专利名称：分子印迹技术应用于地高辛及青霉素的快速检测方法
技术领域：
本发明属于药物检测试剂的制备和应用方法，特别涉及一种分子印迹技术应用于地高辛及青霉素的快速检测方法。
背景技术：
很多不同的技术被用来检测标本中地高辛或青霉素浓度，其中包括放射性免疫测定(RIA)、酶扩大免疫测定技术(EMIT)、荧光极化免疫测定(FPIA)和液相层析质谱等。然而，这些方法多需要昂贵的仪器，操作复杂，时间长，有的还有放射性危害。因此，需要1种快速简便，高灵敏度，价格不贵的检测方法。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种分子印迹技术应用于地高辛及青霉素的快速检测方法。制作简便、成本低、检测快速、特异性高、稳定性好。本发明的技术方案是一种分子印迹技术应用于地高辛及青霉素的快速检测方法，其特征在于印迹聚合物颗粒的制备使用热聚合的方法制备印迹聚合物颗粒取0.2X10_3mM地高辛或青霉素溶液 390μ 1，加入0. 2mM功能单体MAA 780 μ 1，再加入溶剂甲醇3000 μ 1放置在摇床上120rpm、
预作用6h，使模板分子与功能单体充分作用形成复合物；然后加入ImM交联剂EDMA 2000 μ 1,0. Ig致孔剂ΑΙΒΝ，混勻后转入15ml试管中，通N2脱氧lOmin，真空下密封后放入恒温水浴槽中，60°C反应24h形成棒状聚合物；用同样条件，制备无模板分子的空白聚合物 (NIP)；然后将聚合物用研钵粉碎研磨后过60目筛，得到粒径均一的印迹聚合物颗粒；MIPs颗粒使用体积比9 1的甲醇-乙酸的溶液进行超声洗涤，直到洗脱液用紫外分光光度计检测不到模板分子地高辛的残留；之后用甲醇洗去多余的乙酸，再用蒸馏水反复多次洗去多余甲醇，最后将颗粒放入真空干燥器干燥至恒重；涂膜量的优化2μ 1制膜溶液不足以覆盖电极表面，取3μ 1、5μ 1、8μ 1、10μ 1这4个量制备传感
器，用其对地高辛或青霉素分别进行电化学检测，分析涂膜量对试验结果的影响，每个试验要重复3次；印迹聚合膜的制备取20mg印迹颗粒加入到Iml 0. 8%的琼脂糖溶液中，制成20mg/ml的印迹颗粒溶液备用。将直径为3mm的玻碳电极打磨抛光后，依次用乙酸、乙醇、丙酮超声清洗3min，再用蒸馏水超声清洗2遍，每遍;3min。洗好的电极放入PH6. O的PBS溶液中，在-0. 8 2. OV电位下进行活化，直到得到稳定的循环伏安响应；处理好的电极待表面干燥后，取3μ 1印迹聚合物颗粒均勻涂于电极表面，水分蒸发后既在电极表面形成一层印迹聚合物颗粒膜；非印迹聚合膜使用同样的方法制备，只是用非印迹聚合物颗粒替换印迹聚合物颗粒即可。
3
所述的分子印迹技术应用于地高辛及青霉素的快速检测方法，其特征在于电化学检测及标准曲线的绘制用ImM的铁氰化钾溶液来表征电极表面电流的变化；用制备好的印迹聚合膜对地高辛模板进行吸附来检测印迹聚合膜的性能，取地高辛或青霉素浓度为1. 28nM,6. 4nM、 12. 8nM、19. 2nM、25. 6nM、38. 4nM、64nM、102nM、128nM、256nM、384nM、512nM、640nM 这 13 个浓度作为检测浓度，每个浓度的稳定时间为5min，检测玻碳电极表面电流的变化，每个试验重复3次，绘制标准曲线，即物质浓度与相关电流的曲线。本发明特点和效果是本发明是应用分子印迹的方法制备了对地高辛及青霉素有特异性吸附性能的印迹聚合物颗粒，再将颗粒与琼脂糖混合并固定于玻碳电极上制备成地高辛或青霉素分子印迹聚合膜传感器，该传感器可以特异性的结合模板分子-地高辛或青霉素且其电化学信号与模板浓度相关，再用它来检测标本中地高辛或青霉素的含量。该分子印迹传感器是非标记性的，制作简便、成本低、检测快速、特异性高、稳定性好等优点，其检测下限为1^8nM，结果检测时间为5min。分子印迹生物传感器，将分子印迹颗粒与琼脂糖混合后固定到电极上制备成为1 个电化学传感器，不仅制作简单，检测也相当方便，并且灵敏度高，价格便宜。


图1是地高辛印迹聚合膜传感器对不同浓度地高辛的吸附曲线中a 地高辛印迹膜传感器对模板分子地高辛的甲醇溶液吸附；b 地高辛非印迹膜传感器对模板分子地高辛的吸附；c 地高辛印迹膜传感器对模板分子地高辛的血清溶液的吸附。(浓度范围1.观 640nM，检测环境ImM铁氰化钾)
具体实施例方式本分子印迹技术应用于地高辛及青霉素的快速检测方法，包括印迹聚合物颗粒的制备、涂膜量的优化、印迹聚合膜的制备和电化学检测及标准曲线的绘制。1、印迹聚合物颗粒的制备使用热聚合的方法制备印迹聚合物颗粒取0.2X 10_3mM地高辛或青霉素溶液 390μ 1，加入0. 2mM功能单体MAA 780 μ 1，再加入溶剂甲醇3000 μ 1放置在摇床上120rpm、
预作用6h，使模板分子与功能单体充分作用形成复合物。然后加入ImM交联剂EDMA 2000 μ 1,0. Ig致孔剂ΑΙΒΝ，混勻后转入15ml试管中，通N2脱氧lOmin，真空下密封后放入恒温水浴槽中，60°C反应24h形成棒状聚合物。用同样条件，制备无模板分子的空白聚合物 (NIP)。然后将聚合物用研钵粉碎研磨后过60目筛，得到粒径均一的印迹聚合物颗粒。MII^颗粒使用甲醇-乙酸(体积比9 1)的溶液进行超声洗涤，直到洗脱液用紫外分光光度计检测不到模板分子地高辛的残留。之后用甲醇洗去多余的乙酸，再用蒸馏水反复多次洗去多余甲醇，最后将颗粒放入真空干燥器干燥至恒重。2、涂膜量的优化涂膜量对试验有一定的影响。2μ 1制膜溶液不足以覆盖电极表面，取3 μ 1、5 μ 1、 8 μ 1、10 μ 1这4个量制备传感器，用其对地高辛分别进行电化学检测(见1. 2. 4)，分析涂膜量对试验结果的影响(每个试验重复3次)。3、印迹聚合膜的制备取20mg印迹颗粒加入到Iml 0. 8%的琼脂糖溶液中，制成20mg/ml的印迹颗粒溶液备用。将直径为3mm的玻碳电极打磨抛光后，依次用乙酸、乙醇、丙酮超声清洗3min，再用蒸馏水超声清洗2遍，每遍;3min。洗好的电极放入PH6. 0的PBS溶液中，在-0. 8 2. OV电位下进行活化，直到得到稳定的循环伏安响应。处理好的电极待表面干燥后，取3μ 1印迹聚合物颗粒均勻涂于电极表面，水分蒸发后既在电极表面形成一层印迹聚合物颗粒膜。非印迹聚合膜使用同样的方法制备，只是用非印迹聚合物颗粒替换印迹聚合物颗粒即可。2、电化学检测及标准曲线的绘制用ImM的铁氰化钾溶液来表征电极表面电流的变化。用制备好的印迹聚合膜对地高辛模板进行吸附来检测印迹聚合膜的性能，取地高辛或青霉素浓度为1. 28ηΜ,6. 4ηΜ、 12. 8ηΜ、19. 2ηΜ、25. 6ηΜ、38. 4ηΜ、64ηΜ、102ηΜ、128ηΜ、256ηΜ、384ηΜ、512ηΜ、640ηΜ 这 13 个浓度作为检测浓度，每个浓度的稳定时间为5min，检测玻碳电极表面电流的变化(每个试验重复3次)。结果与讨论 电化学检测及标准曲线的绘制制备好的印迹聚合膜依次检测13个浓度，记录电极表面电流值，对其进行分析。 试验结果表明地高辛印迹聚合膜对模板分子有较好的吸附效果，非印迹聚合膜对模板分子的吸附很少，可以忽略不计，见图1是地高辛印迹聚合膜传感器对不同浓度地高辛的吸附曲线。其中a 地高辛印迹膜传感器对模板分子地高辛的甲醇溶液吸附；b 地高辛非印迹膜传感器对模板分子地高辛的吸附；C:地高辛印迹膜传感器对模板分子地高辛的血清溶液的吸附。(浓度范围 1. 28 ~ 640nM,检测环境ImM铁氰化钾)
权利要求
1.一种分子印迹技术应用于地高辛及青霉素的快速检测方法，其特征在于印迹聚合物颗粒的制备使用热聚合的方法制备印迹聚合物颗粒取0. 2乂10_3!111地高辛或青霉素溶液39(^1， 加入0. 2mM功能单体MAA 780 μ 1，再加入溶剂甲醇3000 μ 1放置在摇床上120rpmJ9°C预作用他，使模板分子与功能单体充分作用形成复合物；然后加入ImM交联剂EDMA 2000 μ 1, 0. Ig致孔剂ΑΙΒΝ，混勻后转入15ml试管中，通N2脱氧lOmin，真空下密封后放入恒温水浴槽中，60°C反应24h形成棒状聚合物；用同样条件，制备无模板分子的空白聚合物(NIP)；然后将聚合物用研钵粉碎研磨后过60目筛，得到粒径均一的印迹聚合物颗粒；MII^颗粒使用体积比9 1的甲醇-乙酸的溶液进行超声洗涤，直到洗脱液用紫外分光光度计检测不到模板分子地高辛的残留；之后用甲醇洗去多余的乙酸，再用蒸馏水反复多次洗去多余甲醇，最后将颗粒放入真空干燥器干燥至恒重；涂膜量的优化2μ 1制膜溶液不足以覆盖电极表面，取3μ 1、5μ 1、8μ 1、10μ 1这4个量制备传感器，用其对地高辛或青霉素分别进行电化学检测，分析涂膜量对试验结果的影响，每个试验要重复3次；印迹聚合膜的制备取20mg印迹颗粒加入到Iml 0. 8%的琼脂糖溶液中，制成20mg/ml的印迹颗粒溶液备用。将直径为3mm的玻碳电极打磨抛光后，依次用乙酸、乙醇、丙酮超声清洗3min，再用蒸馏水超声清洗2遍，每遍;3min。洗好的电极放入PH6. O的PBS溶液中，在-0. 8 2. OV电位下进行活化，直到得到稳定的循环伏安响应；处理好的电极待表面干燥后，取3μ 1印迹聚合物颗粒均勻涂于电极表面，水分蒸发后既在电极表面形成一层印迹聚合物颗粒膜；非印迹聚合膜使用同样的方法制备，只是用非印迹聚合物颗粒替换印迹聚合物颗粒即可。
2.根据权利要求1所述的分子印迹技术应用于地高辛及青霉素的快速检测方法，其特征在于电化学检测及标准曲线的绘制·1.用ImM的铁氰化钾溶液来表征电极表面电流的变化；用制备好的印迹聚合膜对地高辛或青霉素进行吸附来检测印迹聚合膜的性能，取地高辛或青霉素浓度为1. 28ηΜ,6. 4ηΜ、 12. 8ηΜ、19. 2ηΜ、25. 6ηΜ、38. 4ηΜ、64ηΜ、102ηΜ、128ηΜ、256ηΜ、384ηΜ、512ηΜ、640ηΜ 这 13 个浓度作为检测浓度，每个浓度的稳定时间为5min，检测玻碳电极表面电流的变化，每个试验重复3次，绘制物质浓度与相关电流的标准曲线。
全文摘要
一种分子印迹技术应用于地高辛及青霉素的快速检测方法，先制备对地高辛及青霉素有特异性吸附性能的印迹聚合物颗粒，再将颗粒与琼脂糖混合并固定于玻碳电极上制备成地高辛分子印迹聚合膜传感器，该传感器可以特异性的结合模板分子-地高辛或青霉素且其电化学信号与模板浓度相关，再用它来检测标本中地高辛或青霉素的含量。该分子印迹传感器是非标记性的，制作简便、成本低、检测快速、特异性高、稳定性好等优点，其检测下限为1.28nM，结果检测时间为5min。
文档编号G01N27/26GK102175733SQ20101060196
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者张娟琨 申请人:天津前方科技有限公司