专利名称：一种检测蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测蛋白的方法。
背景技术：
人血清蛋白质种类繁多，成份复杂，在人体健康和疾病过程中起着非常重要的作用。聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前为止普遍使用的分析分离血液蛋白的方法，在血清蛋白质组学研究中是一个非常重要的分离手段。用于凝胶蛋白区带的检测识别方法有很多种，包括有机染料染色法(如考马斯亮兰、氨基黑、刚果红等)、银染色法、荧光染色法和化学法光成像法等。而这些方法都有其一定局限性，包括有机染料的费时和低灵敏性、银染的复杂及冗长的步骤、荧光染料的发射光谱窄等。因而，需要发展一种简单、快速、高灵敏的多种蛋白质同时检测的凝胶成像新方法。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测蛋白的方法。本发明所提供的检测蛋白的方法，包括如下步骤1)将待测蛋白进行凝胶电泳，使待测蛋白得到分离，并以条带形式或点的形式分布在凝胶上，将得到的凝胶记作带有蛋白条带或蛋白点的凝胶；2)将所述带有蛋白条带或蛋白点的凝胶置于量子点溶液中，浸泡，所述量子点与所述带有蛋白条带或蛋白点的凝胶中的蛋白条带或蛋白点结合，得到蛋白条带-量子点结合体或蛋白点_量子点结合体，将得到的凝胶记作带有蛋白_量子点结合体的凝胶；3)将所述带有蛋白_量子点结合体的凝胶进行凝胶成像实现所述待测蛋白的检测。所述量子点溶液为如下1)、2)或3)所示1)所述量子点溶液是按照包括如下步骤的方法配制得到的将所述量子点溶于水中，再调节PH值至3. 6-4. 4，具体为3. 6、3. 7或4. 4，得到所述量子点溶液；所述量子点在所述量子点溶液中的浓度为0. ImM-O. 3mM,具体为0. lmM、0. 2mM或0. 3mM ；2)所述量子点溶液由所述量子点、可溶性碱和水组成，所述量子点在所述量子点溶液中的浓度为0. 2mM-0. 325mM，具体为0. 2mM、0. 27mM或0. 325mM，所述可溶性碱在所述量子点溶液中的浓度为1. 8-3. Omol/L，具体为1. 8mol/L、2. lmol/L或3. Omo 1/L ；3)所述量子点溶液由所述量子点、可溶性碱、N, N, N’，N’ -四甲基乙二胺和水组成，所述量子点在所述量子点溶液中的浓度为0. 2mM-0. 325mM,具体为0. 2mM、0. 27mM或 0. 325mM,所述可溶性碱在所述量子点溶液中的浓度为1. 8-3. Omol/L,具体为1. 8mol/L、 2. lmol/L或3. Omol/L，所述N，N, N’，N’ -四甲基乙二胺在所述量子点溶液中的浓度为 9. 9mM-26. 5mM,具体为 9. 9mM、17. 9mM 或 26. 5mM。上述过程中，所述1)所示的量子点溶液中，是用巯基乙酸或巯基乙酸的水溶液调节PH值的，所述巯基乙酸在所述量子点溶液中的浓度为0. 4% -0. 6% (体积百分含量)，具体为 0. 4%、0. 5%或 0. 6% ；所述2~)所示的量子点溶液中，所述可溶性碱为氢氧化钠或氢氧化钾；所述幻所示的量子点溶液中，所述可溶性碱为氢氧化钠或氢氧化钾。上述过程中，所述浸泡的时间为lh_4h，具体为lh、2h或4h。上述过程中，所述量子点溶液为所述1)所示，所述浸泡的时间为池或4h ；所述量子点溶液为所述幻所示，所述浸泡的时间为Ih ；所述量子点溶液为所述幻所示，所述浸泡的时间为lh。上述过程中，所述量子点的结构如下所述量子点由核心层和壳层组成，核心层为碲化镉，壳层为巯基乙酸，壳层通过静电作用覆盖于核心层的周围；静电作用是指巯基乙酸中带孤对电子的S与CdTe中带正电荷的Cd之间形成的静电作用；和/或，所述量子点的粒径为3-5nm ；和/或，所述量子点的发射波长为520nm ；和/或，所述量子点的激发波长为 250nm-380nmo上述过程中，所述量子点是按照包括如下步骤的方法得到的1)将0. 1276g碲粉溶于IOmL水中，磁搅拌，充氮气15-20min，得到溶液I ；2)向溶液I中加入0. 08gNaBH4，在充氮气的条件下反应4h，得到溶液II，溶液II 分上层清液和下层沉淀；3)将 0. 45672gCdCl2 · 2. 5H20 和 420 μ L 巯基乙酸加入 200mL 水中，搅拌，用 NaOH 调节PH值至9. 2，在充氮气的条件下反应30min，得到溶液III ；4)将所述溶液II中上层清液加入所述溶液III中，在充氮气的条件下反应 30min，得到溶液IV ；5)将溶液IV置于80度且密封条件下反应3. 5h,得到所述量子点；所述充氮气的速度为0.8L/min。上述过程中，所述凝胶成像为在紫外光激发下进行荧光成像；和/或，所述凝胶为聚丙烯酰胺凝胶。上述过程中，所述紫外光为波长为250nm-380nm的紫外光；和/或，所述待测蛋白为人血清白蛋白、人血清转铁蛋白、人血清免疫球蛋白G或人血清。上述过程中，所述将待测蛋白进行凝胶电泳的过程中，所述人血清白蛋白、人血清转铁蛋白或人血清免疫球蛋白G在电泳上样液中的浓度为2mg/ml，所述人血清是被稀释 2-100倍后进行所述凝胶电泳的；所述人血清具体被稀释2倍、5倍、8倍、10倍、20倍、40倍、 80倍或100倍后进行所述凝胶电泳。本发明是在蛋白质进行凝胶电泳后，将所得凝胶直接浸泡在量子点溶液中，以使凝胶中的蛋白与量子点相互作用，而后进行荧光成像检测，获得蛋白图谱。实验证明，在碱性的量子点溶液中加入电负性试剂N，N, N’，N’ -四甲基乙二胺(TEMED)，更有助于增强荧光成像。实验证明，在进行单向电泳时，本发明方法的分辨率高，检测到的蛋白条带清晰， 而对照组得到的条带非常模糊，不易分辨；在进行双向电泳时，本发明方法检测到的蛋白点较多，而对照组得到的蛋白点很少；本发明方法可以检测蛋白成分极其复杂的人血清，而一般的检测方法效果不好，本发明方法灵敏度高，将血清稀释100倍后还可以检测得到清晰的蛋白条带；由本发明方法所得的图像具有背景低、样品区带扩散小的优点；成像时，激发波长可以在很长的范围内变动，量子点的荧光能够在很长时间内保持稳定，为成像检测提供充足的时间，避免了其它蛋白标记方法不稳定的缺陷；另外，本发明方法避免了量子点标记后进行蛋白凝胶分离而降低电泳淌度的现象，从而既保证了蛋白的电泳分离效果，又实现了蛋白的高效检测；电泳之后，可直接对凝胶中蛋白进行成像检测，无需将蛋白质通过转膜等技术转移出来再标记，操作简便快捷。本发明方法中选择的量子点的直径恰到好处，实验过程中证明，所用的量子点的粒径过大，容易聚集沉降，且发射波长会红移，不利于蛋白检测。综上，本发明可在聚丙烯酰胺凝胶电泳后实现对蛋白质的直接荧光成像，从而达到快速检测血清蛋白质的目的，克服了现有的凝胶电泳后血清蛋白质无法直接成像的不足。该发明在凝胶电泳的蛋白质分离检测中具有广阔的应用前景。


图1是本发明所用量子点的表征图。图2是酸性条件下三种标准蛋白混合样的单向电泳荧光成像图。图3是酸性条件下的人血清单向电泳荧光成像图。图4是酸性条件下的人血清双向电泳荧光成像图。图5是碱性条件下的人血清双向电泳荧光成像图。图6是碱性条件下的人血清SDS胶单向电泳荧光成像图。图7为酸性条件下的人血清单向电泳检测限荧光成像图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的荧光成像仪器为EC3凝胶成像系统(美国UVP公司)；所用电泳仪为DYY-6B型稳压稳流电泳仪和DYY-6C型稳压稳流电泳仪。文中所述二次水(电导率18. 2ΜΩ)即为超纯水。下述实施例中所用的量子点的结构1、量子点为球形，由核心层和壳层组成，核心层为碲化镉(CdTe)，壳层为巯基乙酸，壳层通过静电作用覆盖于核心层的周围；静电作用是指巯基乙酸中带孤对电子的S与 CdTe中带正电荷的Cd之间形成的静电作用；2、该量子点粒径在3-5nm ；该量子点为水溶性；3、该量子点的激发波长为250nm-380nm，发射波长为520nm ；碲粉购自国药集团化学试剂有限公司，产品目录号为80121760 ；NaBH4购自国药集团化学试剂有限公司，产品目录号为80115892 ；CdCl2 · 2. 5H20购自国药集团化学试剂有限公司，产品目录号为10005416 ；巯基乙酸购自国药集团化学试剂有限公司，产品目录号为 80128416.下述实施例中所用的量子点的制备方法[参考文献方法(陈启凡，王文星，葛颖新，徐淑坤，杨冬芝，分析实验室，2007，26，1.) ] 1、称取0. 1276g碲粉加入小三颈烧瓶，加入IOmL水，磁搅拌，在充氮气的条件下反应15-20min ；2、称取0. 08gNaBH4加入25mL小三颈烧瓶中，继续充氮气持续反应4h以上后静置，得到上层清液和下层白色沉淀；3、另取一 500mL大三颈烧瓶，称取0. 45672gCdCl2 · 2. 5H20加入烧瓶中，注入水200mL，取420 μ L巯基乙酸加入瓶中，搅拌，以NaOH调ρΗ至9. 2 ；4、移走小三颈烧瓶，继续充氮气，大烧瓶插上塞子和导管，充氮气30min ；5、迅速将小三颈烧瓶中的上层清液转入大烧瓶中，充氮气反应 30min ；6、关闭氮气，将大烧瓶三个口均密封，放入80°C恒温干燥箱加热3.证，得到量子点制品。所述充氮气的速度为0.8L/min。下述实施例中所用的量子点的表征1、透射电镜对上述量子点结构进行扫描，结果如图IA所示。透射电镜图(A图) 表明，所合成的量子点呈球形，粒径分布均勻。2、该量子点的激发光谱和发射光谱的检测方法使用荧光仪进行荧光测定，先固定发射波长为516nm，扫描荧光激发光谱， 得到最佳激发波长335nm;再以335nm为激发波长，扫描量子点荧光发射光谱。结果，荧光激发光谱(B图a线)显示该量子点具有较宽的激发波长范围，从250nm 至380nm ；经250nm-380nm的紫外光照射后量子点发出黄绿色的荧光，荧光发射波长在 520nm左右(B图b线)。3、水溶性得到的量子点制品为橙黄色透明溶液，说明合成的巯基乙酸包裹的 CdTe量子点具有良好的水溶性。实施例1、标准蛋白的检测人血清白蛋白(HSA)购自Sigma，产品目录号为A1653;人血清转铁蛋白(HTf) 购白Sigma，产品目录号为T3309;人血清免疫球蛋白G(IgG)购自Sigma，产品目录号为 S5393。一、实验组1、蛋白电泳(1)电泳蛋白样品的制备将HAS、HTf与IgG用甘油、溴酚蓝和二次水混勻，得到电泳蛋白样品；其中，HAS在电泳蛋白样品中的浓度为2mg/ml，HTf在电泳蛋白样品中的浓度为2mg/ml，Ig G在电泳蛋白样品中的浓度为2mg/ml。(2)凝胶非变性单向聚丙烯酰胺凝胶；浓缩胶组成浓度4% ；交联度2.7% ·’分离胶组成浓度7. 5% ；交联度2. 7% ；(3)电泳使用DYY-6C型稳压稳流电泳仪，开始时电压为120V，待样品进入分离胶后(约 30min)，将电压调至100V，当溴酚蓝染料完全跑出凝胶区域后，停止电泳，关闭电源及冷却水。电泳缓冲液的组成Tris_甘氨酸缓冲，pH8. 3。2、蛋白的量子点标记将步骤1电泳后的凝胶取出(蛋白在凝胶中以蛋白条带或蛋白点的形式得以分离)，浸入量子点溶液中，浸泡池，期间一直于摇床上低速振荡；完毕后，取出凝胶并用二次水洗去凝胶表面的量子点，待成像。量子点溶液的配制取量子点原液于培养皿中，再加入巯基乙酸，再用二次水(电
7导率18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. 2mM，巯基乙酸的浓度为0. 5% (ν/ν)；量子点溶液的ρΗ值为3. 7。量子点溶液的配制具体也可为如下取400 μ L量子点原液、50 μ L巯基乙酸于培养皿中，加二次水(电导率18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0.2mM，巯基乙酸的浓度为0.5% (ν/ν)；量子点溶液的ρΗ值为3. 7。其中，量子点原液即为合成所得制品。3、凝胶成像凝胶成像仪成像。在波长为250-380nm的紫外光激发下进行荧光成像。二、对照组1、蛋白电泳方法与实验组相同。2、考染将电泳所得凝胶置入CBB-R250染色液中染色池，取出用水冲洗干净并置入脱色液中脱色12h。三、结果结果如图2所示。图2A为对照组，图2B为实验组。与对照组相比，实验组结果分辨率更高，得到的蛋白条带更清晰，尤其是IgG，对照组IgG的条带非常模糊，而实验组却非
常清晰。实验设3次重复，结果均一致。实施例2、人血清单向电泳后检测人血清样品的获取为医院体检后的剩余血液，均经过体检的本人同意。血液凝固后，析出的上层清液即为血清。一、实验组1、蛋白电泳(1)电泳蛋白样品的制备将人血清样品用甘油、溴酚蓝和二次水的混合溶液稀释10倍，准备非变性单向电泳。(2)凝胶非变性单向聚丙烯酰胺凝胶；浓缩胶组成浓度4% ；交联度2.7% ·’分离胶组成浓度7. 5% ；交联度2. 7% ；(3)电泳使用DYY-6C型稳压稳流电泳仪，开始时电压为120V，待样品进入分离胶后(约 30min)，将电压调至100V，当溴酚蓝染料完全跑出凝胶区域后，停止电泳，关闭电源及冷却水。电泳缓冲液的组成Tris_甘氨酸缓冲，pH8. 3。2、蛋白的量子点标记将步骤1电泳后的凝胶取出(蛋白质位于凝胶中，与凝胶形成混合体)，浸入量子点溶液中，浸泡4h期间一直于摇床上以低速振荡；完毕后，取出凝胶并用二次水洗去凝胶表面的量子点，待成像。量子点溶液的配制取量子点原液于培养皿中，再加入巯基乙酸，再用二次水(电导率18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. ImM，巯基乙酸的浓度为0. 6% (ν/ν)；量子点溶液的ρΗ值为3. 6。
量子点溶液的配制具体也可为如下取200 μ L量子点原液、60 μ L巯基乙酸于培养皿中，加二次水(电导率18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. ImM，巯基乙酸的浓度为0. 6% (ν/ν)；量子点溶液的ρΗ值为3. 6。其中，量子点原液即为合成所得溶液。3、凝胶成像凝胶成像仪成像。二、对照组1、蛋白电泳方法与实验组相同。2、考染方法与实施例1中所述相同。三、结果结果如图3所示。图3Α为对照组，图3Β为实验组。与对照组相比，实验组中蛋白条带的清晰度更高，分离得到的蛋白条带更多，谱图分辨率更高。尤其在凝胶上半段区域， 对照组是模糊成一片，蛋白条带显示不明显，而实验组显现出清晰的多条蛋白条带。实验设3次重复，结果均一致。实施例3、人血清的双向电泳检测人血清样品的获取与实施例2中所述相同。一、实验组1、蛋白电泳(1)电泳蛋白样品的制备将人血清样品用甘油、溴酚蓝和二次水的混合溶液稀释8倍，准备非变性双向电泳。(2)凝胶非变性第一向和第二向聚丙烯酰胺凝胶第一向凝胶浓度6%，交联度2. 7% ；第二向与实施例1中所述分离胶组成相同；(3)电泳先使用DYY-6B型稳压稳流电泳仪，前0. 5h设置电压为200V，待电流显示为零后将电压调至400V等电聚焦14h ；取出胶条置于第二向中，使用DYY-6C型稳压稳流电泳仪，以 100V电压电泳至溴酚蓝跑出凝胶区域后，停止电泳，关闭电源及冷却水。电泳缓冲液的组成Tris_甘氨酸缓冲，pH8. 3。2、蛋白的量子点标记将步骤1电泳后的凝胶取出(蛋白质位于凝胶中，与凝胶形成混合体)，浸入量子点溶液中，浸泡2h，期间一直于摇床上以低速振荡；完毕后，取出凝胶并用二次水洗去凝胶表面的量子点，待成像。量子点溶液的配制取量子点原液于培养皿中，再加入巯基乙酸，再用二次水(电导率18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. 3mM，巯基乙酸的浓度为0.4% (ν/ν)；量子点溶液的ρΗ值为4. 4。量子点溶液的配制具体也可为如下取600 μ L量子点原液、40 μ L巯基乙酸于培养皿中，加二次水(电导率18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0.3mM，巯基乙酸的浓度为0.4% (ν/ν)；量子点溶液的ρΗ值为4. 4。其中，量子点原液即为合成所得溶液。3、凝胶成像凝胶成像仪成像。
二、对照组1、蛋白电泳方法与实验组相同。2、考染方法与实施例1中所述相同。三、结果结果如图4所示。图4A为对照组，图4B为实验组。结果显示，与对照组相比，实验组所得蛋白点更为清晰，易于分辨。实验设3次重复，结果均一致。实施例4、人血清的双向电泳检测人血清样品的获取与实施例2中所述相同。实验一(一)实验组I1、蛋白电泳(1)电泳蛋白样品的制备将人血清样品用甘油、溴酚蓝和二次水的混合溶液稀释8倍，准备非变性双向电泳。(2)凝胶非变性第一向和第二向聚丙烯酰胺凝胶第一向凝胶浓度6%，交联度2. 7% ；第二向与实施例1中所述分离胶组成相同；(3)电泳先使用DYY-6B型稳压稳流电泳仪，前0.证设置电压为200V，待电流显示为零后将电压调至400V等电聚焦14h ；取出胶条置于第二向中，使用DYY-6C型稳压稳流电泳仪，以 100V电压电泳至溴酚蓝跑出凝胶区域后，停止电泳，关闭电源及冷却水。电泳缓冲液的组成Tris-甘氨酸缓冲，pH8. 3。2、蛋白的量子点标记将步骤1电泳后的凝胶取出(蛋白质位于凝胶中，与凝胶形成混合体)，浸入量子点溶液中，浸泡lh，期间一直于摇床上以低速振荡；完毕后，取出凝胶并用二次水洗去凝胶表面的量子点，待成像。量子点溶液的配制取量子点原液于培养皿中，再加入NaOH，再用二次水(电导率 18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. 27mM，NaOH的浓度为 2. lmol/L。量子点溶液的配制具体也可为如下取540 μ L量子点原液、加NaOH溶液配成 IOmL染胶溶液，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. 27mM, NaOH的浓度为 2. lmol/L。其中，量子点原液即为合成所得溶液。3、凝胶成像凝胶成像仪成像。(二)对照组1、蛋白电泳方法与实验组I相同。2、考染方法与实施例1中所述相同。(三)结果结果如图5所示。图5A为对照组，图5B为实验组I。图5B同图5A比较可发现，碱性条件下的量子点荧光成像结果已经明显优于考染结果，所能检测到的蛋白点大幅增多。
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实验设3次重复，结果均一致。实验二1、蛋白电泳与实验一中实验组所述相同。2、蛋白的量子点标记将步骤1电泳后的凝胶取出(蛋白质位于凝胶中，与凝胶形成混合体)，浸入量子点溶液中，浸泡lh，期间一直于摇床上以低速振荡；完毕后，取出凝胶并用二次水洗去凝胶表面的量子点，待成像。量子点溶液的配制取量子点原液于培养皿中，再加入NaOH，再用二次水(电导率 18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. 2mM, NaOH的浓度为 1. 8mol/L0量子点溶液的配制具体也可为如下取400 μ L量子点原液、加NaOH溶液配成 IOmL染胶溶液，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. 2mM, NaOH的浓度为 1.8mol/L。其中，量子点原液即为合成所得溶液。3、凝胶成像与实验一中实验组所述相同。4、结果与实验一中实验组所述结果无显著差异。实验设3次重复，结果均一致。实验三1、蛋白电泳与实验一中实验组所述相同。2、蛋白的量子点标记将步骤1电泳后的凝胶取出(蛋白质位于凝胶中，与凝胶形成混合体)，浸入量子点溶液中，浸泡lh，期间一直于摇床上以低速振荡；完毕后，取出凝胶并用二次水洗去凝胶表面的量子点，待成像。量子点溶液的配制取量子点原液于培养皿中，再加入NaOH，再用二次水(电导率 18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. 325mM, NaOH的浓度为 3. Omol/Lο量子点溶液的配制具体也可为如下取650 μ L量子点原液、加NaOH溶液配成 IOmL染胶溶液，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. 325mM, NaOH的浓度为 3. 0mol/Lo其中，量子点原液即为合成所得溶液。3、凝胶成像与实验一中实验组所述相同。4、结果与实验一中实验组所述结果无显著差异。
实验设3次重复，结果均一致。实施例5、人血清的双向电泳检测人血清样品的获取与实施例2中所述相同。实验一(一)实验组1、蛋白电泳与实施例4实验一中实验组所述方法相同。2、蛋白的量子点标记将步骤1电泳后的凝胶取出(蛋白质位于凝胶中，与凝胶形成混合体)，浸入量子点溶液中，浸泡lh，期间一直于摇床上以低速振荡；完毕后，取出凝胶并用二次水洗去凝胶表面的量子点，待成像。量子点溶液的配制取量子点原液于培养皿中，再加入N，N, N’，N’ -四甲基乙二胺(TEMED)和NaOH，再用二次水(电导率18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. 27mM, NaOH的浓度为2. lmol/L, TEMED的浓度为17. 9mM。量子点溶液的配制具体也可为如下取540 μ L量子点原液、27 μ LTEMED于培养皿中，加NaOH溶液配成IOmL染胶溶液，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为 0. 27mM,Na0H的浓度为2. lmol/L,TEMED的浓度为17. 9mM。其中，量子点原液即为合成所得溶液。3、凝胶成像与实施例4实验一中实验组所述方法相同。(二)对照组1、蛋白电泳与实施例4实验一中对照组所述方法相同。2、考染与实施例4实验一中对照组所述方法相同。(三)结果结果如图5所示。图5A为对照组，图5C为实验组。图5B同图5A比较可发现，碱性条件下的量子点荧光成像结果已经明显优于考染结果，所能检测到的蛋白点大幅增多， 再比较图5C可看出，在染胶溶液中添加电负性试剂TEMED可增强荧光成像，从而检测到更多蛋白质。实验设3次重复，结果均一致。实验二1、蛋白电泳与实施例4实验一中实验组所述方法相同。2、蛋白的量子点标记将步骤1电泳后的凝胶取出(蛋白质位于凝胶中，与凝胶形成混合体)，浸入量子点溶液中，浸泡lh，期间一直于摇床上以低速振荡；完毕后，取出凝胶并用二次水洗去凝胶表面的量子点，待成像。量子点溶液的配制取量子点原液于培养皿中，再加入N，N, N’，N’ -四甲基乙二胺(TEMED)和NaOH，再用二次水(电导率18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. 2mM, NaOH的浓度为1. 8mol/L, TEMED的浓度为9. 9mM。量子点溶液的配制具体也可为如下取400 μ L量子点原液、15 μ LTEMED于培养皿中，加NaOH溶液配成IOmL染胶溶液，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为 0. 2mM,Na0H的浓度为1. 8mol/L, TEMED的浓度为9. 9mM。其中，量子点原液即为合成所得溶液。3、凝胶成像与实施例4实验一中实验组所述方法相同。4、结果与实验一中实验组所述结果无显著差异。实验设3次重复，结果均一致。实验三1、蛋白电泳与实施例4实验一中实验组所述方法相同。2、蛋白的量子点标记将步骤1电泳后的凝胶取出(蛋白质位于凝胶中，与凝胶形成混合体)，浸入量子点溶液中，浸泡lh，期间一直于摇床上以低速振荡；完毕后，取出凝胶并用二次水洗去凝胶表面的量子点，待成像。量子点溶液的配制取量子点原液于培养皿中，再加入N，N, N’，N’ -四甲基乙二胺(TEMED)和NaOH，再用二次水(电导率18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. 325mM, NaOH的浓度为3. Omol/L，TEMED的浓度为26. 5mM。量子点溶液的配制具体也可为如下取650 μ L量子点原液、40 μ LTEMED于培养皿中，加NaOH溶液配成IOmL染胶溶液，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为 0. 325mM, NaOH的浓度为3. Omol/L, TEMED的浓度为26. 5mM。其中，量子点原液即为合成所得溶液。3、凝胶成像与实施例4实验一中实验组所述方法相同。4、结果与实验一中实验组所述结果无显著差异。实验设3次重复，结果均一致。实施例6、人血清的变性单向电泳检测人血清样品的获取与实施例2中所述相同。一、实验组I1、蛋白电泳(1)电泳蛋白样品的制备将人血清样品用甘油、溴酚蓝和二次水的混合溶液稀释10倍，准备变性单向电泳。⑵凝胶浓缩胶组成浓度4%，交联度2. 7%，同时含0. 1 % SDS (m/v)分离胶组成浓度7. 5%，交联度2. 7%，同时含0. SDS (m/v)；(3)电泳使用DYY-6C型稳压稳流电泳仪，开始时电压为120V，待样品进入分离胶后(约 30min)，将电压调至100V，当溴酚蓝染料完全跑出凝胶区域后，停止电泳，关闭电源及冷却水。电泳缓冲液的组成Tris_甘氨酸缓冲，pH8. 3，同时含0. 1 % SDS(m/v)。2、蛋白的量子点标记将步骤1电泳后的凝胶取出(蛋白质位于凝胶中，与凝胶形成混合体)，浸入量子点溶液中，浸泡lh，期间一直于摇床上以低速振荡；完毕后，取出凝胶并用二次水洗去凝胶表面的量子点，待成像。量子点溶液的配制取量子点原液于培养皿中，再加入NaOH，再用二次水(电导率 18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. 27mM，NaOH的浓度为 2. lmol/L。量子点溶液的配制具体也可为如下取540 μ L量子点原液、加NaOH溶液配成 IOmL染胶溶液，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. 27mM, NaOH的浓度为 2. lmol/L。量子点原液即为合成所得溶液。3、凝胶成像凝胶成像仪成像。二、对照组1、蛋白电泳方法与实验组I相同。2、考染方法与实施例1中所述相同。
三、结果结果如图6所示。图6A为对照组，图6B为实验组。与对照组相比，实验组所得结果能够同传统考染法相匹配，说明该方法可用于SDS胶中蛋白质的荧光成像检测。实验设3次重复，结果均一致。实施例7、人血清单向电泳检测限一、实验组1、蛋白电泳电泳蛋白样品的制备将人血清样品用甘油、溴酚蓝和二次水的混合溶液分别稀释2-400倍，准备非变性单向电泳。(2)凝胶非变性单向聚丙烯酰胺凝胶；浓缩胶组成浓度4% ；交联度2.7% ·’分离胶组成浓度7. 5% ；交联度2. 7% ；(3)电泳使用DYY-6C型稳压稳流电泳仪，开始时电压为120V，待样品进入分离胶后(约 30min)，将电压调至100V，当溴酚蓝染料完全跑出凝胶区域后，停止电泳，关闭电源及冷却水。电泳缓冲液的组成Tris-甘氨酸缓冲，pH8. 3。2、蛋白的量子点标记将步骤1电泳后的凝胶取出(蛋白质位于凝胶中，与凝胶形成混合体)，浸入量子点溶液中，浸泡2h，期间一直于摇床上低速振荡；完毕后，取出凝胶并用二次水洗去凝胶表面的量子点，待成像。量子点溶液的配制取量子点原液于培养皿中，再加入巯基乙酸，再用二次水(电导率18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0. 2mM，巯基乙酸的浓度为0. 5% (ν/ν)；量子点溶液的ρΗ值为3. 7。量子点溶液的配制具体也可为如下取400 μ L量子点原液、50 μ L巯基乙酸于培养皿中，加二次水(电导率18. 2ΜΩ)定容至10mL，得到量子点溶液；量子点溶液中，量子点浓度为0.2mM，巯基乙酸的浓度为0.5% (ν/ν)；量子点溶液的ρΗ值为3. 7。其中，量子点原液即为合成所得制品。3、凝胶成像凝胶成像仪成像。二、对照组1、蛋白电泳方法与实验组相同。2、考染将电泳所得凝胶置入CBB-R250染色液中染色池，取出用水冲洗干净并置入脱色液中脱色12h。三、结果结果如图7所示。图7A为实验组，图7B为对照组。图中，第1泳道为稀释2倍的血清，第2泳道为稀释5倍的血清，第3泳道为稀释10倍的血清，第4泳道为稀释20倍的血清，第5泳道为稀释40倍的血清，第6泳道为稀释80倍的血清，第7泳道为稀释100倍的血清，第8泳道为稀释200倍的血清，第9泳道为稀释300倍的血清，第10泳道为稀释400
倍的血清。
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与对照组相比，在稀释一系列相同倍数的条件下，可以明显看出实验组能检测到的浓度更低。对照组中当血清稀释80倍(B图第6泳道)时，已经基本上检测不到蛋白条带(最下端白蛋白条带除外)，而此时实验组中仍能检测到数条蛋白条带。实验设3次重复，结果均一致。
权利要求
1.一种检测蛋白的方法，包括如下步骤1)将待测蛋白进行凝胶电泳，使待测蛋白得到分离，并以条带形式或点的形式分布在凝胶上，将得到的凝胶记作带有蛋白条带或蛋白点的凝胶；2)将所述带有蛋白条带或蛋白点的凝胶置于量子点溶液中，浸泡，所述量子点与所述带有蛋白条带或蛋白点的凝胶中的蛋白条带或蛋白点结合，得到蛋白条带-量子点结合体或蛋白点-量子点结合体，将得到的凝胶记作带有蛋白-量子点结合体的凝胶；3)将所述带有蛋白-量子点结合体的凝胶进行凝胶成像，得到所述待测蛋白的凝胶电泳图像，即实现所述待测蛋白的检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述量子点溶液为如下1)、2)或3)所示1)所述量子点溶液是按照包括如下步骤的方法配制得到的将所述量子点溶于水中， 再调节PH值至3. 6-4. 4，具体为3. 6、3. 7或4. 4，得到所述量子点溶液；所述量子点在所述量子点溶液中的浓度为0. ImM-O. 3mM，具体为0. lmM、0. 2mM或0. 3mM ；2)所述量子点溶液由所述量子点、可溶性碱和水组成，所述量子点在所述量子点溶液中的浓度为0. 2mM-0. 325mM，具体为0. 2mM、0. 27mM或0. 325mM，所述可溶性碱在所述量子点溶液中的浓度为 1. 8-3. Omol/L，具体为 1. 8mol/L、2. lmol/L 或 3. Omo 1/L ；3)所述量子点溶液由所述量子点、可溶性碱、N，N,N’，N’ -四甲基乙二胺和水组成，所述量子点在所述量子点溶液中的浓度为0. 2mM-0. 325mM，具体为0. 2mM、0. 27mM或0. 325mM, 所述可溶性碱在所述量子点溶液中的浓度为1.8-3. Omol/L，具体为1. 8mol/L、2. lmol/L或 3. Omol/L，所述N，N, N’，N’ -四甲基乙二胺在所述量子点溶液中的浓度为9. 9mM_26. 5mM, 具体为 9. 9mM、17. 9mM 或 26. 5mM。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述1)所示的量子点溶液中，是用巯基乙酸或巯基乙酸的水溶液调节PH值的，所述巯基乙酸在所述量子点溶液中的浓度为 0.4% -0.6% (体积百分含量)，具体为0.4%、0. 5%或0.6% ；所述2)所示的量子点溶液中，所述可溶性碱为氢氧化钠或氢氧化钾；所述幻所示的量子点溶液中，所述可溶性碱为氢氧化钠或氢氧化钾。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述浸泡的时间为lh-4h，具体为 lh、2h 或 4h。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，所述量子点溶液为所述ι)所示，所述浸泡的时间为池或4h ；所述量子点溶液为所述2、所示，所述浸泡的时间为Ih ；所述量子点溶液为所述幻所示，所述浸泡的时间为lh。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述量子点的结构如下所述量子点由核心层和壳层组成，核心层为碲化镉，壳层为巯基乙酸，壳层通过静电作用覆盖于核心层的周围；静电作用是指巯基乙酸中带孤对电子的S与CdTe中带正电荷的Cd之间形成的静电作用；和/或，所述量子点的粒径为3-5nm ；和/或，所述量子点的发射波长为520nm ； 和/或，所述量子点的激发波长为250nm-380nm。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述量子点是按照包括如下步骤的方法得到的1)将0.1276g碲粉溶于IOmL水中，磁搅拌，充氮气15-20min，得到溶液I ；2)向溶液I中加入0.OSgNaBH4，在充氮气的条件下反应4h，得到溶液II，溶液II分上层清液和下层沉淀；3)将0.45672gCdCl2 · 2. 5H20和420 μ L巯基乙酸加入200mL水中，搅拌，用NaOH调节 pH值至9. 2，在充氮气的条件下反应30min，得到溶液III ；4)将所述溶液II中上层清液加入所述溶液III中，在充氮气的条件下反应30min，得到溶液IV ；5)将溶液IV置于80度且密封条件下反应3.5h，得到所述量子点；所述充氮气的速度为0. 8L/min。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述凝胶成像为在紫外光激发下进行荧光成像；和/或，所述凝胶为聚丙烯酰胺凝胶。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述紫外光为波长为 250nm-380nm的紫外光；和/或，所述待测蛋白为人血清白蛋白、人血清转铁蛋白、人血清免疫球蛋白G或人血清。
10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述将待测蛋白进行凝胶电泳的过程中，所述人血清白蛋白、人血清转铁蛋白或人血清免疫球蛋白G在电泳上样液中的浓度为2mg/ml，所述人血清是被稀释2-100倍后进行所述凝胶电泳的；所述人血清具体被稀释2倍、5倍、8倍、10倍、20倍、40倍、80倍或100倍后进行所述凝胶电泳。
全文摘要
本发明提供了一种检测蛋白的方法。该方法包括如下步骤1)将待测蛋白进行凝胶电泳，使待测蛋白得到分离，并以条带形式或点的形式分布在凝胶上，将得到的凝胶记作带有蛋白条带或蛋白点的凝胶；2)将所述带有蛋白条带或蛋白点的凝胶置于量子点溶液中，浸泡，所述量子点与所述带有蛋白条带或蛋白点的凝胶中的蛋白条带或蛋白点结合，得到蛋白条带-量子点结合体或蛋白点-量子点结合体，将得到的凝胶记作带有蛋白-量子点结合体的凝胶；3)将所述带有蛋白-量子点结合体的凝胶进行凝胶成像实现所述待测蛋白的检测。实验证明，在进行单向电泳时，本发明方法的分辨率高，检测到的蛋白条带清晰，而对照组得到的条带非常模糊，不易分辨；在进行双向电泳时，本发明方法检测到的蛋白点多，而对照组得到的蛋白点非常少。该方法克服了目前所报道的量子点标记后进行蛋白凝胶分离而降低电泳淌度，进而降低分离效率的缺点；得到的荧光信号强且稳定、背景低、灵敏度高。
文档编号G01N21/64GK102213692SQ201010139720
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月1日 优先权日2010年4月1日
发明者刘璐, 欧阳津, 那娜, 黄常刚 申请人:北京师范大学