专利名称：一种胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于酶联免疫检测技术领域，具体涉及一种胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒。
背景技术：
胃食管反流病(CERD)是一种胃内容物反流引起不适症状和(或)并发症的疾病， 是消化系统常见疾病，西方国家发病率约为7% -27%，我们国家CERD的发病也呈增加趋势约为9. 1% -22. 5%，但目前CERD的检测相当麻烦。因此我们建立了胃蛋白酶酶联免疫分析的检测方法以辅助临床进行鉴别诊断。胃蛋白酶((Pepsin)是一种酸性蛋白酶，由胃粘膜主细胞释放的胃蛋白酶原转化而来，分子量35Kd，是胃液中的主要消化酶，能裂解蛋白质的肽键，从而使蛋白质在胃内得到初步消化。但在某些情况下发生胃液反流时，胃液中少量的胃蛋白酶就可以破坏原有黏膜的正常结构，损害细胞间或细胞膜上的蛋白，破坏胞间连接和信号转导，引起严重的并发症，如咽部炎症、反流性食管炎，若反流至中耳可引起中耳炎，若误吸至肺，不仅引起气道粘膜损伤，还会导致肺泡萎缩和肺不张，甚至引起急性呼吸衰竭。最近有研究发现胃蛋白酶升高与异体肺移植排斥有关，在异体肺移植患者支气管肺泡灌洗液中胃蛋白酶水平持续性升高，与肺移植急性排斥有关。因此建立胃蛋白酶水平的监测对反流性咽炎的鉴别诊断、及早发现胃液反流、预防和治疗胃内容物误吸、防治误吸后急性呼吸衰竭以及检测肺移植患者排斥反应具有非常重要的意义。目前国内还没有用同株多克隆抗体建立夹心酶免疫分析法检测胃蛋白酶的研究和使用报道，国外相关文献报道也很少。

发明内容
本发明的目的在于提供一种胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒，该试剂盒对反流性咽炎的鉴别诊断、及早发现胃液反流、预防和治疗胃内容物误吸、防治误吸后急性呼吸衰竭以及检测肺移植患者排斥反应具有非常重要的意义。一种胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒,该试剂盒由固相酶标板、胃蛋白酶标准品、辣根过氧化物酶标记的胃蛋白酶抗体和辅助试剂组成。所述辣根过氧化物酶标记的胃蛋白酶抗体的制备方法如下称取2. 5mg辣根过氧化物酶溶于O. 5ml三蒸水中，加NaIO4进行醛化后，用50mmol/L、pH9. 5的碳酸盐缓冲液调 PH ^ 9. O，在磁力搅拌下将3. 5mg/200 μ L的胃蛋白酶抗体溶液滴加到醛化的辣根过氧化物酶溶液中，4°C搅拌反应2h，加入O. 4%的NaBH4IOO μ L于反应液中，4°C反应2h，用IOmmol、 PH 7. 8的PBS透析过夜，次日，将反应液离心，取上清加入等体积甘油，分装冻存。所述胃蛋白酶抗体的制备方法如下首次免疫将胃蛋白酶600 μ g与弗氏完全佐剂4ml混匀，分别与3只兔背部皮内注射，每隔4周进行加强免疫，所述加强免疫是将免疫原300 μ g与弗氏不完全佐剂4ml充分混匀后注射，第4次免疫后7天经动物颈动脉放血， 分离血清，检测抗血清效价，选取效价最高者进行分装，-80°C保存。
所述辅助试剂包括显色液、反应终止液、底物工作液、洗涤液和缓冲液。本发明的有益效果本发明的试剂盒使用时将胃蛋白酶标准品与样本中待测胃蛋白酶同时等体积加入固相抗体板中，经过反应洗涤后再加入酶标抗体，经过反应洗涤后加入显色剂，根据颜色深浅判断待测物中胃蛋白酶的含量；用该方法检测62份正常人唾液和 23例反流性食道炎患者唾液，表明该方法实用可靠。


图I为胃蛋白酶酶联免疫分析标准曲线。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。实施例I胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒的制备I、材料免疫用大耳白兔3只，雄性，体重I. 5公斤，由301医院动物实验中心提供。人胃蛋白酶购于sigma公司，弗氏完全、不完全佐剂为本实验室自制，胰蛋白酶、淀粉酶、抗胰蛋白酶、分泌型IgA均购于Sigma公司，正常人唾液及反流性食道炎患者支气管分泌物样品均来自中国人民解放军总医院。2、胃蛋白酶抗体的制备和纯化(I)抗血清制备首次免疫将胃蛋白酶600ug与弗氏完全佐剂4ml充分混匀，分别与 3只兔背部皮内多点注射,每隔4周进行加强免疫(将免疫原300ug与不完全佐剂4ml充分混匀后同上法注射)。于第4次免疫后7天经动物颈动脉放血，分离血清，检测抗血清效价，选取效价最高者进行分装，-80°C保存。(2)抗血清的纯化取2mL兔抗胃蛋白酶血清，加入4mL生理盐水稀释，置磁力搅拌器上，用饱和硫酸铵分级纯化，过S印hadexG75柱。用紫外分光光度法测其蛋白含量。3、辣根过氧化物酶标记的胃蛋白酶抗体的制备称取2. 5mg辣根过氧化物酶(HR)溶于O. 5ml新鲜三蒸水中，加NaIO4进行醛化后， 用50mmol/L pH 9. 5的碳酸盐缓冲液调PH彡9. 0，在磁力搅拌下缓慢将胃蛋白酶抗体溶液 (3. 5mg/200 μ L)滴加到醛化的HR溶液中，4°C搅拌反应2h，加入O. 4%的NaBH4 100 μ L于反应液中，4°C反应2h，用IOmmol pH 7. 8PBS透析过夜。次日，将反应液离心，取上清加入等体积甘油，分装冻存。4、辅助试剂显色液(包括显色剂A和显色剂B)、反应终止液、底物工作液、洗涤液和缓冲液均购买自天根(北京)生化科技有限公司。实施例2胃蛋白酶酶联免疫分析检测方法I、固相抗体酶标板的制备取纯化后的胃蛋白酶抗体，用话O. 05M柠檬酸盐缓冲液配制成10ug/ml，将其按每孔IOOul量加入96孔酶标板中，370C孵育3h，洗板，加入含3 %牛血清白蛋白的Tris. HCl 封闭液中，4°C过夜，甩去封闭液，用冷冻干燥机去掉孔内多余水分，将其装入锡箔袋中用真空包装机抽真空密封，保存于4°C。2、试剂和仪器准备
冻干的标准品7瓶每瓶用实验缓冲液ImL溶解后浓度分别为8、4、2、1、0. 5、
O.25、0ng/mL ;辣根过氧化物酶标记的胃蛋白酶抗体工作液(HRP-IgG) I瓶；显色剂A :1支； 显色剂B :1瓶；显色工作液用前A与B以I : 19的比例混合；.终止液I瓶；浓缩洗涤液 I瓶(30mL):用前用重蒸水I : 20倍稀释；实验缓冲液I瓶；加样器、振荡器、温箱。3、样品收集、处理及保存方法唾液采集前先用温水漱口，漱毕，静止lOmin，采集自然流出的唾液于干净试管内，离心20分钟左右￠000-8000转/分)，吸取上清待测。支气管分泌物将样本冻于_30°C低温冰箱中，室温解冻后振荡器混匀， 16000gX20min 4°C离心，吸取上清液备用，样本稀释液用磷酸盐缓冲液。对收集后当天进行的标本，储存在4°C备用，如有特殊原因需要周期收集标本，将标本及时分装后放在_20°C或_70°C条件下保存，避免反复冻融。标本2-8°C可保存48小时，_20°C可保存I个月，70度可保存6个月。4、操作步骤(I)使用前，将所有试剂充分混匀，不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。(2)根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，每个标准孔建议做复孔，每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。(3)分别将标本或不同浓度标准品IOOul加入相应孔，盖上膜板，37°C温育90分钟。(4)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复此操作3次，如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次，每孔加入IOOul的HRP-IgG，37°C温育 90分钟。(5)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。(6)每孔加入底物工作夜lOOul，轻轻振荡混匀，37°C温育10分钟，避免光照。(7)取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。(8)在450nm波长处测定各孔的OD值(10分钟内)。5、结果(I)标准曲线以吸光度OD值为纵坐标(Y)，相应的胃蛋白酶标准品浓度为横坐标 (X)，做标准曲线。包被兔抗胃蛋白酶抗体(lOyg/mL)固相板在胃蛋白酶浓度O. 25-8. Ong/ mL范围内形成良好的线性关系，见图I。(2)灵敏度和精密度按B0-2SD计算，最小检出值<0.2ng/ml，同批测定同一唾液，其批内变异系数mi. 2% (η = 8);同一唾液分批测定，其批间变异系数(CV) 12. 6% (η = 8)。(3)特异性和准确率胃蛋白酶抗体与胰蛋白酶、淀粉酶、抗胰蛋白酶、分泌型IgA在20-500ng/ml范围内无交叉反应；向唾液中分别加入胃蛋白酶标准1.5、5ng/ml，回收率分别为 102. 3%U04. 9%0(4)反流性咽炎患者组唾液中胃蛋白酶同正常组相比，反流性咽炎患者胃蛋白酶水平明显升高，见表I。表I正常人唾液及胃食管反流患者支气管分泌物中胃蛋白酶水平
权利要求
1.一种胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒由固相酶标板、胃蛋白酶标准品、辣根过氧化物酶标记的胃蛋白酶抗体和辅助试剂组成。
2.根据权利要求I所述一种胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记的胃蛋白酶抗体的制备方法如下称取2. 5mg辣根过氧化物酶溶于O.5ml三蒸水中，加NaIO4进行醛化后，用50mmol/L、pH 9. 5的碳酸盐缓冲液调PH彡9. 0，在磁力搅拌下将3. 5mg/200 μ L的胃蛋白酶抗体溶液滴加到醛化的辣根过氧化物酶溶液中， 4°C搅拌反应2h，加入O. 4%的NaBH4 100 μ L于反应液中，4°C反应2h，用10mmol、pH 7. 8的 PBS透析过夜，次日，将反应液离心，取上清加入等体积甘油，分装冻存。
3.根据权利要求2所述一种胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒，其特征在于，所述胃蛋白酶抗体的制备方法如下首次免疫将胃蛋白酶600 μ g与弗氏完全佐剂4ml混匀，分别与3只兔背部皮内注射，每隔4周进行加强免疫，所述加强免疫是将免疫原300 μ g与弗氏不完全佐剂4ml充分混匀后注射，第4次免疫后7天经动物颈动脉放血，分离血清，检测抗血清效价，选取效价最高者进行分装，-80°C保存。
4.根据权利要求I所述一种胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒，其特征在于，所述辅助试剂包括显色液、反应终止液、底物工作液、洗涤液和缓冲液。
全文摘要
本发明公开了属于酶联免疫检测技术领域的一种胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒。该试剂盒由固相酶标板、胃蛋白酶标准品、辣根过氧化物酶标记的胃蛋白酶抗体和辅助试剂组成。本发明的试剂盒使用时将胃蛋白酶标准品与样本中待测胃蛋白酶同时等体积加入固相抗体板中，经过反应洗涤后再加入酶标抗体，经过反应洗涤后加入显色剂，根据颜色深浅判断待测物中胃蛋白酶的含量；用该方法检测62份正常人唾液和23例反流性食道炎患者唾液，表明该方法实用可靠。
文档编号G01N33/573GK102621306SQ201210077998
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者薛辉, 颜光涛 申请人:中国人民解放军总医院