专利名称：一种橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量测定方法
技术领域：
本发明涉及一种橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量测定方法，针对可溶性糖和淀粉的检测。
背景技术：
天然橡胶(顺式多聚异戊二烯)是重要的商业、国防和交通工业原料(Ko J H etal.，2003)。目前全球所需天然橡胶的90%左右来自巴西橡胶树。淀粉的动员对于胶乳再 生和补偿持续割胶伤害有不可忽略的作用。木质部中淀粉可以看做一种长效储存源，而树皮中淀粉只是作为即时的缓冲。木质部中的可溶性糖作为一个转运库，树皮中的可溶性糖可以被看做一种中间的、随时准备被使用的储藏。对树皮和木质部中淀粉消长规律进行研究对于我们分析不同胶树产胶潜力和调整割胶强度有重要意义，在此条件下掌握橡胶树树皮和木质部的可溶性糖和淀粉提取和测定方法是解决这项工作的前提。目前，人们对于树木淀粉提取的研究较少，在我国，80年代初期梁尚朴对橡胶树树木的淀粉含量进行过测定(割胶制度改革论文集一，P148-153)，由于条件限制，当时使用割胶后的树皮直接染色后按照颜色深浅分级，肉眼分辨淀粉的等级，该方法没有将淀粉含量定量，也没有测定木质部淀粉含量。在国外，加拿大研究人员对于杨树和松树的叶子和根的淀粉进行提取和测定，采用的是酶解的方法(Pak S C and Simon M L，2004)，由于该方法操作过程步骤较多，花费时间长，需要的样品量较多，对于橡胶树而言，树皮是割胶的保证，尽量保护试验用树也是保障后续试验能顺利进行的基础，因此，所述方法并不适合于橡胶树的树木淀粉检测。如何建立橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物提取及含量测定方法，成为本领域需要解决的技术问题，目前，关于这方面的技术成果，并未见诸报道。

发明内容
本发明的目的在于，鉴于目前本领域对于分析不同胶树产胶潜力和调整割胶时间和强度没有一种较为理想的检测方法，提供一种利用橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物提取及含量测定方法。本发明的目的是这样实现的一种橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量测定方法，其特征在于分别建立可溶性糖626nm处光吸收量的标准曲线和淀粉580nm处光吸收量的标准曲线；从橡胶树树皮和木质部中取样后，分别提取树皮和木质部样品中可溶性糖提取液和淀粉提取液；定容ΙΟΟμΙ可溶性糖提取液加入3ml蒽酮试剂，90°C保温15min，冷却至室温后在626nm处测定光吸收量，对照可溶性糖的标准曲线，分别计算树皮和木质部样品的可溶性糖含量；取2ml淀粉提取液加入100μ1Ι2_ΚΙ溶液，在580nm处测定光吸收量，对照淀粉的标准曲线，分别计算树皮和木质部样品的淀粉含量。在本发明的技术方案中
可溶性糖标准曲线是这样建立的首先确定用硫酸-蒽酮法测定可溶性糖含量的最高光吸收峰用80%乙醇溶液分别配制浓度为lmg/ml的葡萄糖溶液和蔗糖溶液，将它们分别按照1:4、3:7、1:1、7:3和4:1体积比混合形成ΙΟΟμΙ的可溶性糖混合液，在可溶性糖混合液加入3ml硫酸-蒽酮试剂，90°C保温15min,冷却至室温后在300nm-900nm范围内扫描光吸收,确定可溶性糖混合液扫描最高吸收峰为626nm处；
再利用硫酸-蒽酮法测定不同浓度梯度可溶性糖在626nm光吸收下的标准曲线，选取的可溶性糖浓度分别为OKg/ml、200Pg/ml、300Pg/ml、400Pg/ml、600Pg/ml、800Pg/ml、lOOOPg/ml，取ΙΟΟμΙ加入3ml硫酸-蒽酮试剂，90°C保温15min，冷却至室温后626nm处测定光吸收；以光吸收测定值为横坐标，可溶性糖浓度为纵坐标绘制标准曲线；
硫酸-蒽酮试剂是用150mg蒽酮溶于IOOml稀硫酸配制成的,其中，IOOml稀硫酸采用70ml浓硫酸与30ml水混合；
淀粉的标准曲线是这样建立的
首先配制以下溶液80%Ca (NO3) 2溶液的配制80gCa (NO3) 2· 2Η20溶于水中，定容至100ml ；I2-KI溶液的配制1. 3gl2加上3. 5gKI，溶解后容量瓶定容至IOOml ;用lmg/ml淀粉母液按比例用 80%Ca (NO3) 2 溶液分别稀释成 5(^g/ml、100μδ/πι1、200μδ/πι1、300μδ/πι1、400μδ/πι1淀粉溶液；
取不同浓度淀粉母液2ml，加入ΙΟΟμΙI2-KI溶液，在580nm处测定光吸收，以光吸收测定值为横坐标，淀粉溶液浓度为纵坐标绘制标准曲线。在本发明的技术方案中树皮和木质部样品中的可溶性糖提取液和淀粉提取液是这样获得的
a)用直径0.5cm小型打孔器，直接用手将打孔器戳进树皮内，从树皮中取出相应树皮，作为树皮样品；再在树皮取样口用小型电钻在木质部打孔部位钻孔取出木屑，作为木质部样品，钻孔深度为3. 0cm，取样后用大小合适的铁钉堵住树皮和木质部取样口 ；
b)分别对树皮和木质部样品液氮研磨，磨碎后烘箱40°C过夜烘干，取10-200mg，在
0.5ml-4ml的80%乙醇80°C浸提40min，中间斡旋搅拌，12000rpmX IOmin离心，收集上清，残渣加80%乙醇重提一次，合并上清，上清中加入活性炭10mg，80°C脱色30min，离心后取清液定容至10ml，分别获得树皮和木质部的可溶性糖提取液；
c)将提取可溶性糖后的树皮和木质部沉淀残渣分别用2ml80%Ca(NO3)2溶液沸水浴5min浸提，4000rpm离心5min，收集上清，残渣用2ml80%Ca (NO3) 2冲洗一次，离心收集上清，合并提取液，分别获得树皮和木质部淀粉提取液。在本发明的技术方案中
可溶性糖标准曲线的曲线方程为Y=427. 00Χ，R2=O. 9942 ；
样品中可溶性糖含量的计算公式为
样品中可溶性糖含量=427. 00ΧΑΧ定容体积/样品质量；
式中Α为测得的光吸收，427. 00ΧΑ计算为与光吸收对应的糖浓度；可溶性糖含量的单位为Mg/mg,糖浓度的单位为Pg/ml,定容体积的单位为ml,样品质量的单位为mg ；
淀粉标准曲线的曲线方程为y=177. 84x, r2=0. 993 ；
样品中淀粉的计算公式为
样品中淀粉含量(Kg/mg) =177. 84XAX定容体积/样品质量；式中A为测得的光吸收，177. 84XA计算为与光吸收对应的淀粉浓度；淀粉含量的单位为Mg/mg,淀粉浓度的单位为Kg/ml,定容体积的单位为ml,样品质量的单位为mg。本发明的优点在于本发明只需要取少量树皮和木质部(最低取样量为IOmg)就能进行可溶性糖和淀粉含量测定，对橡胶树的树皮和木质部伤害较小，而橡胶树的树皮是橡胶树稳产高产的保证，节约橡胶树的树皮消耗量可以延长割胶时间，提高橡胶树经济价值；木质部中淀粉可以看做是一种长效储存源，而树皮中淀粉只是作为即时的缓冲，木质部中的可溶性糖作为一个转运库，树皮中的可溶性糖可以被看做一种中间的、随时准备被使用的储藏，通过本发明能够快速获得树皮和木质部中蔗糖和淀粉的含量，为每年开割初期准确确定橡胶树开割时间、制定不同无性系橡胶树在植胶区不同物候下的含量标准、评价橡胶树割胶潜力提供技术支持，它与淀粉酶解法相比，不仅步骤简单，耗时短，而且对橡胶树伤害小，实际应用时具有明显的技术优势。


图I是可溶性糖在626nm处测定光吸收的标准曲线。图2是淀粉在580nm处测定光吸的标准曲线。图3是无性系PR107的树皮和木质部不同高度处测定的可溶性糖及淀粉在树干结果，其中a为树皮中可溶性糖含量曲线，b为树皮中淀粉含量曲线；c为木质部中可溶性糖含量曲线，d为木质部中淀粉含量曲线。
具体实施例方式实施例I
建立可溶性糖的标准曲线
用80%乙醇溶液分别配制浓度为lmg/ml的葡萄糖(还原性糖)和蔗糖(非还原性糖)溶液；将它们分别按照1: 4、3: 7、I: I、7:3和4:1体积比混合形成ΙΟΟμΙ的可溶性糖混合液，用150mg蒽酮溶于IOOml稀硫酸(70ml浓硫酸加30ml水)配制成蒽酮试剂。鹿糖与葡萄糖溶液按比例混合(混合比例如下表)，混合液ΙΟΟμΙ加入3ml蒽酮试剂，90°C保温15min，扫描光吸收最大值
表I可溶性糖光吸收峰测定
权利要求
1.一种橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量測定方法，其特征在于分别建立可溶性糖626nm处光吸收量的标准曲线和淀粉580nm处光吸收量的标准曲线；从橡胶树树皮和木质部中取样后，分别提取树皮和木质部样品中可溶性糖提取液和淀粉提取液；定容ΙΟΟμΙ可溶性糖提取液加入3ml蒽酮试剂，90°C保温15min，冷却至室温后在626nm处測定光吸收量，对照可溶性糖的标准曲线，分别计算树皮和木质部样品的可溶性糖含量；取2ml淀粉提取液加入100μ1Ι2_ΚΙ溶液，在580nm处测定光吸收量，对照淀粉的标准曲线，分别计算树皮和木质部样品的淀粉含量。
2.根据权利要求I所述的橡胶树非结构性碳水化合物含量測定方法，其特征在于 可溶性糖标准曲线是这样建立的 首先确定用硫酸-蒽酮法測定可溶性糖含量的最高光吸收峰用80%こ醇溶液分别配制浓度为lmg/ml的葡萄糖溶液和蔗糖溶液，将它们分别按照1:4、3:7、1:1、7:3和4:1体积比混合形成ΙΟΟμΙ的可溶性糖混合液，在可溶性糖混合液加入3ml硫酸-蒽酮试剂，90°C保温15min,冷却至室温后在300nm-900nm范围内扫描光吸收,确定可溶性糖混合液扫描最高吸收峰为626nm处； 再利用硫酸-蒽酮法測定不同浓度梯度可溶性糖在626nm光吸收下的标准曲线，选取的可溶性糖浓度分别为0Pg/ml、200Pg/ml、300Pg/ml、400Pg/ml、600Pg/ml、800Pg/ml、lOOOPg/ml，取ΙΟΟμΙ加入3ml硫酸-蒽酮试剂，90°C保温15min，冷却至室温后626nm处测定光吸收；以光吸收测定值为横坐标，可溶性糖浓度为纵坐标绘制标准曲线； 硫酸-蒽酮试剂是用150mg蒽酮溶于IOOml稀硫酸配制成的,其中，IOOml稀硫酸采用70ml浓硫酸与30ml水混合； 淀粉的标准曲线是这样建立的 首先配制以下溶液80%Ca (NO3) 2溶液的配制80gCa (NO3) 2· 2Η20溶于水中，定容至100ml ；I2-KI溶液的配制1. 3gl2加上3. 5gKI，溶解后容量瓶定容至IOOml ;用lmg/ml淀粉母液按比例用 80%Ca(NO3)2 溶液分别稀释成 5(^g/ml、100μδ/πι1、200μδ/πι1、300μδ/πι1、400μδ/πι1淀粉溶液； 取不同浓度淀粉母液2ml，加入ΙΟΟμΙI2-KI溶液，在580nm处测定光吸收，以光吸收测定值为横坐标，淀粉溶液浓度为纵坐标绘制标准曲线。
3.根据权利要求I所述的ー种橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量测定方法，其特征在于 树皮和木质部样品中的可溶性糖提取液和淀粉提取液是这样获得的 a)用直径0.5cm小型打孔器，直接用手将打孔器戳进树皮内，从树皮中取出相应树皮，作为树皮样品；再在树皮取样ロ用小型电钻在木质部打孔部位钻孔取出木屑，作为木质部样品，钻孔深度为3. 0cm，取样后用大小合适的铁钉堵住树皮和木质部取样ロ ； b)分别对树皮和木质部样品液氮研磨，磨碎后烘箱40°C过夜烘干，取10-200mg，在0.5ml-4ml的80%こ醇80°C浸提40min，中间斡旋搅拌，12000rpmX IOmin离心，收集上清，残渣加80%こ醇重提一次，合井上清，上清中加入活性炭10mg，80°C脱色30min，离心后取清液定容至10ml，分别获得树皮和木质部的可溶性糖提取液； c)将提取可溶性糖后的树皮和木质部沉淀残渣分别用2ml80%Ca(N03)2溶液沸水浴5min浸提，4000rpm离心5min，收集上清，残渣用2ml80%Ca (NO3) 2冲洗一次，离心收集上清，合并提取液，分别获得树皮和木质部淀粉提取液。
4.根据权利要求3之一所述的橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量测定方法，其特征在干 可溶性糖标准曲线的曲线方程为Y=427. OOX，R2=O. 9942 ； 样品中可溶性糖含量的计算公式为 样品中可溶性糖含量=427. OOXAX定容体积/样品质量； 式中Α为测得的光吸收，427. OOXA计算为与光吸收对应的糖浓度；可溶性糖含量的单位为Mg/mg,糖浓度的单位为Pg/ml,定容体积的单位为ml,样品质量的单位为mg ；淀粉标准曲线的曲线方程为·y=177. 84x, r2=0. 993 ； 样品中淀粉的计算公式为 样品中淀粉含量(Kg/mg) =177. 84XAX定容体积/样品质量； 式中A为测得的光吸收，177. 84XA计算为与光吸收对应的淀粉浓度；淀粉含量的单位为Mg/mg,淀粉浓度的单位为Kg/ml,定容体积的单位为ml,样品质量的单位为mg。
全文摘要
本发明涉及一种橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量测定方法，其特征在于分别建立可溶性糖626nm处光吸收量的标准曲线和淀粉580nm处光吸收量的标准曲线；从橡胶树树皮和木质部中取样后，分别提取树皮和木质部样品中可溶性糖提取液和淀粉提取液；取100μl可溶性糖提取液加入3ml蒽酮试剂，90℃保温15min，冷却至室温后在626nm处测定光吸收量，对照可溶性糖的标准曲线，分别计算树皮和木质部样品的可溶性糖含量；取2ml淀粉提取液加入100μlI2-KI溶液，在580nm处测定光吸收量，对照淀粉的标准曲线，分别计算树皮和木质部样品的淀粉含量。
文档编号G01N21/31GK102854162SQ20121036825
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者魏芳, 校现周, 罗世巧, 吴明, 仇键, 杨文凤, 郑乾坤 申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所