专利名称：一种直接检测il-6抗原的电化学免疫传感器及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫传感器，特别涉及一种直接检测IL-6的电化学免疫传感器及制备方法和检测应用。
背景技术：
白细胞介素6(IL_6)可由淋巴细胞或非淋巴细胞产生，是一种多功能细胞因子，不仅在机体免疫应答、急相反应和造血控制中起重要作用，而且其失调产生与多种临场疾病和炎症反应密切相关，如牛皮癣，风湿性关节炎，心血管疾病和炎性肠病。此外，其过高表达与几种典型癌症相关，如头颈部鳞癌(HNSCC)、结肠癌、胃肠癌。然而白细胞介素6在正常人体内浓度(6pg/ml)非常低，因此，对低浓度IL-6的检测是该领域的一大挑战。
生物医学上关于白细胞介素6的常规临床免疫分析方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法等。其中，放射免疫分析法灵敏度高，干扰少，应用范围宽，但实际寿命有限，并且其放射性标记物对人体有害；酶联免疫分析法、荧光和化学发光免疫分析法在很大程度上促进了临床免疫分析手段的自动化、智能化和网络化，但这些方法需要价格昂贵的专用仪器设备，操作复杂，成本高，难以推广使用。因此研发一种廉价、简便且适用于现场直接定量的免疫测定技术极为重要。免疫传感器检测技术是将免疫检测技术与传感检测技术相结合而形成的一类新型检测技术，是生物传感器领域发展最迅速的技术之一，具有灵敏度高、特异性强、检测快速、使用简便、低成本等许多有点。传统的免疫传感器测定技术分为两类竞争测定和夹层测定。在竞争测定中，试样中的抗原与抗原-探针复合物(通常称作报道复合物)进行混合，然后，混合物中的抗原通过竞争与抗体结合。探针可以是放射性同位素、酶、荧光团。在夹层免疫测定技术中，试样中的抗原与抗体结合，然后第二抗体-探针复合物与抗原结合。但上述方法需要对目标抗原进行处理，操作过程复杂并且耗费抗体。本发明通过在现场生长的碳纳米管上电沉积金纳米粒子作为工作电极，再在金纳米粒子上自组装上巯基乙酸分子层来固定anti-IL-6抗体，发展成一种高灵敏度、高特异性免疫传感器，可以快速直接检测液体试样中目标抗原的浓度。碳纳米管(CNTs)是一种具有一维纳米管状结构的新型纳米材料，它独特的电子特性和表面结构，能很好地促进生物电活性分子的电子传递，并易于固定生物大分子并能保持其活性。纳米金颗粒具有比表面积大、生物亲和性高等优点，并具有导电作用和加快蛋白质与电极之间的直接电子转移，适合于构建无需电子媒介物质的直接电化学生物传感器。目前，碳纳米管和纳米金作为电活性材料及载体已被广泛应用于电化学和生物传感器中，爱尔兰国立大学的Rusling教授的研究小组(Anal. Chem. 2010，82，3118)报道在高表面积、高传导性的垂直碳纳米管上固定anti-IL-6捕获抗体，捕获抗体附着在碳纳米管末端，再与样本中的IL-6目标抗原结合，接着一个被酶标记的第二抗体耦合物再与传感器上的目标抗原结合，通过电化学方法检测酶标记物的信号。另外，山东省氟化学和化工化学重点实验室的魏琴教授课题组(Biosens. Bioelectron. 2011, 26, 3714)利用纳米金大的比表面积和好的生物相容性等优点，在纳米金上固定生物分子，通过对铁氰化钾的电子转移响应电流信号来监控。但鲜有在现场生长的碳纳米管上直接电沉积纳米金粒子构建电化学免疫传感器。

发明内容
本发明目的是提供一种简单、廉价、高灵敏度且可以现场直接检测的电化学免疫传感器，提供所述IL-6免疫电化学传感器的制备方法以及检测应用，本发明电化学传感器以单壁碳纳米管为基底，将金纳米粒子沉积于单壁碳纳米管上构成单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极，杂化电极用巯基乙酸修饰，再在巯基乙酸上组装IL-6捕获抗体。本发明采用的技术方案是一种直接检测IL-6的电化学免疫传感器，所述传感器按下述方法制备(I)单壁碳纳米管以硅片或石英片为基底，以Fe/Mo纳米粒子为催化剂，以乙醇作碳源，以200ml/ min流速的氢气作为载气和保护气，将碳源带入，于石英管中1000°C下反应15min，获得单壁碳纳米管；所述Fe/Mo催化剂通过在辛基醚中热分解Fe (CO)6和Mo (CO)6获得(参见Chem. Mater. 2001，13，1008-1014);所述Fe/Mo纳米粒子中Fe和Mo物质的量之比为5 I ；
(2)单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极将单壁碳纳米管用铜丝连接作为工作电极，以钼作为对电极，以摩尔浓度O. I IOmMHAuCl4水溶液(优选ImM的HAuCl4水溶液)为电解液，在电压为-O. IV -O. 5V下进行电化学沉积5 50s，获得单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极；(3)单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极的修饰将单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极浸泡在I IOmM (优选5mM)的SHCH2C00H水溶液中，室温下浸泡3 IOh (优选5h)，取出，用水清洗，得清洗后的电极置于EDC/NHS混合水溶液中，室温下浸泡10 30min(优选IOmin)，取出用水清洗后，获得修饰后的单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极；所述EDC/NHS混合水溶液为I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液；(4)电化学免疫传感器将步骤(3)获得的修饰后的单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极浸泡在10 100 μ g/ml (优选10 μ g/ml)的IL-6捕获抗体的PBS缓冲液(pH =7. 2)中，室温(25°C )下浸泡2 8h (优选5h)，取出，用Tween-20水溶液和PBS缓冲液交替清洗，获得结合抗体的杂化电极，然后再将结合抗体的杂化电极浸泡在质量浓度I 5%(优选2 % )牛血清蛋白的PBS缓冲液(pH = 7. 2)中，室温下浸泡O. 5 2h (优选Ih)进行封闭，取出，用Tween-20水溶液和PBS缓冲液交替清洗，风干，获得所述的电化学免疫传感器。步骤(I)所述方法优选为将硅基片浸入Fe/Mo纳米粒子的庚烷溶液(Fe/Mo纳米粒子的量以Fe物质的量计，5mmol/L)，IOs后取出，晾干，转移至石英管中，然后用加热炉将石英管升温到1000°C，以乙醇作碳源，以200ml/min流速的氢气作为碳源的载气和保护气，将乙醇蒸汽(碳源)带入石英管中，1000°C下反应15min，在硅基片上获得单壁碳纳米管(SffCNTs)。步骤(I)所述单壁碳纳米管为水平平行排列的阵列结构，阵列密度控制在每100 μ M区间有4 50根单壁碳纳米管，每根单壁碳纳米管的长度位于100 μ m 2mm之间。步骤(2)所述单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极上的金纳米粒子为多级结构的金枝晶，所述金纳米粒子的负载量与沉积时间，电压和含金溶液的浓度有关，本发明中金纳米粒子的沉积条件需控制在所述的沉积时间、电压、含金溶液的浓度范围内。步骤(2)所述电压优选为-O. 5V下进行电化学沉积8 15s，更优选10s。步骤(3)所述EDC/NHS混合水溶液为1_乙基_3_ (3_ 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与水混合，使I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺终浓度为400mM, N-羟基琥珀酰亚胺终浓度为lOOmM。 步骤(4)所述用Tween-20水溶液和PBS缓冲液交替清洗的方法为用质量浓度O. 01 O. 05% (优选 O. 05% ) Tween-20 水溶液和 ρΗ7· O 7. 3 (优选 ρΗ7· 2)的 PBS 缓冲液交替清洗5次，再用蒸馏水或超纯水清洗5次。本发明提供一种所述的直接检测IL-6的电化学免疫传感器在检测IL-6抗原中的应用。进一步，所述的应用推荐按如下步骤进行1)将电化学免疫传感器置于IL-6抗原溶液中，37°C下浸泡(免疫结合)O. 5 2h (优选O. 5h)，反应结束后，取出传感器用质量浓度 O. 01 O. 05% (优选 O. 05% )的 Tween-20 水溶液和 ρΗ7· O 7. 3 (优选 ρΗ7· 2)的 PBS缓冲液交替清洗，获得结合抗原的电化学传感器；2)以步骤I)获得的结合抗原的电化学传感器作为工作电极，以钼丝为对电极，以Ag/AgCl电极作参比电极，在铁氰化钾和氯化钾混合溶液的电解液中，25°C下浸泡lh，采用电化学方法检测电极表面上的电子传递电阻，根据电子传递电阻在结合IL-6抗原前后的变化，实现定量或定性检测待检测的IL-6抗原浓度。进一步，所述IL-6抗原溶液为I X 10_17 I X 10_13g/ml的IL-6抗原的PBS缓冲溶液，所述PBS缓冲溶液pH为7. O 7. 3 (优选ρΗ7· 2)。所述铁氰化钾和氯化钾混合溶液为铁氰化钾、氯化钾和水的混合溶液，所述混合溶液中铁氰化钾终浓度为5mM，氯化钾终浓度为O. ImM。所述电化学方法检测为在频率为IOOmHz IOkHz，电压为O. 17V的条件下进行电解反应，测试电极表面上的电子传递电阻。本发明所述直接检测IL-6的电化学免疫传感器检测IL-6抗原的应用中，根据电化学检测方法检测出待测溶液中抗原的电子传递阻抗，再根据电子传递阻抗与抗原浓度对数的标准曲线图所得拟合计算公式R = 72. 19734+2. 91603*lg[C] (C为抗原浓度)，计算出待测溶液中抗原的浓度。本发明中所述的SWCNTs为单壁碳纳米管(优选单壁碳纳米管的阵列密度为每
100μ M区间有15-30根，长度位于500 μ m Imm之间)，SWCNTs-Au为单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极，anti-IL-6为白细胞介素6捕获抗体(优选来源于上海晶天生物科技有限公司)，IL-6抗原为白细胞介素6 (优选来源于上海晶天生物科技有限公司)，EDC为I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺，BSA为牛血清蛋白。本发明制备方法中的电解液可为常用的电解液，如5mM[Fe(CN)4]3_/4_ ;而所用的电化学检测方法可为现有常规的电化学检测方法，如电化学阻抗或脉冲伏安法，本发明优选电化学阻抗的方法，可定量检测电极表面的电子传递电阻。本发明利用金与巯基乙酸之间稳定的Au-S键作用，巯基乙酸的羧基又与anti-IL-6抗体的氨基通过EDC/NHS的酰胺化反应形成稳定的酰胺键，这样固定的anti-IL-6抗体既稳定不会因冲洗脱落，而且组装时间短。制备好的anti-IL-6探针电极用BSA作为封闭剂，封闭电极表面的非特异性活性位点。再通过抗原与抗体的特异性免疫结合捕获目标IL-6抗原。由于碳纳米管具有较好的电容性、导电率和比表面积，结合金纳米粒子的信号放大作用及较好的生物相容性，使得该传感器在目标抗原浓度极低时也有明显的信号。电子传递电阻的变化值与免疫结合IL-6抗原的浓度对数之间成良好的线性关系(图4)，这表明了该传感器成功实现对目标IL-6抗原的检测，其检测限可达到I X IO-1Vml，这无疑解决了对IL-6抗原在人体内低浓度检测难题。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明的电化学免疫传感器具有制备过程简便、无需标记或夹心处理、成本低廉、检测灵敏度高等优点，可广泛用于各种免疫分析和检测，且本发明制备的电化学免疫传感器对目标IL-6抗原的检测限可达到I X 10 17g/ml。


图I是本发明的电化学免疫传感器的制备原理示意图； 图2是实施例I中SWCNTs-Au电极的扫描电子显微镜(SEM)图，其中a为SWCNTs的SEM图；b为在SWCNTs上沉积纳米金后得到的SWCNTs-Au杂化电极的SEM图；c为SWCNTs-Au杂化电极局部放大图；d为SWCNTs上沉积纳米金后得到的SffCNTs-Au杂化电极的能谱图；图3是本发明电化学传感器检测不同浓度白细胞介素6(IL_6)的电化学阻抗图，曲线a为SWCNTs-Au在含5mM[Fe (CN)4] 3_/4_和O. IM KCl的溶液中的电化学阻抗线；曲线b为自组装巯基乙酸并用EDC/NHS处理后的SWCNTs-Au电极在含5mM[Fe (CN) 4] 条和O. IM KCl的溶液中的阻抗线，曲线c为自组装anti-IL-6抗体后的电极在含5mM[Fe (CN) 4] 3_/4_和O. IMKCl的溶液中的阻抗线，曲线d为用BSA封闭电极上非特异性吸附位点后的电化学阻抗线，曲线 e-i 分别为与含有 I X l(T17g/ml、I X l(T16g/ml、I X l(T15g/ml、I X l(T14g/ml、I X l(T13g/ml的IL-6抗原发生免疫反应结合后在含5mM[Fe(CN)4Z]3_/4_和O. IM KCl的溶液中的电化学阻抗线；图4为电化学传感器工作的模拟电路图；图5是采用本发明的电化学免疫传感器分别与不同浓度(lX10_17g/ml、lX10_16g/ml、I X 10_15g/ml、I X 10_14g/ml、I X 10_13g/ml)的IL-6抗原发生免疫结合后，电子传递电阻的变化值与免疫结合的IL-6抗原浓度的对数之间的线性关系图，即抗原浓度-阻抗值的工作曲线，根据工作曲线拟合出计算公式R = 72. 19734+2. 91603*lg[C]，这为今后检测IL-6抗原提供依据。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I(I) SffCNTs-Au杂化电极的制备Fe/Mo 纳米粒子的制备参见 Chem. Mater. 2001，13，1008-1014，本发明所用 Fe/Mo纳米粒子的Fe/Mo物质的量之比为5 I。如图I所示采用化学气相沉积(CVD)法，首先将I X Icm硅基片浸入Fe/Mo纳米粒子的庚烷溶液(Fe/Mo纳米粒子的量以Fe物质的量计，5mmol/L)，IOs后取出，晾干，转移至石英管(长80cm，外径25mm，厚度I. 5mm)中，然后用加热炉将石英管升温到1000°C，以乙醇作碳源，以200ml/min流速的氢气作为碳源的载气和保护气，将乙醇蒸汽(碳源)带入石英管中，1000°C下反应15min，在硅基片上获得单壁碳纳米管(SWCNTs)，电镜扫描图见图2中a所示，所述单壁碳纳米管为水平平行排列的阵列结构，阵列密度控制在每100 μ M区间有10 25根单壁碳纳米管，每根单壁碳纳米管的长度位于500 μ m Imm之间。然后将SWCNTs用铜丝连接作为工作电极，以IOml (ImM)的HAuCl4水溶液为电解液，以Pt片作为对电极，采用电流时间曲线法，调节电压为-O. 5V，用两电极体系沉积IOs后，关闭电源，工作电极用超纯水淋洗，用洗耳球吹干工作电极表面，得到单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极(SWCNTs-Au杂化电极)，电镜扫描见图2中的b和c所示，能谱图见图2中的d所示。
(2)电化学传感器的制备将(I)中得到的SWCNTs-Au杂化电极浸泡在Iml的5mM的巯基乙酸水溶液中，在室温(25°C)条件下浸泡5h进行自组装，浸泡结束后，取出用超纯水冲洗3次，吹干后，再置于EDC/NHS混合水溶液Iml (所述EDC/NHS混合溶液中，EDC终浓度为400mM，NHS终浓度为IOOmM)中室温下浸泡lOmin，取出，用水清洗，获得修饰后的杂化电极，再将修饰后的杂化电极浸泡在Iml的10 μ g/ml的anti-IL-6捕获抗体的PBS缓冲溶液(pH = 7. 2)中，在室温条件下浸泡5h进行自组装，然后用质量浓度O. 05%的Tween-20水溶液和pH = 7. 2的PBS缓冲液交替清洗5次，洗去电极表面的非特异性吸附的anti-IL-6捕获抗体，再用超纯水冲洗5次吹干后，获得结合捕获抗体的杂化电极。最后将上述结合捕获抗体的杂化电极置于质量浓度2%的牛血清蛋白(BSA)的PBS缓冲溶液(pH = 7. 2)中，室温下浸泡Ih封闭电极表面的活性位点，取出，用质量浓度O. 05%的Tween-20水溶液和pH = 7. 2的PBS缓冲液5次冲洗后，获得所述电化学传感器，放在4°C条件下备用。将上述获得的SWCNTs-Au杂化电极(图3中的a所示)、修饰后的杂化电极(图3中的b所示)、结合捕获抗体的杂化电极(图3中的c所示)、电化学传感器(图3中的d所示)分别作为工作电极，以钼丝为对电极，以Ag/AgCl电极作参比电极，然后在电化学工作站(Autolab PGSTAT302)中进行电化学阻抗实验，接通电路，控制电压O. 17V，频率IOOmHz 10kHz，得电化学交流阻抗曲线如图3所示，电路拟合后记录各自的电子传递阻抗，工作模拟电路图如图4所示。图3(a，b，c，d)结果所示，在SWCNTs-Au杂化电极上修饰EDC和NHS，以及捕获抗体之后的阻抗值增大，证明了在SWCNTs-Au杂化电极上已成功修饰相应的物种。(3)IL_6抗原的检测将上述所得的电化学传感器浸泡在浓度为I X 10_17g/ml的IL-6抗原的PBS缓冲溶液(pH = 7. 2)中，在37°C下免疫结合30min，取出，用质量浓度O. 05%的Tween-20水溶液和pH = 7. 2的PBS缓冲液交替冲洗5次后，再用超纯水冲洗，洗去非特异性免疫吸附在电极表面的IL-6抗原,获得结合抗原的电化学传感器。把上述制作好的结合抗原的电化学传感器浸入铁氰化钾和氯化钾混合溶液的电解液中，所述的铁氰化钾终浓度为5mM，氯化钾终浓度为O. lmM，25°C下浸泡时间为lh。在电化学工作站(Autolab PGSTAT302)中测试，以结合抗原的电化学传感器为工作电极，以钼丝为对电极，以Ag/AgCl电极作参比电极，然后进行电化学阻抗实验，接通电路，控制电压O. 17V，频率IOOmHz 10kHz，得电化学交流阻抗曲线，电路拟合后记录传感器的电子传递电阻(如图3中曲线e)，与未结合IL-6抗原的工作电极所获得的交流阻抗曲线明显不同(如图3中曲线d)，计算其传递电阻变化值为21. 9k Ω (以传递电阻变化值为纵坐标，以抗原浓度对数为横坐标，制作标准曲线，如图5所示)。实施例2将按实施例I方法获得的电化学传感器放入浓度为I X 10_16g/ml的IL_6抗原的PBS缓冲溶液(pH = 7. 2)中，在37°C下免疫结合30min，其他操作同实施例1，记录电化学阻抗曲线(如图3中曲线f)，与未结合IL-6抗原的工作电极所获得的交流阻抗曲线明显不同(如图3中曲线d)，计算其传递电阻变化值为25. 7k Ω (以传递电阻变化值为纵坐标，以抗原浓度对数为横坐标，制作标准曲线，如图5所示)。实施例3将按实施例I方法获得的电化学传感器放入浓度为I X 10_15g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫结合30min，其他操作同实施例1，记录电化学阻抗曲线(如图3中曲线g)，与未结合IL-6抗原的工作电极所获得的交流阻抗曲线明显不同(如图3中曲线d)，计算其传递电阻变化值为28. 9k Ω (以传递电阻变化值为纵坐标，以抗原浓度对数为横坐标，制作标准曲线，如图5所示)。实施例4将按实施例I方法获得电化学传感器放入浓度为I X 10_14g/ml的IL-6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫结合30min，其他操作同实施例1，记录电化学阻抗曲线(如图3中曲线h)，与未结合IL-6抗原的工作电极所获得的交流阻抗曲线明显不同(如图3中曲线d)，计算其传递电阻变化值为30. 4k Ω (以传递电阻变化值为纵坐标，以抗原浓度对数为横坐标，制作标准曲线，如图5所示)。
实施例5将按实施例I方法获得的电化学传感器放入浓度为I X 10_13g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫结合30min，其他操作同实施例1，记录电化学阻抗曲线(如图3中曲线i)，与未结合IL-6抗原的工作电极所获得的交流阻抗曲线明显不同(如图3中曲线d)，计算其传递电阻变化值为34. IkQ (以传递电阻变化值为纵坐标，以抗原浓度对数为横坐标，制作标准曲线，如图5所示)。实施例6将按实施例I方法获得的电化学传感器放入浓度为5X 10_17g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫结合30min，其他操作同实施例1，记录电化学阻抗曲线(如图3中曲线j)，计算出传递电阻变化值为24. 64k Ω，根据上述实施例I 5获得的线性关系公式R = 72. 19734+2. 91603*lg[C] (C为抗原浓度)，可以计算出其浓度为4. 91 X 10_17g/ml，与实际浓度5X10_17g/ml接近，相对误差为1.8%。实施例7将按实施例I方法获得的电化学传感器放入浓度为5X 10_16g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫结合30min，其他操作同实施例1，记录电化学阻抗曲线(如图3中曲线k)，计算出传递电阻变化值为27. 6kQ,根据上述实施例I 5获得的线性关系公式R = 72. 19734+2. 91603*lg[C] (C为抗原浓度)，可以计算出其浓度为5. 08X 10_16g/ml，与实际浓度5X10_16g/ml接近，相对误差为1.6%。实施例8将按实施例I方法获得的电化学传感器放入浓度为5X 10_14g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫结合30min，其他操作同实施例1，记录电化学阻抗曲线(如图3中曲线I)，计算出传递电阻变化值为33. 4kQ,根据上述实施例I 5获得的线性关系公 式R= 72. 19734+2. 91603*lg[C] (C为抗原浓度)，可以计算出其浓度为4. 96X 10_16g/ml，与实际浓度5X10_14g/ml接近，相对误差为O. 8%。
权利要求
1.一种直接检测IL-6的电化学免疫传感器，其特征在于所述传感器按下述方法制备(I)单壁碳纳米管以硅片或石英片为基底，以Fe/Mo纳米粒子为催化剂，以乙醇作碳源，以氢气作为碳源的载气和保护气，于石英管中1000°C下反应15min，获得单壁碳纳米管；所述Fe/Mo纳米粒子中Fe和Mo物质的量之比为5 I ； (2)单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极将单壁碳纳米管用铜丝连接作为工作电极，以钼作为对电极，以摩尔浓度0. I IOmMHAuCl4水溶液为电解液，在电压为-0. IV -0. 5V下进行电化学沉积5 50s，获得单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极；(3)单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极的修饰将单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极浸泡在I IOmM的SHCH2C00H水溶液中，室温下浸泡3 10h，取出，用水清洗，得清洗后的电极置于EDC/NHS混合水溶液中，室温下浸泡10 30min，取出用水清洗后，获得修饰后的单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极；所述EDC/NHS混合水溶液为I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液；(4)电化学免疫传感器将步骤(3)获得的修饰后的单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极浸泡在10 100 u g/ml的IL-6捕获抗体的PBS缓冲液中，室温下浸泡2 8h，取出，用Tween-20水溶液和PBS缓冲液交替清洗，获得结合抗体的杂化电极，然后再将结合抗体的杂化电极浸泡在质量浓度I 5%牛血清蛋白的PBS缓冲液中，室温下浸泡0. 5 2h进行封闭，取出，用Tween-20水溶液和PBS缓冲液交替清洗，风干，获得所述的电化学免疫传感器。
2.如权利要求I所述的直接检测IL-6的电化学免疫传感器，其特征在于步骤(3)所述EDC/NHS混合水溶液为I-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与水混合，使I-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺终浓度为400mM，N-羟基琥珀酰亚胺终浓度为lOOmM。
3.如权利要求I所述的直接检测IL-6的电化学免疫传感器，其特征在于步骤(4)所述用Tween-20水溶液和PBS缓冲液交替清洗的方法为用质量浓度0. 01 0. 05% Tween-20水溶液和PH7. 0 7. 3的PBS缓冲液交替清洗5次，再用蒸馏水清洗5次。
4.一种如权利要求I所述的直接检测IL-6抗原的电化学免疫传感器在检测IL-6抗原中的应用。
5.如权利要求4所述的直接检测IL-6抗原的电化学免疫传感器在检测IL-6抗原中的应用，其特征在于所述的应用包括以下步骤1)将电化学免疫传感器置于IL-6抗原溶液中，37°C下浸泡0. 5 2h，反应结束后，取出传感器用质量浓度0. 01 0. 05%的Tween-20水溶液和PH7. 0 7. 3的PBS缓冲液交替清洗，获得结合抗原的电化学传感器；2)以步骤I)获得的结合抗原的电化学传感器作为工作电极，以钼丝为对电极，以Ag/AgCl电极作参比电极，在铁氰化钾和氯化钾混合溶液的电解液中，采用电化学方法检测电极表面上的电子传递电阻。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述IL-6抗原溶液为IX 10_17 I X 10_13g/ml的IL-6抗原的PBS缓冲溶液，所述PBS缓冲溶液pH值为7. 0 7. 3。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述铁氰化钾和氯化钾混合溶液为铁氰化钾、氯化钾和水的混合溶液，所述混合溶液中铁氰化钾终浓度为5mM，氯化钾终浓度为0.ImM0
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述电化学方法检测为在频率为IOOmHz IOkHz ,电压为0. 17V的条件下测试电极表面上的电子传递电阻。
全文摘要
本发明公开了一种直接检测IL-6的电化学免疫传感器及应用，所述传感器以单壁碳纳米管为基底，将金纳米粒子沉积于单壁碳纳米管上构成单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极，杂化电极用巯基乙酸修饰，再在巯基乙酸上组装IL-6捕获抗体，再用质量浓度1～5％牛血清蛋白的PBS缓冲液封闭，获得所述电化学免疫传感器；本发明的电化学免疫传感器具有制备过程简便、无需标记或夹心处理、成本低廉、检测灵敏度高等优点，可广泛用于各种免疫分析和检测，且本发明制备的电化学免疫传感器对目标IL-6抗原的检测限可达到1×10-17g/ml。
文档编号G01N27/327GK102706939SQ20121007496
公开日2012年10月3日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者杨婷, 王舜, 金辉乐, 陈锡安 申请人:温州大学