专利名称：一种检测疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法
技术领域：
本发明属分析化学技术领域，涉及内生真菌中苦马豆素的分离测定，具体是一种测定疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法。
背景技术：
苦马豆素(SW)是吲哚里西啶生物碱，化学名为1，2，8-三羟基-8-氢-吲哚里西啶。SW是疯草(豆科棘豆属和黄芪属有毒植物的总称)中的主要毒性成分。疯草在世界范围内分布广泛，动物大量采食后可引起中毒，甚至死亡。苦马豆素不仅是一种植物源性毒素，而且它还具有抑制肿瘤细胞生长和转移的作用。因为SW是一种极强的a -甘露糖苷酶抑制剂，不仅能抑制肿瘤细胞表面糖蛋白的表达， 还可抑制肿瘤细胞的生长和转移、诱导细胞凋亡，刺激机体的免疫系统，增强杀灭肿瘤细胞的能力。因此SW也被作为抗肿瘤药物的必选后备药。研究发现植物病原真菌豆类丝核菌、昆虫病原真菌金龟子绿僵菌可以产生SW。 2000年，Harris等的首次证实SW的来源与疯草中的内生真菌密切相关；2003年，Braun等
> ψ^ΜΜ-^Astragalus mollissimus, Oxytropis Iambertii, O. sericea') StJ> 茎、叶、花、种子中都分离到属的内生真菌，并且这些内生真菌能够产生SW，发现内生真菌分离率高的疯草，其苦马豆素含量也高。2008年，余永涛等从中国冰川棘豆、茎直黄苗、毛瓣棘豆等疯草中也分离出了可产苦马豆素的内生真菌Undifilum oxytropis。目前对苦马豆素的检测主要采用薄层色谱法和气相色谱法。薄层色谱法是针对SW 的定性检测，由于其灵敏度低，不适于定量检测；气相色谱法是目前定量测定苦马豆素的有效方法。但是在用气相色谱检测苦马豆素前，需要用衍生化试剂对样品进行前处理。衍生化反应复杂、费时。而且衍生化反应对反应条件要求非常苛刻。由于苦马豆素自身缺少发光基团，应用高效液相色谱-紫外检测法很难对苦马豆素进行检测，从而限制了传统的高效液相色谱在检测苦马豆素方面的应用。蒸发光散射检测器作为一种通用型检测器，可以实现对低挥发性的、没有发光基团的化学物质进行检测。 本发明采用高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)法可以不经柱前衍生化，直接对样品中的苦马豆素进行精确测定。

发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种快速、准确的测定疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法。实现上述发明目的的技术方案是一种检测疯草内生真菌中苦马豆素的方法，其特征在于，包括下列步骤
1)将内生真菌菌丝样品经预处理，制备成供试溶液；
2)用高效液相色谱仪蒸发光散射检测器检测，以体积比为O.2 2 0.2 2的乙腈乙酸铵缓冲液的混合液为流动相，经HILIC柱，将待检样品中的苦马豆素与其他物质分离；3)以不同浓度苦马豆素的对数与对应的响应峰面积的对数作图，得到苦马豆素的标准曲线。本发明所述的菌丝样品预处理技术是首先采用甲醇提取菌丝样品，提取液挥干后用乙酸溶解，经阳离子树脂交换柱动态循环交换I h ;用去离子水冲洗树脂中的杂质；再用稀氨水洗脱树脂柱，收集氨水洗脱液，浓缩挥干；最后甲醇溶解，离心后取上清液，挥干待用。本发明所述的高效液相色谱仪蒸发光散射检测器ELSD的检测条件增益值为 150，载气流速25 psi，漂移管温度55°C，雾化器36°C，进样量20yL。本发明米用色谱柱Waters XBridge HILIC (规格 150mmX 4. 6mm, 3· 5 μ m)。本发明流动相优选比例为乙腈乙酸铵缓冲液的体积比I : I。本发明流动相中还添加占流动相总体积O. 02%的氨水。本发明所选用的乙酸铵缓冲液浓度为5 mmol/L。经HPLC-ELSD分析，苦马豆素在色谱上的保留时间为5. 3分钟。按照本发明所说的苦马豆素高效液相色谱分析方法，是将需测定SW含量的疯草内生真菌Undifilum oxytropis~VYL\-V^预处理样品浓度稀释30倍后进样检测。采用本发明测定疯草内生真菌中苦马豆素的含量，其苦马豆素的检测范围为 15. 625 250 μ g/mL。该方法灵敏度高，专属性强，重现性好，分析方法可靠。


图I是苦马豆素标样的HPLC- ELSD色谱图。图2是疯草内生真菌ior_7t /^5_FEL4-F5中测得的苦马豆素HPLC-ELSD色谱图。
具体实施例方式下面的具体实施例将结合附图对本发明作进一步说明。实施例I :苦马豆素标准曲线的绘制
I) Sff标准溶液的配制精确称取SW标准品，用流动相溶解，梯度稀释。2)实验仪器及色谱条件=Waters 1525型高效液相色谱仪，二元泵；Water 2424 蒸发光散射检测器，参数设置增益值为150，载气流速25 psi，漂移管温度55°C，雾化器 36°C,进样量 20 μ L ；ffaters XBridge HILIC 色谱柱(规格 150mmX4. 6mm, 3· 5 μ m);色谱分离系统的控制和记录由Breeze 2. O工作站完成。流动相由乙腈和乙酸铵缓冲液组成，体积比为I : 1，乙酸铵的浓度为5 11111101/1，添加总体积0.02%的氨水。流动相的流速为O. 5 ml/min。苦马豆素标样结果见图I。3)以不同浓度SW的对数与对应的响应峰面积的对数作图，得到SW的标准曲线。 采用本方法测定的SW浓度，在15. 625 250 μ g/mL浓度范围内表现出很好的线性关系。 得到线性回归方程为Y=L 0641X + 2. 5679，线性回归系数R2 = O. 9981。实施例2 内生真菌样品的检测
I)样品的预处理取Undifilum oxytropi5-FEL4-F5干燥菌丝O. 5g,在提取器中加入 50 mL甲醇，60 °C提取24 h。将甲醇提取液浓缩挥干，残渣用10 mL 2 %的乙酸溶液溶解，将该溶液加入到含5 cm高AG 50W阳离子树脂的交换柱中，使其动态循环交换I h，使苦马豆素与阳离子树脂充分结合；然后用100 mL去离子水冲洗树脂中的杂质；再用100 mL I mol/L的氨水溶液洗脱树脂柱，收集氨水洗脱液，浓缩挥干，用2 mL甲醇溶解，离心后取上清液并将其挥干待用。进样前用流动相15mL稀释(30倍，W/V)，结果见图2。2)实验仪器及色谱条件同实施例I。实施例3不同疯草分离的内生真菌SW含量的检测
内生真菌样品的处理同实施例2，实验仪器及色谱条件同实施例I。经HPLC- ELSD检测得到内生真菌Undifilum oxytropis中SW含量如下表
权利要求
1.一种检测疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法，其特征在于，包括下列步骤1)将内生真菌菌丝样品经预处理，制备成供试溶液；所述菌丝样品预处理是首先采用甲醇提取菌丝样品，提取液挥干后用乙酸溶解，经阳离子树脂交换柱动态循环交换I h ;用去离子水冲洗树脂中的杂质；再用稀氨水洗脱树脂柱，收集氨水洗脱液，浓缩挥干；最后甲醇溶解，离心后取上清液，挥干待用；2)用高效液相色谱仪蒸发光散射检测器检测，以体积比为O.2^2 :0. 2^2的乙腈乙酸铵缓冲液的混合液为流动相，经HILIC柱，将待检样品中的苦马豆素与其他物质分离；所述的高效液相色谱仪蒸发光散射检测器的参数设置为增益值150 ;载气流速25 psi ;漂移管温度55°C ;雾化器温度36°C ；所述的乙酸铵缓冲液浓度为5 mmol/L ；所述的流动相中还添加占流动相总体积O. 02%的氨水；3)以不同浓度苦马豆素的对数与对应的响应峰面积的对数作图，得到苦马豆素的标准曲线。
2.根据权利要求I所述的测定疯草内生真菌中苦马豆素含量的高效液相色谱法,其特征在于，所述的 HILIC 色谱柱为 Waters XBridge HILIC，规格为 150mmX 4. 6mm，3. 5 μ m。
3.根据权利要求I所述的测定疯草内生真菌中苦马豆素含量的高效液相色谱法,其特征在于，流动相为体积比1:1的乙腈乙酸铵缓冲液的混合液。
全文摘要
本发明为一种测定疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法，该方法是将内生真菌菌丝样品经预处理，制备成供试溶液；用高效液相色谱仪蒸发光散射检测器检测，以体积比为0.2~20.2~2的乙腈乙酸铵缓冲液的混合液为流动相，经HILIC柱，将待检样品中的苦马豆素与其他物质分离；以不同浓度苦马豆素的对数与对应的响应峰面积的对数作图，得到苦马豆素的标准曲线。该方法有效地分离内生真菌Undifilum oxytropis中的苦马豆素，直接应用于苦马豆素的定量分析。该方法分离效果好、专属性强、准确性高，分析方法可靠。
文档编号G01N30/02GK102590378SQ20121002422
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月5日 优先权日2012年2月5日
发明者李金成, 杨国栋, 王妍, 王建华, 耿果霞 申请人:西北农林科技大学