专利名称：一种新型人脑红蛋白检测及诊断试剂盒，其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫检测及诊断试剂，具体涉及一种新型人脑红蛋白酶联免疫检测及诊断试剂盒，还涉及其制备方法及用途。
背景技术：
脑红蛋白(Neuroglobin，NGB)是体内除了血红蛋白和肌红蛋白之外的第三类重要的携氧蛋白，在神经系统中特异表达，广泛分布于脑组织内。和肌红蛋白一样，脑红蛋白能可逆地结合氧，且与氧有很高的亲和力。肌红蛋白在正常人血清内含量极微，当心肌和骨骼肌损伤时，肌红蛋白可从受损细胞释放，快速入血，导致血清肌红蛋白升高。肌红蛋白已成为临床上一些重要疾病如心肌梗塞、肾功能衰竭等敏感而又特异的生化诊断指标。脑红蛋白和肌红蛋白在功能和性质上具有严格的相似性脑红蛋白有151个氨基酸，分子量为17千道尔顿，而肌红蛋白则有154个氨基酸，分子量也为17千道尔顿。鉴于脑红蛋白与肌红蛋白在功能上具有严格的相似性，即肌红蛋白负责心肌和骨骼肌的氧供应，脑红蛋白则负责脑的氧供应，两者均能从损伤细胞中释放入血，因此，脑红蛋白在老年性痴呆、脑梗塞、创伤性脑损伤等涉及到神经元损伤和变性死亡等疾病的早期诊断中具有潜在的诊断价值，同时对上述疾病治疗过程中的病程跟踪也具有重要的参考价值。

发明内容
本发明提供了一种新型人脑红蛋白酶联免疫测定试剂盒。该试剂盒是由96孔酶标板一块，脑红蛋白标准品1瓶、脑红蛋白单克隆抗体1瓶，脑红蛋白多克隆抗体1瓶、辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗兔免疫球蛋白(IgG)1瓶、邻苯二胺(OPD)2瓶、20倍的浓缩洗涤液1瓶终止液(2M的硫酸溶液(H2SO4))1瓶组成。其中HRP-羊抗兔IgG为中山公司产品。本发明还公开了试剂盒的制备方法、使用方法及其用途。
用途 本试剂盒具有较高的灵敏度，可用于检测样品中脑红蛋白的含量，并可为老年性痴呆、脑梗塞、创伤性脑损伤等涉及到神经元损伤和变性死亡等疾病中的早期诊断及治疗过程中的病程跟踪提供有效的检测手段。
制备方法 本试剂盒的使用需要以下自备试剂1)包被稀释液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)Na2CO31.5g+NaHCO32.9g溶于双蒸水，加双蒸水补充体积至1000ml。
2)磷酸盐缓冲液(PBS，0.02M，pH7.4)NaCl 16.0g+NaH2PO4·2H2O 0.593g+Na2HPO4·12H2O 5.8g，加双蒸水至2000ml。
3)样本稀释液PBS 100ml+0.1g BSA+50μl Tween 20。
4)封闭液(5％脱脂乳-PBS溶液)50g脱脂乳+PBS至1000ml。
5)底物缓冲液A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)柠檬酸19.2g，加双蒸水至1000ml；B液(0.2mol/L Na2HPO4)Na2HPO4·12H2O 71.7g，加双蒸水至1000ml；临用前取A液24.3ml、B液25.7ml混合。
6)30％H2O2500ml。
本试剂盒具体的制备方法1)抗原的制备将构建有脑红蛋白基因编码区的原核表达载体pGEX-4T-2转化大肠杆菌BL21，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-1-thio-D-galactopyranoside，IPTG)诱导表达，获得可溶性表达产物，用谷胱甘肽S-转移酶(GST)亲和层析柱纯化后作为抗原(图1，图2)。
2)抗体的制备将1)中制备的抗原免疫Balb/c小鼠，通过传统的细胞融合方法制备抗NGB单克隆抗体，同时免疫家兔制备抗NGB多克隆抗体(图3，图4)。
3)抗体的纯化将2)中所得的抗体经离心、沉淀、脱盐、得粗提抗体，然后经Protein G柱亲和纯化，即得纯化抗体。
4)试剂盒的制备将试剂盒8种成份，按试剂盒需要量分装在小瓶或尖底离心管中。
5)鉴定试剂盒的特异性、灵敏度、精密度、稳定性合格(图7)。
使用方法 本试剂盒的使用方法如下1)抗体的包被将包被液稀释的抗脑红蛋白的单克隆抗体(10μg/ml)加入96孔酶标板中，每孔100μl，4℃过夜，洗涤液洗涤1次，每次3分钟。加入封闭液200μl/孔，40℃封闭50～60分钟(或4℃过夜)。封闭结束后用洗涤液洗板3次，每次3分钟。
2)加入样品将含有通过0.1％ BSA和0.05％吐温(Tween)20样品稀释液适当稀释的待测样品和标准NGB蛋白(5.76ng/ml、28.8ng/ml、144ng/ml、720ng/ml、3.6μg/ml、18μg/ml)分别加入酶标反应板(100μl/孔)，置于40℃温箱孵育1小时。弃去孔中液体，洗涤液洗板3次，每次3分钟。
3)加入兔抗脑红蛋白多克隆抗体取含有0.1％ BSA和0.05％吐温20样品稀释液最适稀释的兔抗脑红蛋白多克隆抗体(1∶500)，加入酶标板中(100μl/孔)，置于40℃温箱孵育30分钟。弃去孔中液体，洗涤液洗板3次，每次3分钟。
4)加入HRP-羊抗兔IgG取最适稀释HRP-羊抗兔IgG(1∶5000)，加入酶标板中100μl/孔，置于40℃温箱孵育40分钟。弃去孔中液体，洗涤液洗板3次，每次3分钟。
5)显色取底物液A液24.3ml和B液25.7ml混合，加入邻苯二胺至浓度4～10mg/ml，最后加入30％H2O2溶液25～50μl。取新鲜配制的底物缓冲液100μl/孔加入反应板。室温避光反应5～10分钟。
6)终止反应当阳性对照出现明显颜色变化或阴性对照略有显色时，每孔加入终止液50μl终止反应。
7)结果计算在492nm处测定光吸收值(A)。以标准蛋白浓度作为横坐标，测得的标准蛋白孔A492nm值为纵坐标，绘制标准曲线。通过标准曲线查得待测样品的脑红蛋白含量，再乘以稀释倍数，即得待测样品中的实际含量。


图1融合蛋白GST-NGB的表达结果。泳道1转染空载体pGEX-4T-2后大肠杆菌E.coli(DE3)中表达的总蛋白；泳道2用GST亲和柱纯化转染空载体pGEX-4T-2后大肠杆菌E.coli(DE3)中表达的蛋白，获得GST蛋白样品。泳道3转染表达载体pGEX-4T-2/NGB后大肠杆菌E.coli(DE3)中表达的总蛋白；泳道4用GST亲和柱纯化获得的GST-NGB融合蛋白；泳道5蛋白质中分子量标记。
图2GST-NGB经过凝血酶酶切后，得到的NGB蛋白。泳道1蛋白质中分子量标记；泳道2GST-NGB经过凝血酶酶切后，得到的NGB样品。
图3小鼠抗NGB单克隆抗体的质量鉴定。应用Western blotting技术对获得的单抗进行检测，证明单克隆抗体具有很高的特异性，各株抗体均能与NGB和GST-NGB结合，而与GST及菌体蛋白无反应，而且特异性地检测到NGB的真核表达产物(GFP-NGB)。
图4本试剂盒中所制备的小鼠抗NGB单克隆抗体的亚型鉴定。经鉴定，确认四株抗NGB单克隆抗体3G8，3H2，2E7，1E12的重链均为IgG1，轻链为κ链。
图5兔抗NGB多克隆抗体的质量鉴定兔抗NGB多克隆抗体能够检测到真核细胞中表达的NGB蛋白。方法分别用表达载体pcDNA3.1/V5/6×His/NGB、pcDNA3.1/V5/6×His/LacZ和空载体转染COS-7细胞后，收集转染48h后的细胞总蛋白，Western blotting检测。泳道1兔抗NGB多克隆抗体可检测到约20kDa的条带；泳道2阴性对照，空载体转染COS7细胞用兔抗NGB多克隆抗体未能检测到任何条带；泳道3用抗6×His单克隆抗体可检测到NGB-6×His融合表达蛋白；泳道4阳性对照用抗6×His单克隆抗体可检测到LacZ-6×His融合表达蛋白。
图6兔抗NGB多克隆抗体的质量鉴定。用本试剂盒中所制备的兔抗NGB多克隆抗体检测NGB在成年大鼠脑中的组织分布，可见NGB免疫反应阳性细胞广泛分布于海马的各区(CA1、CA2、CA3、CA4)锥体细胞层和小脑蒲肯野细胞及其细胞突起中。
图7本试剂盒的标准曲线。可检测NGB浓度的浓度范围在5.76ng/ml～18μg/ml。
权利要求
1.一种新型人脑红蛋白检测及诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒主要由96孔酶标板1块，脑红蛋白标准品1瓶、脑红蛋白单克隆抗体1瓶，脑红蛋白多克隆抗体1瓶、阴性对照1瓶、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G1瓶、邻苯二胺2瓶、20倍浓缩洗涤液1瓶和终止液(2M硫酸溶液(H2SO4))1瓶组成。
2.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)抗原的制备将构建有脑红蛋白基因编码区的原核表达载体转化大肠杆菌，获得可溶性表达产物，亲和层析柱纯化后作为抗原。2)抗体的制备将1)中制备的抗原免疫Balb/c小鼠，通过传统的细胞融合方法制备抗脑红蛋白单克隆抗体，同时免疫家兔制备抗脑红蛋白多克隆抗体。3)抗体的纯化将2)中所得的单克隆抗体经离心、沉淀、脱盐、得粗提抗体，然后经亲和纯化，即得纯化抗体。4)试剂盒的组装将组成试剂盒的8种成份，按试剂盒需要量分装在小瓶或尖底离心管中。5)鉴定试剂盒的特异性、灵敏度、精密度、稳定性。
3.权利要求1所述的一种新型人脑红蛋白检测及诊断试剂盒，其特征在于所能够检测的脑红蛋白的浓度范围为5.76ng/ml～18μg/ml。
4.权利要求1所述的一种新型人脑红蛋白检测及诊断试剂盒，其特征在于其中所述的阴性对照液为正常人血清，浓洗涤液为磷酸-Tween-20。
5.权利要求1所述的一种新型人脑红蛋白检测及诊断试剂盒，在检测脑红蛋白中的用途。
全文摘要
本发明提供了一种新型人脑红蛋白检测及诊断试剂盒，其制备方法及用途。该试剂盒主要由固相载体以及脑红蛋白的单克隆抗体、多克隆抗体和脑红蛋白标准品等组成；该试剂盒的制备方法包括抗原和抗体的制备、抗体的纯化、试剂盒的包装等步骤。本试剂盒具有较高的灵敏度，可用于检测样品中脑红蛋白的含量，并可为老年性痴呆、脑梗塞、创伤性脑损伤等涉及到神经元损伤和变性死亡等疾病中的早期诊断及治疗过程中的病程跟踪提供有效的检测手段。
文档编号G01N33/72GK1641351SQ20031011350
公开日2005年7月20日 申请日期2004年1月16日 优先权日2004年1月16日
发明者张成岗, 陈婷方, 王春丽, 高艳, 孙建伟, 韩洪彦, 徐文琳, 王航雁 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所