专利名称：氨(氨离子)的测定方法与氨(氨离子)诊断/测定试剂盒的制作方法
氨(氨离子)的测定方法与氨(氨离子)诊断/测定试剂
合 Sl
技术领域：
本发明涉及医学/食品/环境检验测定技术领域，更具体地，本发明涉及氨(氨离子)诊断/测定方法及其试剂盒。
背景技术：
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。扩散法是标本碱化后，释放出NH3,用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8% 13% ’离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引起电极的pH发生变化进行测定，该方法的CV为 3. 5% 4. 8%，回收率高。结合具体实际，应以酶法测定为实用。检索中国专利，仅查出87105593. 7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。

发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种氨(氨离子)的测定方法。本发明的另一个目的是提供一种氨(氨离子)诊断/测定试剂盒。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明的方法是一种采用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶(偶)联法(Couple Reaction)的联用技术， 利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处的吸光度变化测定氨(氨离子)的方法。本发明氨(氨离子)测定方法的的技术原理是根据下述铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶的系列催化反应完成氨+2水+6氧化型铁氧还蛋白铁氧还蛋白亚硝酸还原酶亚硝酸+6还原型铁氧还蛋白亚硝酸+3还原型辅酶亚硝酸还原酶氢氧化键+3辅酶+水本发明的方法利用铁氧还蛋白亚硝酸还原酶(ferredoxin-nitrite reductase ； ECl. 7. 7. 1)酶(偶)联亚硝酸还原酶(nitrite reductase ；EC 1. 7. 1. 4)酶促反应连续监测法。铁氧还蛋白亚硝酸还原酶作为作用酶，功能为将氨(氨离子)酶解产生亚硝酸。亚硝酸还原酶作为循环酶亚硝酸还原酶再将亚硝酸再次变回氨(氢氧化铵/氨离子)，使氨 (氨离子)不断地被重复循环利用。亚硝酸还原酶又作为显色酶，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm 处吸光度下降的速度，这样可以通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算氨(氨离子)的浓度大小。本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种氨(氨离子)的测定方法。该氨(氨离子)测定方法的步骤如下A、样品准备A. 1标准样品的制备将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中，再将氨浓度调整到100微摩尔/升，得到的溶液作为标准样品；A. 2待测样品的制备待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；A. 3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其氨(氨离子)浓度为0微摩尔/升；B、试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氧化型铁氧还蛋白，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是 20-500mmol/L、0. 001_7mol/L、0. 1-0. 35mmol/L, 1000-80000U/L, 1000-80000U/ L 与 l-100mmol/L ；C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化；E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)空白样品的吸光度随时间的变化；F、数据处理由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到
氨的含量
权利要求
1.一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的氨(氨离子)浓度测定方法，其测定的技术原理是根据下述铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶的系列催化反应完成氨+2水+6氧化型铁氧还蛋白铁氧还蛋白亚硝酸还原酶亚硝酸+6还原型铁氧还蛋白亚硝酸+3还原型辅酶亚硝酸还原酶氢氧化键+3辅酶+水
2.一种氨(氨离子)的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下 2. 1样品准备2. 1. 1标准样品的制备将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中，再将其浓度调整到100微摩尔/升； 2. 1.2待测样品的制备待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中； 2. 1.3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其氨(氨离子)浓度为0微摩尔/升； 2. 2试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氧化型铁氧还蛋白，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是 20-500mmol/L、0. 001_7mol/L、0. 1-0. 35mmol/L, 1000-80000U/L, 1000-80000U/L 与 l-100mmol/L ；2. 3待测样品与在步骤2. 2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制，可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；2. 4在与步骤2. 3)同样的条件下测定步骤2. 1. 1)标准样品的吸光度随时间的变化； 2. 5在与步骤2. 3)同样的条件下测定在步骤2. 1. 3)使用的水或缓冲液作为空白溶液的吸光度随时间的变化；2.6数据处理由步骤2. 3-2. 5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到氨的含量
3.根据权利要求1、2所述的测定方法，其特征在于使用全自动生化分析仪测定时，待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条件下进行测定测定方法为速率法，温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为负反应，延迟时间 1/0分钟，检测时间4/5分钟。
4.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于，所述的稳定剂是一种或多种选自氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠、叠氮钠等防腐剂的稳定剂；所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液；所述的还原型辅酶是一种或多种选自NADPH、NADH或thio_NADH的还原型辅酶。
5.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于 5. 1所述的试剂溶液配制成如下单剂试剂它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氧化型铁氧还蛋白、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶与亚硝酸还原酶组成的；5. 2所述的试剂溶液配制成如下双剂试剂试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氧化型铁氧还蛋白组成的； 试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶与亚硝酸还原酶组成的；其中还原型辅酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氧化型铁氧还蛋白在试剂 1或试剂2中的位置是不限定的。5.3所述的试剂配制成如下三剂试剂试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氧化型铁氧还蛋白组成的； 试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂与亚硝酸还原酶组成的； 试剂3，它是由所述的缓冲液、稳定剂与铁氧还蛋白亚硝酸还原酶组成的； 其中还原型辅酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氧化型铁氧还蛋白在试剂 1、试剂2或试剂3中的位置是不限定的。
6.一种氨(氨离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于6. 1它由下述粉状试剂组成，在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L还原型辅酶0. 1-0. 35mmol/L铁氧还蛋白亚硝酸还原酶1000-80000U/L亚硝酸还原酶1000-80000U/L氧化型铁氧还蛋白1-lOOmmol/L。6. 2根据权利要求6. 1所述的氨(氨离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于它有组成如下的试剂1 :缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L还原型辅酶0. 1-0. 35mmol/L氧化型铁氧还蛋白1-lOOmmol/L;组成如下的试剂2 缓冲液稳定剂铁氧还蛋白亚硝酸还原酶亚硝酸还原酶·6. 3根据权利要求6. 1所述的氨(氨离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于它有组成20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/Lc如下的试剂1 : 缓冲液稳定剂还原型辅酶氧化型铁氧还蛋白组成如下的试剂2 缓冲液稳定剂亚硝酸还原酶组成如下的试剂3 缓冲液稳定剂铁氧还蛋白亚硝酸还原酶20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.1-0. 35mmol/L l-100mmol/L ；20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L ；20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L。
全文摘要
本发明涉及利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的氨(氨离子)含量的测定方法、试剂的组成及成分，其测定的技术原理是依据铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶的系列催化反应完成，本发明还涉及一种氨(氨离子)诊断/测定试剂盒。本发明的测定方法灵敏度高、误差小，因此本发明的测定方法与试剂盒可以广泛地应用于临床医学/食品/环境检验。
文档编号G01N33/50GK102297940SQ20101021054
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月23日 优先权日2010年6月23日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司