专利名称：胃癌诊断专用微流控芯片的制作方法
技术领域：
胃癌诊断专用微流控芯片
技术领域：
本实用新型涉及一种复合纳米微粒修饰电极的胃癌诊断器件，该胃癌诊断器件是基于抗原/抗体特异性反应来诊断胃癌的专用微流控芯片，属于分析测试领域。
背景技术：
胃癌(Stomach cancer)是消化系统最常见的癌症之一，居消化道疾病死亡原因首位，我国胃癌死亡率为25. 2/10万(男性32. 8/10万，女性17. 0/10万)，占全部癌症死亡的23.2%，居癌症死亡的第一位(男性是女性的1.9倍)。因此，开发简单、快速、高敏感性和特异性诊断方法、试剂和器件，对胃癌进行早期诊断和早期治疗是防治胃癌并降低病死率的最有效办法。目前，临床上用来诊断胃癌的方法有纤维内窥镜检查、脱落细胞学检查、B超检查、CT检查、X射线检查以及生物学与生物化学检查等方法。前五种方法虽然检测技术准确可靠，但设备昂贵，前处理繁琐耗时且需专业的实验室和医护人员，很难推广并普及至广大胃癌患者现场以及廉价应用。基于免疫学的生物学与生物化学检查方法具有免疫分析本身特有的高选择性，对胃癌的早期诊断，判断疗效及预后等方面均有重要意义。然而胃癌的检测比较复杂，传统的免疫分析通常只针对其单一的诊断抗原进行检测。由于同一种诊断抗原可能出现在不同的癌症中，或不同种诊断抗原可在同一癌症中同时出现，胃癌的诊断抗原主要有CEA抗原、CA12-5抗原、CA19-9抗原、CA72-4抗原等几种抗原，因此，开展高效的多重免疫联检分析方法，从生物相关性的角度同时真实地定性、定量反映多种诊断抗原的种类和数量，在早期预防和检测胃癌、判断胃癌发展程度、观察和评价胃癌治疗效果等方面都具有重要的医学价值。电化学免疫传感器结合了电化学检测的高灵敏度和免疫分析的高特异性，具有样品用量小、检测快速、结果准确等突出优点，已广泛用于癌症诊断抗原的检测，其自动化程度高、廉价、易制备、快速灵敏等独特优势，配合免疫反应的高效专一，非常适合构建胃癌多重免疫分析检测的分析仪。有“生命科学集成电路”之称的微流控芯片是构建微型化、集成化的电化学免疫传感器的理想技术。微流控芯片技术是将采样、预处理、加试剂、反应、分离、检测等集成在一块微芯片上完成的一门前沿技术，具有分析速度快、信息量大、试剂消耗少、污染小、操作费用低、仪器使用简便等优点且非常适合工业化生产。微流控技术代表着21世纪分析仪器走向微型化、集成化的发展方向。构建适合于胃癌检测的微流控安培检测芯片具有以下优势(1)通过微加工技术很容易在芯片上集成多个检测通道和检测电极，做到多种胃癌诊断抗原同时分析，技术可行性高。(2)通过微流动注射技术，样品在管路中的流动保证了电极表面时刻更新，较好克服了电极易被污染、假阳性率高、结果平行性差等问题。(3)微流控传感器上管路直径只有μ m级，反应池体积也只有μ L级，分析时所需试剂用量极少，分析物到达电极表面的扩散距离短、因此可以大大减少温育时间，实现快速联检目标。(4)目前微流控传感器多基于光学检测系统，仪器昂贵体积大，全集成很难，而且检测成本很高，限制了其推广。而安培免疫传感器中采用电化学检测，体积小、自动化程度高、成本低。目前，在微流控芯片技术领域，利用胃癌多种诊断抗原的同时检测来快速诊断胃癌的相关技术和方法尚未见报道。

实用新型内容本实用新型所要解决的技术问题是，在微流控芯片技术这样一个总的技术框架内，研发出一种能够利用胃癌的多种诊断抗体来对胃癌的多种诊断抗原进行同时检测、快速诊断的专用微流控芯片。本实用新型通过如下方案解决所述技术问题，该方案提供的装置是一种胃癌诊断专用的微流控芯片，该微流控芯片的结构包括贴合装设在一起的两片板状物，所述两片板状物分别是一盖片以及一基片，在所述两片板状物之间的相互贴合的位置上装设有管道、 三个池状物和依序分别装设在所述管道内不同位置上的工作电极、对电极以及参比电极， 管道的一端经由歧管状流体通道分别与其中的两个池状物联通，管道的另一端与余下的另一个池状物联通，所述工作电极由金属电极以及涂覆在金属电极表面的膜组成，所述膜由石墨烯、纳米金、胃癌诊断抗体与高分子Nafion溶液的混合物构成。作为本实用新型的进一步改进，所述管道的构造呈并联构造，所述呈并联构造的管道由四条分支管道并联构成，以及，所述工作电极的数量是四个，该四个工作电极的装设位置分别位于所述四条分支管道内，以及，该四个工作电极表层涂覆的胃癌诊断抗体物质分别是能与胃癌诊断抗原能特异性结合的CEA抗体、CA12-5抗体、CA19-9抗体和CA72-4抗体。所述工作电极上的膜为复合纳米微粒敏感膜，其中包埋了胃癌诊断抗体。该膜是将石墨烯、纳米金、各种胃癌诊断抗体与高分子的Nafion溶液充分混合并振荡均勻，通过微量注射器滴加于金属电极表面并使其过夜干燥成膜而成。所述微流控芯片结构中的管道，其内径尺寸均可以是任意选定的尺寸，但是，出于尽量少用待测液样以及降低试剂损耗等方面的考虑，所述管道最好均选用毛细管级的通道，所述毛细管级的通道意即毛细管通道，其内径与通常意义上的毛细管的内径相当。所述毛细管其内部通道的横截面形状可以是任意的形状，所述横截面形状例如圆形、椭圆形、方形、矩形、条形，当然也可以是任意的存在弯曲的线形，并且，所述毛细管的内部形状随着管道的延伸，不同部位的横截面形状也可以允许是不同的形状。本案微流控芯片的结构中涉及若干种电极，其尺寸是适于安置在相应位置管道内的尺寸，但是，基于尽量少用待测液样以及降低试剂损耗等方面的考虑，所述电极均为适于安置在毛细管内的微小尺寸的电极， 其中的每一个电极的形状均可以是任意选定的形状，所述任意选定的形状例如方片形状、 矩形片状、条状或圆形片状等等。其中的每一个电极的材料均可以是任意选定的材料，所述任意选定的材料例如金、银、钼或其它金属等。本案微流控芯片结构中涉及若干个池状物，所述池状物是用于实际被测血清样品、缓冲溶液以及废液存储的池形或囊形构造，其中的每一个池状物的内腔其形状均可以是任意选定的形状，所述内腔形状例如圆柱形空腔状、方柱形空腔状、椭圆形空腔状或球形空腔状等等。所述池状物的尺寸可以是任意选定的尺寸，但是，为了能够尽量少用待测液样以及降低试剂损耗，所述池状物最好是能够与毛细管匹配的微小型的池状物。[0012]本案装置当然还可以进一步包括一些附件，所述附件例如多道电化学工作站以及微流动泵等等，所述多道电化学工作站的技术含义以及微流动泵的技术含义是公知的。本案微流控芯片结构中涉及的各个工作电极以及对电极以及参比电极等，可以分别经由相应的专用串线与所述多道电化学工作站的相应接口进行联接。所述专用串线是用来将各所述电极与所述多道电化学工作站的各相应接口进行相互联接的专用电缆。所述微流动泵专用于驱动微量液体流动，所述微流动泵可以与按需选定的任意一个所述池状物联通。本案微流控芯片的具体实现路径可以有多种方法，选其一详解如下一、高聚物(聚碳酸酯PC)盖片上化学镀微金电极的制备1、以石英/铬板为光掩模，用选择波长的紫外光作为光源对PC盖片表面的选择性区域进行辐射，生成羧基。2、采用已二胺作为胺化剂，l-[3，-(N_N-二甲基胺)丙基]_3_已基碳二亚胺盐酸盐为偶合剂对经过选择性区域照射的PC盖片进行胺化反应，形成酰胺键。3、将经过选择性区域胺化反应的PC盖片浸入一定浓度的氯金酸溶液中反应，金离子络合于胺基表面。4、用蒸馏水清洗以后，再将其浸入硼氢化钠溶液中还原8min。5、用蒸馏水清洗以后，再将其浸入0. 5mol/L的硫氰化钾溶液中超声清洗30min， 防止过镀。6、将经过清洗的PC盖片浸入含有金离子、络合剂和还原剂甲醛的镀液中，于 45-60°C下反应 lh。7、将镀有微金电极的盖片放入烘箱中退火处理约池，即得到本发明的高聚物PC 多微金电极盖片。其中微金电极长3mm，宽3mm，厚度约为0. 1mm。相互之间间距约为3mm。二、带有微通道的高聚物(聚碳酸酯PC)基片的制作1、制作单晶硅阳模绘制芯片设计图，图形线条宽度约为25-100 μ m，采用高清晰激光照排系统输出在透明的胶片上，即得到光刻掩模。通过化学气相沉积法在基片表面上沉积一层氮化硅薄膜作为牺牲层，在此基片上通过旋转覆膜技术覆盖一层光敏胶，于烘箱中60°C处理15-20min ；将光刻掩模覆盖在基片上，通过暴光成像的原理将光刻掩模上的图像转移到基片表面的光胶层上；通过干法腐蚀的方法将光胶层上的平面二维图形加工成具有一定深度的立体结构。即可得到具有凸起的通道的单晶硅阳模。制备好的单晶硅阳模依次用H2A H2SO4溶液(体积比为1 4)，丙酮和蒸馏水清洗，以除去其表面的氧化物。2、采用热压法复制微通道将PC片切割成长约km，宽3cm的尺寸。超声清洗，自然晾干，在热压装置中将PC 片加热到软化温度(110°C)左右，然后在单晶硅阳模上施加一定的压力，并持续约IminjP 可在PC片压制出与单晶硅阳模互补的微通道。然后，将阳模和刻有微通道的PC基片一起冷却后脱模，就得到所需的微通道。3、在盖片上制作三个微小型池状物在盖片上采用电钻在不同的位置上分别钻出三个微小型池状物。三、将高聚物微金电极盖片和带有微通道的高聚物基片在低温氧等离子气氛中处
5理干净。四、将含有石墨烯、纳米金、胃癌诊断抗体与高分子Nafion溶液的混合物溶液分别涂覆于对应的微金工作电极上，过夜干燥。五、芯片封合在显微镜下对准高聚物微金电极盖片和带有微通道的高聚物基片，将此基片和盖片固定并用二片盖玻片夹紧，放置在烘箱中于一定温度下保温15min，即可得到所需的四通道微流控芯片。六、将步骤四所完成的PC片分别在工作电极、参考电极及对电极末端利用银胶接上铜片作为导线，待银胶完全干后再封上热熔胶以固定铜片，即完成整个四通道微流控芯片的制作。详解的本案微流控芯片的上述具体实现路径其相关各个操作参数可以根据实际需要进行调整。本案微流控芯片的使用方法采用外加微泵驱动液流在四通道微流控芯片的毛细管通道中稳定流动，利用四通道电化学分析仪器分别对四种胃癌诊断抗原加以检测。本案微流控芯片的具体检测使用步骤如下1、采用四通道电化学分析仪，在微管路中通入一定浓度的作为电子媒介体的铁氰化钾溶液，在外加微泵驱动下，采用安培法检测上述过程的电流大小。2、在微管路中加入实际血清样品液，在外加微泵驱动下，各种胃癌诊断抗原分子被各通道中工作电极表面上相应的胃癌诊断抗体分子捕获。3、胃癌诊断抗体分子与血清样品中的胃癌诊断抗原分子形成免疫复合物，对电子媒介体铁氰化钾的电子传递起到一定的阻碍作用，安培法检测上述过程的电流减小程度。4、将电流减小程度的结果进行综合分析，由此获得各种胃癌诊断抗原分子的种类和含量，对胃癌情况进行综合诊断。本实用新型的优点是，在一块物理器件即微流控芯片上集成了分别涂覆有四种胃癌诊断抗体物质的四个工作电极，该四个工作电极分别针对检测胃癌的四种特征诊断抗原，本案微流控芯片集成构造的结构特点决定了该芯片的使用有助于加快胃癌诊断速度、 提高诊断准确率、降低诊断费用。

图1是本案微流控芯片实施例构造示意图，所展示的是该例结构的俯视角度下的透视的形态，图中未描绘出所述附件。图中，1、2、11分别是三个装设位置不同的池状物，3是歧管状流体通道，4代表装设位置不同但相互并联形成并联联通结构的各种管道以及分支管道，5是装设在管道内的其表层涂覆石墨烯、纳米金、胃癌诊断CEA抗体与高分子Nafion溶液的混合物的工作电极， 6是装设在管道内的其表层涂覆石墨烯、纳米金、胃癌诊断CA12-5抗体与高分子Nafion溶液的混合物的工作电极，7是装设在管道内的其表层涂覆石墨烯、纳米金、胃癌诊断CA19-9 抗体与高分子Nafion溶液的混合物的工作电极，8是装设在管道内的其表层涂覆石墨烯、 纳米金、胃癌诊断CA72-4抗体与高分子Nafion溶液的混合物的工作电极，9是对电极，10是参比电极。
具体实施方式
在图1所展示的本案实施例中，该器件也即微流控芯片的结构，包括贴合装设在一起的两片板状物，两片板状物分别是微流控芯片的盖片以及微流控芯片的基片。在两片板状物之间的相互贴合的位置上装设有管道，以及，三个池状物。该三个池状物分别是实际血清样品存储的池状物1、缓冲溶液存储的池状物2和废液存储的池状物11。所述管道的一端经由歧管状流体通道3分别与池状物1以及池状物2联通，所述管道的另一端与余下的一个池状物11联通。该微流控制片还设有依序分别装设在所述管道内不同位置上的工作电极、对电极9和参比电极10。工作电极包括金属电极以及在金属电极表层涂覆由石墨烯、纳米金、胃癌诊断抗体与高分子Nafion溶液的混合物构成的敏感膜。所述管道的构造呈并联构造，该呈并联构造的管道由四条分支管道并联构成，工作电极的数量是四个，该四个工作电极分别是工作电极5，6，7，8。其中，工作电极5是装设在分支管道内的其表层涂覆石墨烯、纳米金、胃癌诊断CEA抗体与高分子Nafion溶液的混合物的工作电极，工作电极6 是装设在分支管道内的其表层涂覆石墨烯、纳米金、胃癌诊断CA12-5抗体与高分子Nafion 溶液的混合物的工作电极，工作电极7是装设在分支管道内的其表层涂覆石墨烯、纳米金、 胃癌诊断CA19-9抗体与高分子Nafion溶液的混合物的工作电极，工作电极8是装设在分支管道内的其表层涂覆石墨烯、纳米金、胃癌诊断CA72-4抗体与高分子Nafion溶液的混合物的工作电极。本实用新型微流控芯片的附件还有微流动泵及多道电化学工作站等附件(未图示)。本例结构中的各池状物可以根据需要与作为附件的微流动泵按任何方式联通。本例结构中的各工作电极以及对电极以及参比电极可以分别经由各自专用的电缆或曰串线分别与作为附件的多道电化学工作站的对应电缆接口或曰串线接口联接。
权利要求1.一种胃癌诊断专用的微流控芯片，其特征在于该微流控芯片的结构包括贴合装设在一起的两片板状物，所述两片板状物分别是一盖片以及一基片，在所述两片板状物之间的相互贴合的位置上装设有管道、三个池状物和依序分别装设在所述管道内的工作电极、 对电极以及参比电极，管道的一端经由歧管状流体通道分别与其中的两个池状物联通，管道的另一端与余下的另一个池状物联通，所述工作电极由金属电极以及涂覆在金属电极表面的含胃癌诊断抗体的敏感膜构成。
2 根据权利要求1所述的胃癌诊断专用的微流控芯片，其特征在于所述管道的构造呈并联构造，所述呈并联构造的管道由四条分支管道并联构成，以及，所述工作电极的数量是四个，该四个工作电极的装设位置分别位于所述四条分支管道内。
3.根据权利要求1所述的胃癌诊断专用的微流控芯片，其特征在于该四个工作电极其表层的胃癌诊断抗体分别是对胃癌诊断抗原能特异性结合的抗体，该四种抗体物质分别是胃癌诊断抗体CEA抗体、CA12-5抗体、CA19-9抗体和CA72-4抗体。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的胃癌诊断专用的微流控芯片，其特征在于所述管道均为毛细管通道。
专利摘要本实用新型涉及一种复合纳米微粒修饰电极的胃癌诊断器件，该器件是微流控芯片，属于分析测试领域。该微流控芯片内含有呈并联构造的管道，该并联构造含有四条相互并联的分支管道，共有四个工作电极分别装设在所述四条分支管道内，所述工作电极由金属电极以及涂覆在其表面的含有石墨烯、纳米金、胃癌诊断抗体与高分子Nafion溶液的混合物构成，该四个工作电极表面的胃癌诊断抗体物质分别是特异性抗体CEA抗体、CA12-5抗体、CA19-9抗体和CA72-4抗体，该芯片具有简约、集成的结构。本实用新型有利于加快胃癌诊断速度、提高诊断准确率、降低诊断费用。
文档编号G01N33/561GK202083692SQ20112008262
公开日2011年12月21日 申请日期2011年3月16日 优先权日2011年3月16日
发明者李龙飞, 杨欣, 满沛志, 牛兴杰, 肖志杰, 袁吉, 郑甜 申请人:怀化学院