酶原时间方法的变量)，是在来自健康供体的人类血浆中利用钡盐例如硫酸钡沉淀维生素K依赖性因子并且添加纯化的因子V和纤维蛋白原(如果需要)。来自人类血浆的维生素K依赖性因子的浓缩物是市售用于患者的静脉内治疗的，举例来说，Ocplexi(Octapharma)和ConfidexCD (来自 CSL Behring)。
在一个特殊的实施方案中，血浆是添加柠檬酸盐的人类血浆，钙水平是生理水平，因子XII是与未被耗竭的血浆相比被耗竭约98%、99%或甚至99. 5%或以上的，并且稳定性是在室温约3个月和在2-8°C约I. 5年。在进一步的实施方案中，本发明的稳定溶液是水溶液。因为本发明的所述溶液是稳定的，不需要为了储藏而冻干。因此，所述溶液可以不需要被冻干。相应地，再进 一步的实施方案是其中所述溶液是水溶液，条件是该溶液没有被冻干。然而，方便起见，根据本发明的稳定溶液也可以是被冻干的，即便冻干并不是为了所述溶液的稳定化目的所必需的。如果所述溶液被冻干，该冻干的溶液在使用前被重构。然而，在使用时不需要其他添加物，并且如本文所描述的，重构的稳定溶液是稳定的。有时，冻干的溶液用于例如运输是更加方便的。尽管被保存在溶液中或者被冻干、被重构或仅被保持为溶液而不冻干，如本文给出的，本发明的稳定溶液的稳定性> 4小时。本文描述的溶液可以被冻干储存，并且在使用之前以合适的载体重构。任何合适的冻干方法(举例来说，喷雾干燥、滤饼干燥(cake drying))和/或重构的技术可以被采用。本领域技术人员将理解，冻干和接下来使用之前的重构可以导致不同程度的活性丧失。冻干的(冷冻干燥的)组合物可能在再水合时丧失其活性。然而，通常，与冻干之前相比，冻干的组合物在再水合时，失去其活性(冻干之前)的不多于约20%、或不多于约25%、或不多于约30%、或不多于约35%、或不多于约40%、或不多于约45%、或不多于约50%。稳定溶液的用途本发明进一步的方面提供本发明的稳定溶液作为凝血分析的对照材料的用途。在2-8°C具有增加的(B卩，>4小时)稳定性并且在室温中也稳定>4小时的本发明的稳定溶液，由于其增加的稳定性，作为凝血分析的对照材料使用是特别合适的。因此，冻干材料的更少重构，更少的归因于这样的稀释步骤而产生的人为误差，将会实现试验之间更少的变异性以及更加一致的和可信的结果。特别是对于其中冲洗过的红细胞被添加至本发明的稳定溶液的实施方案，需要较少的经由算法和标准曲线的重新计算，所述算法和标准曲线是在，举例来说，本领域通常对对照样品使用的特定代码芯片(举例来说，CoaguChek XS)上。再次重复，事实上，这样的消除至仅使用一个代码芯片将减少并消除误差和错误。因此，将会获得更可信的结果，辅助引导对患者进一步的药物治疗。患者将得到正确剂量的血液药物，这转而将增加患者的生活质量以及减少住院时间和经训练的医院员工的使用，从而降低社会的总成本。通常，使用的HEPES缓冲液是25mM的HEPES，pH 7. 4，具有33mmol/L的钙。针对凝血的常规筛选试验-APTT、ACT和PT活化部分凝血活酶时间(APTT)活化部分凝血活酶时间(APTT)的方法是被研发来解决针对凝血因子缺陷的较旧的筛选方法即部分凝血活酶时间具有的问题。不同实验室使用的脑磷脂(没有组织因子的大脑提取物，即，“部分凝血活酶”)在效力方面有差异，并且，最重要的是，血浆通过接触外来表面被活化至不同的程度。Proctor和Rapaport (I)通过最大化地活化添加朽1檬酸盐的血浆来绕过该问题，所述最大化地活化添加柠檬酸盐的血浆是在+37°C用高岭土粉末悬浮3分钟，随后再 丐化(Recalcification)并确定凝血时间。用作接触活化剂的其他材料是娃土和鞣花酸。预孵育步骤起始接触活化，在预孵育中，因子XII和XI被前激肽释放酶和高分子量激肽原被活化，该活化受磷脂促进。通过添加吸附过的血浆至APTT，特定的缺陷可以被检测。
分析过程由两步组成第I步添加柠檬酸盐的血浆+磷脂+接触活化剂一fXI和XII的活化第2步再钙化一纤维蛋白凝块因此，APTT是依赖于凝血系统的内源性途径的，8卩，因子VIII、IX、XI、XII、前激肽释放酶和高分子量激肽原，以及共同途径的因子，即，纤维蛋白原、凝血酶原、因子V和因子X。因子VII和XIII对APTT完全没有影响。APTT被用作针对凝血因子的缺陷的筛选试验，以监控使用普通肝素(unfractionated heparins)的治疗和检测狼疮抗凝血剂。因为不同的反应试剂和仪器对因子水平和肝素的响应性(responsiveness)变化很大，标准化APTT以及引入共同单元(common units)是不可能的。一些反应试剂对因子缺陷更灵敏，而其他反应试剂对因子缺陷较不灵敏，但对狼疮抗凝血剂更加灵敏。针对健康对照的参照范围必须被在当地决定。错误地延长的APTT的成因是用于冲洗留置导管(indwelling catheters)的肝素的污染、归因于装料不足的样品中过高的朽1檬酸盐浓度以及归因于不充分混合的部分凝结的样品。在内源系统的起始，APTT是对因子缺陷最灵敏的。因子VIII或IX的轻微因子缺陷(> 25% )通常不被检测到，但针对一些反应试剂，甚至仅10%的因子浓度也可以被检测到！举例来说，若干年前，部分归因于不灵敏的反应试剂以及在参照范围之内的APTT，一个年轻男孩的血友病的正确诊断在膝关节流血之后被延误多于两个月。大多数反应试剂对因子IX缺陷比对其他因子缺陷较不灵敏。应强调，患轻微的以及在最坏的情况甚至为中度的流血紊乱的许多患者将具有正常的APTT。对肝素的响应性在反应试剂之间变化至少两倍，并且从而导致与对照值相比
I.5-2. 5或2-3倍的APTT的延长。然而，肝素的剂量将取决于当地的反应试剂_仪器的组合而大范围地变化。APTT甚至可以在同品牌(same make)的仪器之间以及反应试剂批号之间相当大地变化。假性的短APTT的重要成因是从血液样品中的血小板泄漏(leakage)血小板因子4，所述血小板因子4中和肝素，从而重要的是在血液取样之后立刻(一小时之内)分离血浆。然而，近年来，用普通肝素(UFH)静脉内治疗静脉血栓栓塞已经减少非常多，并且已经被用无APTT实验室监控、按体重调节地皮下给予低分子量肝素(LMH)替代。LMH治疗延长APTT ;以预防剂量，仅延长APTT数秒，而以用于治疗静脉血栓形成的剂量，APTT通常将超过参照范围的上限数秒。用华法林(warfarin)的治疗也延长APTT，在INR 2_3，通常延长至超过参照范围上限5-15秒，但当严重地服药过量时，APTT可以被延长至> 180秒。活化凝血时间(ACT)Hattersley为新鲜的全血样品调整了 APTT试验，使用硅藻土作为活化试剂。他将所述试验命名为活化凝血时间(ACT) (2)。现在，高岭土和硅藻土是两种最常用的接触活化齐U，有时组合使用。硅藻土比高岭土更加响应于抑肽酶(3)。ACT比APTT具有更广的剂量范围响应，所以ACT被用于监控高剂量的UFH疗法。与APTT不同，ACT仍是最频繁进行的凝血分析中的一种，并且试验的数目是增加的，就地检测以控制在心内直视手术(open-heartsurgery)和经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention)中用静脉内UHl的治疗。通常，为了在将患者连接至体外循环时避免凝血，肝素剂量旨在实现>420-480秒的凝血时间。取决于反应试剂和仪器，来自用高剂量肝素的患者的血浆样品的ACT可以相当大地变化，甚至在重复样品之间。所述变化比APTT的变化更加严重(4)。为了改进客户接受度，一些生产商已经在仪器的软件中引入算法，将测量到的凝血时间在针对心内直视手术的判断限值(decision limit)转换成为等于旧的人工方法。凝血酶原时间(PT、PT-INR、PK_INR)PT为了三个目的被使用监控用香豆素的口服抗凝血剂疗法，评价在严重肝脏疾病中肝脏的功能，以及筛选在外源性途径和共同途径中的缺陷。使用两种不同类型的分析。由Quick在20世纪30年代发明的分析类型(5、6)是以使用未稀释的添加柠檬酸盐的血浆与等体积的凝血活酶反应试剂(=无添加的凝血活酶)和氯化钙溶液或者两体积的凝血活酶与氯化钙的混合物混合为特征的。凝血活酶是含有组织因子和磷脂的提取物，通常来自 兔的大脑或人类胎盘-组织因子富集的来源。近年来，重组的组织因子已经被引入。QuickPT的结果取决于维生素K依赖性因子II、VII和X的活性以及因子V和纤维蛋白原的活性。因子V是不稳定的，并且因此血液样品必须在血液取样之后一小时之内被分析，或者血浆必须被分离和冷冻。概要地，所述分析过程如下添加柠檬酸钠的血浆+凝血活酶+Ca2+ —纤维蛋白凝块更特异的分析类型是在近二十年后由Owren所描述的(7、8)。所述分析的特征是将患者的样品与含有凝血活酶、因子V、纤维蛋白原和氯化钙的反应试剂(=合并的凝血活酶)混合。由于因子V和纤维蛋白原的添加(常以因子II、VII和X耗竭的牛血浆的形式)，该分析对凝血因子II、VII和X更特异。如果PT是通过Owren方法分析的，来自用华法林的患者的样品可以被储存在室温48小时。在来自口服抗凝血剂的患者的样品中，PT主要取决于凝血酶原和因子VII。简要地,针对Owren PT的分析过程如下在缓冲液中1/7预稀释的添加柠檬酸盐的血浆+经耗竭的牛血浆+兔凝血活酶+Ca2+—纤维蛋白凝块Owren方法已经被修改，并且在目前在北欧和波罗的海国家实施的Owren类型的PT分析过程中，存在以含有柠檬酸盐的缓冲液的初始血浆样品稀释(I份+6份)，随后添加合并的反应试剂(2份)至稀释的样品(I份)，产生1/21的最终样品稀释。这可以与原始的Quick PT分析形成对比，所述原始的Quick PT分析具有1/3的最终样品稀释。在针对利用冻干的凝血活酶被天然的血液样品溶解的就地检测修改的Quick PT分析中，患者的血衆完全没有被稀释，举例来说，在CoaguChek仪器中(Roche Diagnostics,巴塞尔,瑞士)。目前的Owren方法的优势是PT试验需要最小量的样品，并且因此所述试验对于儿科的和毛细血管的样品的自动实验室分析是合适的。所述稀释还降低干扰，这当狼疮抗凝血剂或其他抑制剂例如直接凝血酶抑制剂存在时是特别期望的(9、10)。使用Quick方法，以及特别是如果所述方法被应用于就地检测的仪器，狼疮抗凝血剂可以相当大地增加INR值，并且患者处于治疗不足以及血栓形成的危险中。
使用PT,初步结果是以秒计的凝血时间,对于正常血衆,使用Quick方法的凝血时间是约12秒，使用Owren方法的凝血时间是约20秒。纤维蛋白的形成通常是通过由浊度分析法(turbidometry)或者池度法(nephelometry)检测的吸光度的增加来被检测,可选择地通过由机械设备检测的粘度的增加来被检测。不同的凝血活酶显示出对因子缺陷的不同的灵敏性。轻微的因子缺陷(> 40% )可能不被检测到。自发地延长的PT的最常见的成因是肝脏疾病、遗传性因子VII缺陷(通常是轻微的、没有出血症状)以及维生素K摄入不足。UHl的治疗剂量延长PT数秒，除非反应试剂含有肝素中和剂。由于其所要求的低的血液体积，Owren方法方便地分析取自毛细血管的添加柠檬酸盐的全血，但是非常高或非常低的血球密度(hematocrit)将造成错误的结果，除非仪器针对血球密度测量并补偿，所述针对血球密度测量并补偿通过例如就地检测仪器Simple Simon (Zafena AB, Borensberg,瑞典)来进行。多年以来，PT结果是以秒、凝血酶原指数、凝血酶原活性或者凝血酶原比值表示
(11)。取决于反应试剂，所述结果以及由此的香豆素的平均剂量在医院之间变化很大。为了标准化PT，国际标准化比值(INR)在1983年被世界卫生组织采用(12)。INR= (PT/MNPT) ISI。PT是以秒计的凝血酶原时间，MNPT是来自至少20个正常受治疗者的血浆样品的PT的几何平均值，以及ISI是凝血活酶的国际灵敏性指数。ISI的概念是将从用当地工作方法获得的比值转换为假如用指定为67/40的凝血活酶的一级国际参考品(first international reference preparation, IRP)获得的比值，使用手工倾斜试管技术(manual tilt tube technique)。所述工作方法的ISI是由分样(split-sample)PT测试对参照方法以及IRP确定的。来自至少20个正常受治疗者和60个稳定口服抗凝血剂的患者的新鲜血浆必须通过两种方法来测试。ISI是参照方法Iog-PT对工作方法Iog-PT的正交回归线的斜率。IRP 67/40的原始贮存(stock)已经被耗尽，并且二级IRP的链(chains)已经以分级模式被赋以ISI值。取决于使用哪个二级IRP，结果将显著地偏离，归因于在每次赋值中引入的误差以及在IRP的储存期间性质的微小变化。WHO规程是繁琐的，IRP的贮存是有限并昂贵的，并且校准必须被在每个实验室每年进行多次(当改变反应试剂批号、仪器或者仪器售后服务时)。极少实验室使用WHO规程，反而依赖由制造商提供的ISI值。然而，被赋于各类仪器或模式的ISI值对特定仪器并不一定是有效的。由于以上描述的校准程序的限制，存在对使用具有被赋以INR值的血浆校准器的增加的兴趣。然而，校准器的不同的IRP、分析方法和生产方法可以导致显著不同的被赋以的INR值。此外的未解决的问题的两个例子是需要多少个校准器以及校准器对新鲜的患者血衆的基质效应(matrix effect)。在使用Owren类型PT的瑞典和挪威，可替换的校准程序在1999年被引入(13)。所述方法利用正常血浆的稀释物替代IRP，并且正常活性的百分比(PT% )被转换为INR(INR=(1/ΡΤ% +0.018)/0.028)，所述转换是通过使用源自回归分析的方程式，基于使用Owren方法和手工倾斜试管技术以及IRP的血浆样品的分样分析，所述血浆样品是来自正常受治疗者和口服抗凝血剂的患者。举例来说，100%= INR 1,25%= INR 2. 07,20%= INR2. 43、10%= 4. 21。使用该算法，任何正常血浆的稀释物具有一永远有效的INR值，所述INR值被用于对冻干的校准器赋以INR值。因此，不再需要参照凝血活酶(IRP)。在当地实验室水平仅需要两个校准器，一个在正常范围中并且一个具有在治疗范围中的INR。在数个实验室已参加外部质量控制项目的瑞典，三年的随访报告，用该当地INR校准，实验室之内和实验室之间的变化已经变为明显地改进的(14)。尽管在丹麦、芬兰和冰岛，不同模式的校准被用于Owren-ΡΤ,以国际角度看在北欧国家的实验室间的变化是非常小的(15)。为了获得用Owren类型PT的正确的结果，重要的是混合血液样品，以确保抗凝血和均质的血浆，以使得样品和反应试剂在分析之前被平衡至正确的温度，以在分析之前所要求的时间溶解反应试剂(以避免在工作日期间ISI和/或MNPT的改变)、以进行正确的校准、以运行对照样品并且遵循QC的规则。尽管PT已经被用于控制口服抗凝血剂多于60年，仍需要反应试剂和校准程序的改进。在使用Quick方法的国家，实验室之间的变化相当大，并且对于一种患者样品，归因 于反应试剂的性质，可能获得临床上显著不同的结果。如果仍使用Quick PT方法的国家变为使用更特异的Owren PT方法,会实现显著的改进。产生稳定溶液的方法本发明进一步的方面是产生稳定溶液的方法，所述方法包括以下步骤a)分离血浆，b)耗竭所述血浆的因子XII，和c)调整游离钙的水平至彡O. 5mol/L、生理水平或以上。本发明进一步的方面是提供用于产生本发明的稳定溶液的方法，其中所述方法包括a)添加分离的人类因子II、VII和X至分离的血浆，和b)调整游离钙的水平至彡O. 5mol/L的步骤。本发明进一步的方面是提供用于产生稳定溶液的方法，所述方法包括a)添加分离的人类因子II、VII和X至分离的血浆，和b)调整游离钙的水平至彡O. 5mol/L的步骤。更进一步的方法是a)分离人类因子II、VII和X，b)添加耗竭至少一种接触活化因子的非人类血浆，所述接触活化因子例如，举例来说，激肽释放酶、HMW激肽原、因子V、因子XI或因子XII，c)调整游离钙的水平至彡O. 5mol/L、生理水平或以上。如本文所描述的，分离的血浆可以是哺乳动物的血浆，例如人类的血浆，或者非人类的哺乳动物血浆，例如兔或牛的血浆。分离的血浆也可以是非哺乳动物的血浆，例如禽类的血浆。如本文所提及的，如果使用禽类的血浆，不需要进一步耗竭至少一种接触活化因子。如果使用非人类的哺乳动物的血浆，本文描述的所述方法还包括耗竭非人类的哺乳动物的血浆的至少一种接触活化因子的步骤。因为稳定溶液的钙水平是生理水平或以上，可选的步骤d)是其中，取决于钙螯合剂是否在取血时被添加，钙水平被调整至生理水平。然而，通常，钙螯合剂是被添加的，并且随后调整钙水平至生理水平或以上的可选步骤是强制性的。所述可选步骤是由于分离的血浆的血液来源。如果正常的血液供体被采血，钙水平需要被调整至生理水平或以上。如果血液供体是因子XII缺陷的(即本身在活性或蛋白表达上缺陷)，不需要添加额外的钙，这是因为由于采血时不需要添加螯合剂或抗凝剂，钙水平将会是生理水平或以上。因此，在上述用于制备所述稳定溶液的方法中，钙水平需要被核对是否为正常的水平或以上，并且如果需要(即钙水平是低于正常水平的)，调整至正常水平或以上。血液或血浆中的离子隹丐水平可以由大多数血气分析仪(blood gas analyzers)来测量,举例来说，RadiometerABL720,或者 Kone clinical chemistry analyzer。分别参见 http://www. radiometer,com/ 和 http://www. thermofisher, com/global/en/products/home, asp。参见，举例来说，Laurells Klinisk kemi. Ed Nilsson-Ehle P.Studentlitteratur 2003 ；Brown EM 和MacLeod J, Extracellular calcium sensing and extracellular calcium signalling,Physiol Rev 2001 ;81 :239-97 ;以及 Larsson L 和 Magnusson P, Ionized calcium orcorrected total calcium J Bone Miner Res 2003 ；18 :1554-5。血浆可以在如通常标准的作为螯合剂的柠檬酸盐(柠檬酸缓冲液)、异柠檬酸盐或者草酸盐缓冲液或类似缓冲液中通过正常的静脉穿刺来分离。通常，柠檬酸缓冲液是以约1/10体积的约O. 105,0. 01或O. 13mol/L的终浓度、中性或者略酸性的pH(举例来说，pH约6-7. 4)被添加，即大量过剩于血浆中的游离钙。如果供体具遗传性的因子XII缺陷，血液被采出而不添加任何钙螯合剂。然后血液被采集在例如塑料试管中而无任何另外的添加物(例如柠檬酸盐(柠檬酸)或异柠檬酸盐缓冲液)，使用吸入或真空原理的采集，举例来说，使用Monovette, Sarstedt0然后血液 被离心，并且血沉棕黄层和红细胞最上面的部分如本文所描述的被除去。第二次离心之后，保存血浆并且丢弃沉淀团。如果需要，接着进行因子XII的耗竭。如何从血浆耗竭因子XII是本领域已知的，并且被进一步在本文中被举例说明，通过，举例来说，免疫方法、使用金属氧化物(例如，举例来说，二氧化钛)的耗竭，以及其他方法。如果需要，至少一种另外的免疫接触因子的耗竭也可以使用免疫方法及本领域技术人员已知的类似方法来进行。钙水平被进一步测量，并且钙被添加至血浆以调整钙水平至生理水平或以上。进一步地，因子XII缺陷的血浆可以然后被保持为根据本发明的稳定溶液或被冻干。如果被冻干，使用之前需要重构。然而，冻干不是为了稳定化的目的而被需要。在重构之后，所述溶液可以然后被保持为稳定溶液。用于所述稳定溶液的制备的方法可以然后还包括耗竭血浆中的血小板的步骤。血小板可以通过在约180-200xg离心随后滤过孔径不大于O. 25 μ m的过滤器来耗竭，如本文所描述的。用于稳定溶液的制备的根据本发明的方法可以然后还包括添加冲洗过的红细胞。红细胞的冲洗在本领域是已知的，并且在本文被进一步描述。冲洗可以通过在IOOOxg离心、以等量在生理盐水中重悬以及重复离心来进行。因此，进一步的实施方案是其中所述血浆是人类的血浆。再进一步的实施方案是其中所述添加的冲洗过的红细胞是人类的红细胞。本发明的进一步的方面是其中根据本发明的稳定溶液是通过本文所描述的方法可获得的。用于评价凝血系统状态的方法本发明更进一步的方面涵盖评价受治疗者中凝血系统状态的方法，所述方法包括以下步骤a)提供根据本发明的稳定溶液，b)提供来自受治疗者的血液样品，
c)测量所述受治疗者的凝血系统的状态，d)分析所述患者的凝血系统的状态，e)将所述受治疗者的凝血状态与阳性和/或阴性标准比较，从而评价所述患者中的凝血系统状态。本发明再进一步的实施方案提供用于评价受治疗者中的凝血系统状态的方法，所述方法包括以下步骤a)在来自所述受治疗者的血液样品中测量所述受治疗者的凝血系统的状态，和b)分析与根据本发明的稳定溶液相比较的所述受治疗者的凝血系统的状态，从而评价所述受治疗者中的凝血系统状态。所述方法的条件是，在临使用之前不添加另外的钙至所述溶液，如血液凝结分析的正常情况那样。因此，所述稳定溶液是具有生理水平的钙的溶液，并且条件是运行分析新鲜血液样品和对照材料的就地检测仪器的人/个人不添加钙至所述稳定溶液。 凝血系统的状态的测量可以由本领域已知的评价凝血系统的功能的不同试验来进行。本发明的稳定溶液可以然后在分析中作为对照材料使用。分析/试验的例子是，举例来说，PT(凝血酶原时间，也用于确定INR)、混合试验(如果将患者的血浆与正常的血浆混合，患者的异常是否被修正)、凝血因子分析、凝血弹性扫描法(TEG或者Sonoclot)。接触活化途径是被血浆的接触因子的活化来起始的，并且可以通过aPPT试验测量。组织因子途径是通过组织因子(特定的细胞脂蛋白)的释放来被起始，并且可以由PT试验来测量。PT的结果通常被记录为比值，即INR(国际标准化比值)值。测量之后，对每个样品进行分析，并且分析在测量步骤中对样品给出的值。进一步地，可进行与分析中包括的正对照和/或负对照的随后的比较。本发明的稳定溶液可以被照此使用。如果所述分析是以混合分析(mixing assay)进行的，本发明的稳定溶液也可以被用作混合组分。对于这样的混合分析，维生素K依赖性因子也必须从一种混合溶液中被耗竭，所述混合溶液将要与具有正常含量的这些因子的一种溶液混合。维生素K依赖性因子的耗竭可以通过使用吸附至钡盐或者通过免疫耗竭来进行。以百分数表示的凝血酶原复合物活性可以通过使用已发表的算法(Lindahl TL等人，INR calibration of Owren-typeprothrombin based on the relationship between PT% and INR utilizing normalplasma samples. Thromb Haemost 2004 ；91 1224-31)被转换为 INR。进一步的实施方案是其中所述受治疗者是人类受治疗者。凝血系统的状态可以通过选自由PT(凝血酶原时间)、混合试验、凝血因子分析、凝血弹性扫描法(TEG或Sonoclot)以及优球蛋白溶解时间(ELT)组成的组的分析来测量。所述方法还可以包括其中来自受治疗者的血液样品是在测量和分析所述凝血系统的状态之前与根据本发明的稳定溶液混合。试剂盒本发明的进一步的方面涵盖包含根据本发明的稳定溶液的试剂盒。如果方便，所述稳定溶液可以以冻干形式被提供。然而，这不是为了本发明所述的稳定溶液的稳定性的目的所需要的。
在一些实施方案中，试剂盒包括指导性材料，所述指导性材料公开，举例来说，使用本发明的稳定溶液作为凝血分析/检验的对照材料的方法，或者使用特殊的反应试剂的方法。所述指导性材料可以被以电子形式(举例来说，计算机软盘或光盘)书写，或者可以是可视化的(举例来说，视频文件)。所述试剂盒还可以包括额外的组分以辅助所述试剂盒为之设计的特殊的应用。因此，举例来说，所述试剂盒可以包括用于实施特别地公开的方法的缓冲液和其他常规反应试剂。这样的试剂盒和恰当的内容物是本领域技术人员所熟知的。
所述试剂盒还可以包括对于至少一次检验足够的量的根据本发明的稳定溶液，所述稳定溶液是作为单独地包装的反应试剂。典型地，还包括被包装的反应试剂的使用说明。典型地，这样的说明包括描述反应试剂的浓度和/或至少一种检验方法的参数(例如，反应试剂和将被混合的样品的相对量、反应试剂/样品掺合物的保持时间段、温度、缓冲液条件等等)的具体表述。因此，进一步的实施方案是其中所述试剂盒还包括针对其作为用于凝血分析的对照材料使用的说明书。甚至更进一步的实施方案是其中所述试剂盒还包括针对其用于根据本发明的方法的说明书。试剂盒的某些实施方案可以包括运送工具，例如盒、袋、背包、塑料箱(例如吹模塑料或其他透明的包装)、包装材料(例如，密封的或可密封的塑料、纸或金属包装材料)、或其他容器。在一些例子中，试剂盒的组分将被装入单独的包装单元中，例如盒或其他容器，该包装单元可以具有分隔，试剂盒的一个或更多个组分可被放置在所述分隔中。在其他实施例中，试剂盒包括一个或更多个容器，例如可以保存如一个或更多个将被检测的血液样品
的瓶、管等等。其他的试剂盒的实施方案包括，例如，注射器、棉拭子或乳胶手套，所述注射器、棉拭子或乳胶手套可以是对操作、收集和/或处理血液样品有用的。可选择地，试剂盒还可以包括将血液样品从一个位置移到另一个位置有用的用具，举例来说，滴管、注射器等等。再其他的试剂盒实施方案可以包括用于丢弃使用过的或不再需要的物品(例如受治疗者的样品等)的处理工具。这样的处理工具可以包括，而不局限于，能装来自丢弃的材料的渗漏物的容器，例如塑料的、金属的或者其他不渗透性的袋、盒或容器。本文的所有参考文献通过引用被并入本文。体现本发明的某些方面的非限制性的实施例将在此描述。
实施例实施例I-从具有因子XII缺陷的供体纯化因子XII缺陷血液和凝血酶原时间的测量采集时间血液被通过静脉穿刺从两个具有遗传性因子XII缺陷(即，当通过使用免疫耗竭的血浆的凝血时间测量时，因子XII低于检测下限)的供体采集，血液被采集在塑料试管中而无添加物(Monovette, Sarstedt)(没有抗凝的添加物)。所述血液被在180xg离心20分钟。血沉棕黄层和红细胞的最上层部分被除去，接着是第二次离心步骤，1000xg,5min。保存血浆并丢弃沉淀团。红血球的冲洗血液被通过肘前静脉的静脉穿刺从健康的供体采集，并且被采集在含有1/10体积的柠檬酸钠(O. 13mol/L)的 真空试管中。所述试管被在180xg离心20分钟，丢弃富集血小板的血浆和红血球的最上层部分。添加等体积的Owren' s缓冲液。红血球团被重悬，接着在IOOOxg离心5分钟。丢弃缓冲液相，添加等体积的生理盐水，并且重复离心步骤。在添加至因子XII耗竭的血浆之前血细胞 被混合。利用就地检测仪器CoaguChek XS测量凝血酶原时间对于血浆，遵循来自仪器制造商的对照材料的说明，即，如所指示的，将针对对照材料的代码芯片(code chip)插入仪器。不同批号的反应试剂已经被使用，举例来说，183，以及针对由Roche提供的对照材料的代码芯片028，批号170。对于CoaguCheck采血笔(stick)，举例来说，批号20165732。结果结果示于表I中。-未稀释的因子XII缺陷的血浆INR= I. O (对健康供体的预期结果；INR1±0.2)。该因子XII缺陷的血浆从志愿患者获得，所述志愿患者具有已知的遗传性因子XII的完全缺陷(低于利用在来自Il (米兰，意大利)的ACL Top上的一步凝结方法的检测下限)。-因子XII缺陷的血浆在HEPES缓冲液中1+1预稀释；INR= I. 9 ;1· 9和I. 8(η =3)-遵循针对毛细血管的说明使用新材料，新鲜的血液从口服抗凝血剂的患者或者健康的供体获得，即，仅对新鲜的、未稀释的血液使用代码芯片。-未稀释的因子XII耗竭的血浆与冲洗过的红血球和因子XII缺陷的血浆以1+1的体积混合，并且然后被测量。结果INR= I. I ；1. 2 ;L 2(预期结果 INR 1±0· 2)-同上，但因子XII耗竭的血浆在与冲洗过的红血球混合之前，以等体积的HEPES缓冲液稀释。结果INR= 2. 4 ;2· 5 ;2· 5将所述因子XII缺陷的血浆与因子XII被免疫耗竭的血浆即冷冻运输的Cryocheck (Precision Biologic，目录号 #FDP_12_10，批次#D12-12)交换。将该血浆与25mM的CaCl2等体积混合。根据来自Roche的说明作为对照样品在CoaguCheck XS上测量。结果INR= I. 5 ；1. 5 ;1. 5(预期值 INR = I. 4±0· 2)。将因子XII缺陷的血浆(来自患者)与3倍体积的HEPES缓冲液混合，INR = I. 9 ；1.9 ;1. 9 (预期值INR= 2. 0±0. 2)(如前，未稀释的INR= 1.0)。在+22。。储藏16小时后测量。结果INR = 2. O ；1. 9 ;1· 9，即完全无差别!将缺陷的血浆在25mM的HEPES缓冲液中1+3稀释，该25mM的HEPES缓冲液具有33mmol/L的CaCl2和终浓度为5mmol/L的叠氮化钠。表I来自因子XII缺陷的新患者的血浆的稳定性
天数=O I Γ~2 p7~INR179O 270 2.4 实施例2-稳定性试验A.因子XII被吸附至< 1%。从正常的供体收集的血浆在HEPES缓冲液(4. 89g HEPES至IL水)中被稀释，每IOmL血浆使用18.9mL HEPES缓冲液。为调整钙浓度至生理水平，添加I. 33mL的氯化钙储 液(O. 5mol/L) ο添加150微升叠氮化物储液(lmol/L)以防止细菌生长。稳定性结果在表2中示出。表2-在第3、5、8和12天的稳定性
3天 5天8天12天
O2小时 4小时 24小时 48小时120小时 192小时 288小时~
INR 176 hi O O O179 Γθ当使用这种产生稳定溶液的方法时，INR在第一个小时可能稍微变化。然而，24小时之后，INR稳定。归因于设备的INR数值的变化是约O. 1INR。所述溶液被存放在室温。B.在该实施例中，使用来自因子XII缺陷的受治疗者的血浆。该缺陷在所述受治疗者的血液中留下少于< 1%的因子XII。不添加柠檬酸盐至所述血浆。不添加叠氮化物至所述血浆。结果示于表3中。表3-在24小时、48小时、3天和4天的稳定性新鮮制备 24小时48小时3天 4天
1.21.3 1.3 1.3 1.3C.以下的实施例具有已经被在HEPES缓冲液(包括O. 13mol/L氯化钠)中稀释的来自B的因子XII的血浆，以获得来自稳定性测量的更高的INR值的数据，示于表4中。表4-在24小时、48小时、3天、4天和I周的稳定性
Γ 新鲜制备 24小时48小时3天 4天 I M---------
2.1_2.2 2.3 2.5 2.5 2.9在这种情况下，仅稳定一天。实施例3-凝血因子XI和/或因子XII缺陷的血浆的产生根据来自制造商的说明，针对因子XI的抗体(针对人类因子XII的多克隆鸡抗体)和针对因子XII的抗体(山羊抗人类因子XII，纯化的IgG)被分别偶联至来自Innovata(斯德哥尔摩,瑞典)的 Novarose ActHlgh100/40 胶。添加柠檬酸盐的人类血浆被施加在所述胶顶部，级分被收集。测量在280nm的吸光度。含有最多蛋白质的级分(最高的吸光度)被使用PT(Owren方法)来分析。具有PT-INR < 3的级分被保存并且贮存在_70°C。所述级分中的一些被施加至也具有被固定的另一抗体的柱，从而制造双重缺陷的血浆。所述缺陷血浆被以1+3在含有8. 8mol/L的CaCl2的低离子强度HEPES缓冲液(25mmol/L,pH 7.4)中稀释。使用低离子强度的缓冲液是为了能够使用具代码芯片和测试条(test strips)的Coaguchek XS仪器,所述仪器预期用于天然的人类毛细血管血(在所述仪器中使用阻抗测量以核对样品是血液或血浆，如果不是所预期的，所述仪器不给出结果，而给出一错误信息。此处的预期是使用如针对全血使用的相同的程序，所以使用所述低离子强度的缓冲液)。考虑到稀释效应，对于一种因子缺陷的血浆，预期稍微超过INR = 2的结果(如果在产生所述缺陷的血浆时没有稀释，将会预期2. O和3. 3)，对于双重缺陷的血浆，预期约 3.5。因此，以下的表5和表6获得的值如所预期的表5-对于因子XI、XII和双重耗竭的血浆的超过24小时的稳定性测量
使用的抗体在零时刻的INR 在24小时的INR 在8天的INR
FXI__13__2A__42_
FXll2.43.1未检测FXIΦ FXII 3.43.9未检测
(I vol)*____
FXl-XH 2.12.7未检测
(2 volf* ___*)缺陷血浆与所述低离子强度缓冲液以1+3混合，**) 2+3。用山羊抗体的FXII的吸附表现为在收集的穿透的级分中留下痕量的FXII。在该特定情况下，FXI的吸附是更有效的，具有满意的稳定度，虽然不能持续8天。表6-新一批血浆
使用的抗体零时刻第I天第2天第7天的 INR的 IMR的 INR的 INR
FXI_6J_2J_2J_U_最初24小时的奇怪变化的原因未知，并且在上面的之前的试验中没发生过。然而，重要的是从第一天及以后的稳定性。实施例4-使用吸附至不同的带负电材料来产生FXII缺陷的血浆以及比较由这样的吸附获得的缺陷血浆的稳定性血浆的制备新鲜的血液从健康的志愿者抽取，并被收集在带柠檬酸盐的4. 5mL Monovette采样管(Sarstedt，德国)中。为获得血小板富集的血浆(PRP)，新鲜的血液在140g离心20min。离心后，血小板富集的上清被转移至新的塑料试管中。不含血小板的血浆(PFP)通过血液在2500g离心15分钟并且滤过O. 20微米的Minisart膜过滤器(Sartorius,德国)来产生。因子XIIa的活性因子XIIa的活性是使用在添加柠檬酸盐的血浆中的因子XIIa的荧光底物Boc-Gln-Gly-Arg-AMC(参见[I])来测量的。血浆被在二氧化钛或高岭土粉末中孵育5分钟，使用每毫升血浆O. 5g粉末的比率。血浆样品被储存在冰箱中，并且样品等份在I小时、
I天、2天和4天被冷冻。此后，全部样品被解冻并且用250微摩尔的因子XIIa活性底物来评价。突光的测量是在 Fluoroskan 96 孔读板仪(Fluoroskan 96-well plate reader)中进行，使用390nm的激发波长和460nm的发射波长。结果被计算为最大因子XIIa底物裂解率，并且在图2中以平均值+SD呈现。从结果看，因子XIIa活性的更高水平在高岭土处理的血浆样品中找到。然而，该水平随时间降低(使用成对样品的t检验比较第O天和第4天，P < O. 05)。结果在图2中示出。 实施例5-内源性凝血酶替能(ETP)内源性凝血酶潜能(ETP)用利用针对凝血酶的荧光底物的经校准的凝血酶生成分析(Thrombinoscope)来测量(参见[2])。根据H. C. Hemker,ETP可以被用于“在一给定的血浆样品中评价可以影响凝血酶生成的全部因子的组合效应” [3]，S卩，对于凝血酶原时间，与对照材料有关的是什么。分离自三个不同个体的添加柠檬酸盐的不含血小板的血浆(参见血浆制备段落)被在二氧化钛或高岭土粉末中孵育5分钟，使用每毫升血浆O. 5g粉末的比率。所述血浆样品在冰箱中储存，并且样品等份在I小时、I天、2天和4天被冷冻。此后，全部样品被解冻并且用由Hemker等人描述的凝血酶生成方法[2]来评价。凝血酶生成被使用Thrombinoscope软件包(Thrombinoscope BV，荷兰)计算为ETP。应注意，使用高岭土孵育的血浆仅产生平坦的凝血酶生成曲线，所述平坦的凝血酶生成曲线给出零ETP。总之，高岭土吸附对于对照材料的产生不是一个选择。参见图3。图3示出0、1、2和4天之后的凝血酶生成，其计算为以平均值+SD呈现的内源性凝血酶潜能(ETP)。数据代表分别与二氧化钛一起孵育5分钟(条纹的)和60分钟(纯黑)，以及与高岭土一起孵育5分钟(白色具黑点)和60分钟(黑色具白点)。实施例6-用CoaguCheck(Roche)测量的凝血酶原时间(PT)分离自三个不同个体的添加柠檬酸盐的不含血小板的血浆(参见血浆制备段落)被在二氧化钛或高岭土粉末中孵育5分钟，使用每毫升血浆O. 5g粉末的比率。然后，所述血浆样品在冰箱中储存4天。在PT测量中10微升血浆被与30微升所述含钙的低离子强度缓冲液混合。此后，制备的血浆样品在CoaguCheck中测量，并且INR或错误代码被记录。在高岭土中孵育的血浆在PT测量中仅生成错误代码(3个供体中的3个)，而在二氧化钛中孵育的血浆样品可以全部被测量并且得到INR值(3个供体中的3个)。结果在表7中示出。表7.来自用CoaguCheck(Roche)的凝血酶原时间测量的INR值或错误代码
权利要求
1.一种稳定溶液，所述稳定溶液包括分离的因子II、VII和IX以及分离的血浆，其中所述溶液包括彡O，5mol/L的钙，并且其中所述溶液在2-8°C和/或在室温稳定> 4小时。
2.所述稳定溶液，其中所述因子以在所述分离的血浆中分离，并且其中所述分离的血浆是被耗竭凝血因子XII的。
3.根据权利要求1-2中的任一项所述的稳定溶液，其中所述钙的量是>O，5mol/L。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的稳定溶液，其中所述钙的量是生理水平或者生理水平以上。
5.根据权利要求1-5所述的稳定溶液，其中所述溶液在室温中稳定>4小时。
6.根据权利要求2-5中的任一项所述的稳定溶液，其中凝血因子XII的耗竭是95% -100%。
7.根据权利要求2-6中的任一项所述的稳定溶液，其中凝血因子XII的耗竭是100%。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的稳定溶液，条件是所述溶液不包括任何钙螯合剂。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的稳定溶液，条件是在使用时不添加额外的钙到所述稳定溶液。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的稳定溶液，其中所述血浆是被耗竭血小板的。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的稳定溶液，还包括纤维蛋白原。
12.根据权利要求1-11中的任一项所述的稳定溶液，还包括分离的和冲洗过的红细胞。
13.根据权利要求1-12中的任一项所述的稳定溶液，所述稳定溶液在室温稳定至少12小时。
14.根据权利要求1-13中的任一项所述的稳定溶液，其中所述分离的血浆是哺乳动物的血浆。
15.根据权利要求1-14中的任一项所述的稳定溶液，其中所述分离的血浆是人类的血浆。
16.根据权利要求1-13中的任一项所述的稳定溶液，其中所述分离的血浆是禽类的血浆。
17.根据权利要求1-16中的任一项所述的稳定溶液，其中另外的接触活化因子是被耗竭的。
18.根据权利要求17所述的稳定溶液，其中所述另外的接触活化因子选自由前激肽释放酶、HMW激肽原、因子V、因子XI组成的组。
19.根据权利要求1-18中的任一项所述的稳定溶液作为凝血分析的对照材料的用途。
20.一种产生稳定溶液的方法，所述方法包括以下步骤 a)耗竭分离的血浆的因子XII； b)调整钙水平至0，5mol/L或以上。
21.根据权利要求20所述的方法，其中因子XII的耗竭是通过使用金属氧化物来进行。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述金属氧化物是二氧化钛。
23.根据权利要求20-22中的任一项所述的方法，所述方法还包括耗竭所述血浆中的血小板。
24.根据权利要求20-22中的任一项所述的方法，所述方法还包括添加冲洗过的红细胞。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述冲洗过的红细胞是人类的红细胞。
26.根据权利要求20-25中的任一项所述的方法，其中所述血浆是人类的血浆。
27.根据权利要求20-25中的任一项所述的方法，其中所述血浆是禽类的血浆。
28.—种产生稳定溶液的方法，所述方法包括以下步骤 a)添加分离的人类因子II、VII和X至分离的血浆；和 b)调整游离钙的水平至彡0,5mole/L。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述分离的血浆是非人类的哺乳动物的血浆。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述分离的血浆是禽类的血浆。
31.根据权利要求28-29中的任一项所述的方法，还包括耗竭所述非人类的哺乳动物的血浆的至少一种接触活化因子。
32.根据权利要求1-18中的任一项所述的稳定溶液，所述稳定溶液是可通过根据权利要求20-31中的任一项所述的方法获得的。
33.一种评价受治疗者中凝血系统状态的方法，所述方法包括 a)在来自所述受治疗者的血液样品中测量所述受治疗者的凝血系统的状态；和 b)分析与根据权利要求1-18中的任一项的稳定溶液相比较的所述受治疗者的凝血系统的状态， 从而评价所述受治疗者中的凝血系统状态。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述受治疗者是人类受治疗者。
35.根据权利要求33-34中的任一项所述的方法，其中所述凝血系统的状态是通过选自由PT (凝血酶原时间)、混合试验、凝血因子分析和凝血弹性扫描法(TEG或者Sonoclot)组成的组的分析来测量的。
36.根据权利要求33-35中的任一项所述的方法，条件是在使用时不添加钙到所述稳定溶液。
37.一种包含根据权利要求1-18中的任一项所述的稳定溶液的试剂盒。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述稳定溶液以溶液形式或者以冻干的形式提供。
39.根据权利要求37-38中的任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括其用作凝血分析的对照材料的说明。
40.根据权利要求37-39中的任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括其在权利要求33-36中的任一项的方法中的用途的说明。
全文摘要
本发明涉及稳定溶液，所述稳定溶液包括无凝血因子XII并且具有预定量的离子钙的稳定溶液。所述稳定溶液可以被用作凝血分析的对照材料。进一步地，本文涵盖用于产生所述稳定溶液的方法，以及用于评价受治疗者中凝血系统状态的方法和试剂盒。
文档编号G01N33/49GK102753189SQ201180008108
公开日2012年10月24日 申请日期2011年2月8日 优先权日2010年2月8日
发明者托马斯·林达尔, 拉斯·法科萨尔夫 申请人:诺帝克哈莫斯塔西斯公司