专利名称：生长激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种生长激素(GH)磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
生长激素(growth hormone,GH)是腺垂体细胞分泌的蛋白质,是一种肽类激素，由191个氨基酸组成的单肽链，分子量22kD。正常情况下，生长激素呈脉冲式分泌，受下丘脑产生的生长激素释放素的调节，还受性别、年龄和昼夜节律的影响，睡眠状态下分泌明显增力口。生长激素的主要生理功能是促进神经组织以外的所有其他组织生长；促进机体合成代谢和蛋白质合成；促进脂肪分解；对胰岛素有拮抗作用；抑制葡萄糖利用而使血糖升高等作用。血清生长激素测定有助于巨人症、肢端肥大症、遗传性生长激素生成缺陷所致的生长 激素缺乏症诊断。目前常用的检测生长激素(GH)的方法有放射免疫分析技术(RIA)和酶联免疫分析法(ELISA)，但是这两种方法存在诸多不足，例如RIA存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，时间长等缺点；而ELISA灵敏度低，检测范围窄；随着标记免疫技术的迅速发展，各种新的检测方法层出不穷，其中化学发光免疫分析(CLIA)是将化学发光和酶免疫分析结合在此技术上发展起来的，是当今最为敏感的微量免疫测定法。化学发光免疫分析和磁微粒技术结合，与以微孔板为固相载体的生长激素(GH)化学发光试剂盒相比，具有以下优势(1)以磁微粒为固相载体，大大增加了抗体的有效包被量，节约了抗体的用量，从而节约了成本；(2)以磁微粒为固相载体包被抗体，增加了抗原-抗体的接触面积，及发光面积，提高了反应的灵敏度；(3)反应在液相中进行，且利用旋转磁场使磁微粒其搅拌作用，大大缩短了反应时间；(4)在反应过程中引入了生物素-亲和素系统(biotin-avidin system, BAS),它是70年代末发展起来的一种新型反应放大系统，由于具有与标记试剂高亲和力的牢固结合、多级放大效应，使其具有灵敏度高、特异性好、稳定性高的特点，目前已成为广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术，但是磁微粒化学发光分析方法还没有广泛用于GH的检测，特别是广泛用于临床。

发明内容
本发明要解决的问题是提供GH的磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，避免了放射性免疫分析的试剂有效期短、存在放射性污染、操作繁琐等缺点，且解决了灵敏度低，检测范围窄，成本高的缺陷。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是生长激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括GH校准品，校准品浓度为0，0. 5，1. 5,5,15，50ng/mL，校准品稀释液为含有50%牛血清的PBS缓冲液；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的GH抗体；GH抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ ^ 3. O,活性彡250U/mL ；GH质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。进一步，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲。A液为O. 7g/L鲁米诺，O. 165g/L对碘酚，缓冲液为pH8. 6的5mmol/L Tris · HCl，避光保存；B液为O. 675g/L过氧化脲，用工艺用水配制。进一步，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径l-2um。进一步，所述的GH质控品包括低值质控品和闻值质控品。进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。试剂盒的制备方法，包括以下步骤
(I)GH校准品的配制将GH纯品用含有50%牛血清的PBS缓冲液稀释成系列梯度，浓度分别为0，0. 5，
1.5,5,15,50ng/mLo(2)GH质控品的配制将GH抗原用含有50%牛血清的PBS缓冲液稀释至低值质控品浓度为3. 4^4. 6ng/mL和高值质控品浓度为21. 6 32. 4ng/mL ；(3)磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备取IOOmLO. lmol/L 2_吗啉乙磺酸溶液(MES溶液)，依次加入IOmg磁性颗粒和3mg链酶亲和素(SA),搅拌30min,然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液(1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基，EDC) 3. 5uL，反应Ih后，使用磁力架吸附，静止lOmin，移去液体，加入IOmLO. 01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0. 01mol/L PBS定溶至IL即可。(4)生物素标记的GH抗体的制备取0. 5mg GH抗体，用硼酸盐缓冲液在2 8°C下透析I 3h ;将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uLlmol/L氯化铵溶液，常温避光反应30 60min ;用0. 01mol/L PBS溶液在2 8°C下透析2天，期间换液3 5次；(5) GH抗体酶结合物的制备采用高碘酸钠氧化法将GH抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至1: 12000，并加入5-20%酶稳定剂，储存于2 8°C。酶稳定剂是一种可以保持蛋白质在冻干或溶液下保持天然折叠构想的试剂，有利于抗原或抗体的保存，避免外界因素如温度、pH、盐、金属离子及其他污染物影响其稳定性。(6) 20倍浓缩洗液的配制20浓缩洗液包括58gL磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，IOmL/LTween-20 和 1%。Proclin300 ；(7)化学发光液A液和B液的配制A 液为 0. 7g/L 鲁米诺，0. 165g/L 对碘酚，缓冲液为 ρΗ8· 6 的 5mmol/L Tris · HCl，避光保存液为0. 675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；(8)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ；(9)对采用该方法制的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。
本发明的原理是，本试剂盒采用夹心法原理测定血清或血浆中的GH，在亲和素-磁微粒悬浮液中加入生物素-GH抗体结合物，通过亲和素和生物素的亲和反应，形成磁微粒-亲和素-生物素-GH抗体复合物，加入样本和酶后，会通过抗原抗体反应，形成了磁微粒-亲和素-生物素-GH抗体-GH-GH抗体-HRP复合物，用磁场将复合物吸附在试管底部，清洗掉游离的成分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5分钟测定各加样孔的发光值(RLU)。样本的发光值与样本中GH浓度呈正相关。样本中的GH浓度依据由校准品GH浓度和对应的RLU建立的Log (X) -Log (Y)数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的GH含量。本专利发明的生长素(GH)磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒，具有以下优点
(I)反应快速，可在40分钟内判断检测结果；操作简便，无污染。(2)灵敏度高，本试剂盒的分析灵敏度不高于O. 2ng/mL。(3)特异性强，催乳素(PRL)、促黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)的交叉反应系数小于1%。(4)精密度良好，精密度不高于10%。(5)稳定性良好，本产品在37°C可存放7天以上，在2 8°C可存放I年。(6)成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用价值。(7)本试剂盒与管式化学发光仪配套使用，在样本测定过程中灵活性更好。


图1是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定GH与放免试剂盒测定GH的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的GH值，横坐标为放免试剂盒测定GH值，两种方法相关系数(r) =0. 9945，直线方程 y=0. 9891x+0. 159具体实施例方式实施例1:制备生长激素(GH)磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒I
(I)GH校准品的配制将GH纯品用含有50%牛血清的PBS缓冲液稀释成系列梯度，浓度分别为0，0. 5，
1.5,5,15,50ng/mLo(2) GH质控品的配制将GH抗原用含有50%牛血清的PBS缓冲液稀释至低值质控品浓度为3. 4ng/mL和高值质控品浓度为32. 4ng/mL ；(3)磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备取IOOmLO. lmol/L 2-吗啉乙磺酸溶液(MES溶液)，依次加入IOmg磁性颗粒和3mg链酶亲和素(SA),搅拌30min,然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液(1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基，EDC) 3. 5uL，反应Ih后，使用磁力架吸附，静止lOmin，移去液体，加入IOmL0. 01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0. 01mol/L PBS定溶至IL即可。(4)生物素标记的GH抗体的制备取0. 5mg GH抗体，用硼酸盐缓冲液在2 8°C下透析Ih ;将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uLlmol/L氯化铵溶液，常温避光反应60min ;用0. 01mol/L PBS溶液在2 8°C下透析2天，期间换液4次；(5) GH抗体酶结合物的制备采用高碘酸钠氧化法将GH抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至1:12000，并加入5%酶稳定剂，储存于2 8°C。酶稳定剂使用SurModics InVitroTechnologies的蛋白稳定剂产品。(6) 20倍浓缩洗液的配制20浓缩洗液包括58gL磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，IOmL/LTween-20 和 1%。Proclin300 ；(7)化学发光液A液和B液的配制A 液为 O. 7g/L 鲁米诺，O. 165g/L 对碘酚，缓冲液为 ρΗ8· 6 的 5mmol/L Tris · HCl，避光保存液为O. 675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；(8)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ；(9)对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。说明I)物理检查液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。2)准确性试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定，用双对数数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不明显偏离平行(t检验，111〈2. 447);以GH企业标准品为对照品，用双对数数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在O. 90 1· 10范围内。3)剂量-反应曲线的线性用双读数数学模型拟合，剂量-反应曲线在O 50ng/mL浓度范围内相关系数r绝对值不低于O. 9900。4)分析灵敏度试剂盒分析灵敏度不高于O. 2ng/mL。5)精密度不精密度(CV%)应不高于10%。6)质控品的测定值平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Log(Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为3. Γ4. 6ng/mL和21. 6 32. 4ng/mL。7)特异性交叉反应符合下表要求
权利要求
1.生长激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)GH校准品；校准品浓度为0，0.5，1. 5,5,15，50ng/mL，校准品稀释液为含有50%牛血清的PBS缓冲液；2)偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；3)生物素标记的GH抗体；4)GH抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ^ 3. O,活性彡 250U/mL ；5)GH质控品；所述质控品包括低值质控品和高值质控品，浓度分别是3.Γ4. 6ng/mL和21.6 32. 4ng/mL ；6)化学发光液A液和B液；7)20倍浓缩洗液；8)反应管。
2.根据权利要求1所述的生长磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲。
3.根据权利要求1所述的生长激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径l-2um。
4.根据权利要求1所述的生长激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。
5.一种制备所述权利要求1的试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤(1)GH校准品的配制将GH纯品用含有50%牛血清的PBS缓冲液稀释成系列梯度，浓度分别为O，O. 5，1. 5，5， 15,50ng/mL ；(2)GH质控品的配制将GH抗原用含有50%牛血清的PBS缓冲液稀释至低值质控品浓度为3. Γ4. 6ng/mL和高值质控品浓度为21. 6^32. 4ng/mL ；(3)磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备取IOOmLO. lmol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入IOmg磁性颗粒和3mg链酶亲和素，搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液3. 5uL，反应Ih后，使用磁力架吸附，静止 lOmin，移去液体，加入IOmL O. 01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0. 01mol/L PBS定溶至IL即可；(4)生物素标记的GH抗体的制备取0. 5mg GH抗体，用硼酸盐缓冲液在2 8°C下透析I 3h ;将透析后的抗体加入25ug 生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入 250uLlmol/L氯化铵溶液，常温避光反应30 60min ;用0. 01mol/L PBS溶液在2 8°C下透析2天，期间换液3 5次；(5)GH抗体酶结合物的制备采用高碘酸钠氧化法将GH抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至1:12000，并加入5-20%酶稳定剂，储存于2 8°C ；(6)20倍浓缩洗液的配制.20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5. 92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，IOmL/ LTween-20 和 1%。Proclin300 ；(7)化学发光液A液和B液的配制A液为O. 7g/L鲁米诺，O. 165g/L对碘酚，缓冲液为ρΗ8· 6的5mmol/L Tris · HCl，避光保存液为O. 675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；(8)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C；(9)对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。
全文摘要
本发明公开了一种生长激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括GH校准品，GH校准品浓度为0，0.5，1.5，5，15，50ng/mL，校准品稀释液为含有50%牛血清的PBS缓冲液；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的GH抗体；GH抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；GH质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。另外本发明还公开了本发明试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、成本低、稳定性好等优点。
文档编号G01N33/74GK102998466SQ20121047335
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者刘萍, 范利花 申请人:博奥赛斯(天津)生物科技有限公司