专利名称：一种检测活性细菌含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测活性细菌含量的方法，特别涉及一种通过联合使用CTC染料染色和流式细胞仪来检测活性细菌含量的方法。
背景技术：
细菌总数是指ImL水样中的好氧菌、兼性厌氧菌和异养菌在营养琼脂培养基中，于37°C培养24h后，所生长细菌菌落的总数(《水和废水监测分析方法》(第三版))。细菌总数作为我国《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)规定的水质常规指标之一，在评价水质方面具有很大的参考价值。
营养琼脂平板培养法具有一定的局限性，自然环境中只有一小部分的细菌可以在平板上被计数，有研究表面，海水中可被培养法检测到的细菌只占细菌总数的O. 8%。此外，很多厌氧菌和兼性菌无法利用平板培养法检测。不同细菌对温度、培养时间、培养基等培养条件十分敏感，营养琼脂平板培养法难以对各种菌同时进行有效的检测。并且，营养琼脂平板培养法通常需要的检测时间较长(需24h)。同时，大量研究表明，很多细菌在外界环境压力(如高温)下，可进入“具有活性但无法培养” (Viablebut not culturable, VBNC)的状态，致使某些病原菌无法在平板培养基上形成菌落，但仍然保持一定代谢能力和致病性，VBNC状态病原菌能够在适宜条件下恢复其感染性。此外，在平板中的细菌不会全部以相同的速度生成菌落，形成的菌落大小也不同，如果生成了一些微小的菌落，在计数过程中可能被漏掉。因此，平板培养法不能够准确反映水中活性细菌总量。CTC染料(一种氧化还原性染料，英文名称为5-cyano_2, 3-ditolyltetrazoliumchloride,中文名称为5-氰基-2，3- 二甲苯基氯化四氮唑,结构式见式(I )。Cl式 U)。
ΧχCTC染料是一种无色的可渗透细胞膜的物质，可以被细菌细胞通过电子传递链还原，在细胞内形成红色荧光沉淀物质CTF (CTC-Formazan,在450/630nm下被激发)，生成CTF的含量与CTC浓度、孵育时间有关。可以还原CTC并产生荧光的细胞即具有呼吸活性的细胞(CTC+)。同时，CTC染料相比与其它氧化还原染料还具有一个独特的优势，即其可以与好氧菌、厌氧菌以及兼性细菌反应。

发明内容
本发明的目的是提供一种检测活性细菌含量的方法，特别涉及一种通过联合使用CTC染料染色和流式细胞仪来检测活性细菌含量的方法(简称CTC-流式细胞仪法或CTC-FCM 法)。本发明提供的第一种检测活性细菌含量的方法，是将CTC染料与待测液体样本共孵育，然后通过流式细胞仪检测所述待测液体样本中的活性细菌含量。所述“通过流式细胞仪检测所述待测液体样本(如水样)中的活性细菌含量”的实现方法如下采用流式细胞仪，在450/630nm的激发光下计数可发出红色荧光的物质，每个可发出红色荧光的物质代表一个活性细菌。所述方法中，所述共孵育的初始体系具体可由CTC水溶液、待测液体样本(或待测液体样本的稀释液)和NaCl水溶液组成。所述方法中，所述共孵育的初始体系具体可由20 μ L CTC水溶液、10 μ L待测液体样本(或待测液体样本的稀释液)和70 μ L0. 85g/100mLNaCl水溶液组成。所述方法中，所述共孵育的初始体系中，所述CTC染料的浓度具体可为 2mmol/L。所述共孵育的时间具体可为3小时。所述细菌具体可为大肠杆菌。上述方法中，流式细胞仪参数设置可为FL1:4. 11;FL2:6. 29;FL3:5. 47 ;每次测量的体积为可50 μ L。本发明提供的另一种检测活性细菌含量的方法，是将CTC染料与待测固体样本在液相体系中共孵育，然后通过流式细胞仪检测所述待测固体样本中的活性细菌含量。所述“通过流式细胞仪检测所述待测固体样本中的活性细菌含量”的实现方法如下采用流式细胞仪，在450/630nm的激发光下计数可发出红色荧光的物质，每个可发出红色荧光的物质代表一个活性细菌。所述方法中，所述共孵育的初始体系具体可由CTC水溶液、待测固体样本的悬浮液和NaCl水溶液组成。所述方法中，所述共孵育的初始体系具体可由20 μ L CTC水溶液、10 μ L待测固体样本的悬浮液和70 μ L O. 85g/100mL NaCl水溶液组成。所述方法中，所述共孵育的初始体系中，所述CTC染料的浓度具体可为2mmol/L。所述共孵育的时间具体可为3小时。所述细菌具体可为大肠杆菌。上述方法中，流式细胞仪参数设置可为FL1:4. 11;FL2:6. 29;FL3:5. 47 ;每次测量的体积为可50 μ L。根据不同的研究目的，CTC染料可以与其它技术相结合，如将CTC染料染色与扫描隧道电子显微镜结合，将CTC染料染色与共聚焦激光电子显微镜结合等。如果采用CTC染料染色与共聚焦激光电子显微镜结合来检测活细胞，会存在如下局限性由于细胞自身的代谢特点，使得一些细胞只能在细胞内积累少量的CTF，达不到荧光显微镜检测的最小量，而使得检测结果低于样品中实际活性细菌数；CTC染料染色方法的不同(主要包括CTC染料的终浓度与样品混合后的孵育时间)，对实验结果也会有较大的影响。本发明提供的方法的检测原理如下以细胞的呼吸代谢活性作为活性细菌的评判标准；CTC染料可渗透细菌细胞膜，与具有呼吸代谢活性的细菌内的电子传递链反应，在细胞内形成红色荧光沉淀，进而可通过流式细胞仪检测；流式细胞仪可记录样品中单个颗粒的侧向散射光(side light scatter, SS)、绿突光(green fluorescence, FLl, 53015nm)、澄突光(orange fluorescence, FL2, 58521nm)和红突光(redfluorescence, FL3, >650nm);本发明中，采用FL3为检测器时，活性细菌和CTC染料反应产生的红色荧光物质被激发，从而实现细菌计数。本发明提供的方法的检测原理和流程如图I所示。本发明中采用灵敏的检测仪器(流式细胞仪)检测微弱标记的细胞以及确定最佳实验条件，可以大大提高所测定的活性细菌的准确度，以达到准确、快速检测活性病原菌的目的。本发明所采用的方法快速、简便，具有广谱识别性，能够准确、快速检测到活性病原菌，可以用于环境样品中活性病原菌的检测。


图I为CTC-流式细胞仪法检测活性菌流程图。图2为不同CTC染料浓度及孵育时间下的结果。图3为大肠杆菌的平板培养法与CTC-流式细胞仪法计数结果比较。 图4为实际水样的平板培养法与CTC-流式细胞仪法分析结果比较。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液均为pH 7.2,0. IM的PBS缓冲液。实施例中所用的大肠杆菌，又称大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli):中国普通微生物菌种保存管理中心(网址为 http://www. cgmcc. net/),CGMCC 编号为 1.2385。CTC 染料购自 Molecular Probes,货号为 B34956。实施例I、CTC-FCM方法的最佳浓度及孵育时间的优化I、将大肠杆菌菌液接种于营养肉汤培养基，37°C、160rpm振荡培养16h。2、取100 μ L步骤I得到的菌液，用PBS缓冲液稀释至lmL，然后4°C、12000rpm离心5min，收集菌体沉淀并重悬于IOOmL PBS缓冲液，得到活菌浓度为105CFU/mL的菌悬液。3、用无菌水将CTC染料配置成浓度为lOmmol/L的CTC储备溶液。4、分别配制如下反应体系反应体系甲由10 μ L步骤3制备的CTC储备溶液、IOyL步骤2制备的菌悬液和80 μ L 0. 85g/100mL NaCl 水溶液组成；反应体系乙由20 μ L步骤3制备的CTC储备溶液、IOyL步骤2制备的菌悬液和70 μ L 0. 85g/100mL NaCl 水溶液组成；反应体系丙由50 μ L步骤3制备的CTC储备溶液、IOyL步骤2制备的菌悬液和40 μ L 0. 85g/100mL NaCl 水溶液组成；将上述各个反应体系37°C避光(即黑暗条件)孵育，分别于孵育0. Ih,0. 5h、lh、2h、3h、4h、6h、10h和24h后取样，利用流式细胞仪计数可发出红色荧光的物质，每个可发出红色荧光的物质代表一个活性细菌。计算细菌浓度时，先将可发出红色荧光的物质的数量除以用于流式细胞仪计数的溶液的体积(0. 05mL)，然后再乘以10 (因为步骤2的菌悬液与反应体系的体积比为1:10)，得到步骤2得到的菌悬液中的活性细菌浓度，单位为“个/mL”。进行三次重复实验，结果取平均值。结果见表I和图2。图2中，横坐标为孵育时间，纵坐标为菌悬液中的活性细菌浓度。表I各个反应体系孵育各个时间后检测出来的菌悬液中的活性细菌浓度(个/mL)
孵育时间反应体系甲反应体系乙反应体系丙O. Ih168003420033800
0.5h22000109200 34800
Th68200233400 130000
2h379000
3h412400
4h140000 322000 149000
6h232000
Toh628008760063800
24h3100068003000注表示无相关数据结果表明当孵育时间相同时，反应体系甲(CTC染料的初始浓度为lmmol/L)和反应体系丙(CTC染料的初始浓度为5mmol/L)中可以由流式细胞仪检测出的活性细胞数量远小于反应体系乙(CTC染料的初始浓度为2mmol/L)。分析原因如下当CTC染料浓度过小时，不能与全部的具有活性的细菌细胞结合；当CTC染料浓度过高时，对细菌细胞产生一定的毒性。由此，本发明确定的CTC染料的最佳使用浓度为2mmol/L。结果表明当CTC染料浓度相同时，随着孵育时间的增加，可由流式细胞仪检测出的细胞数量先增加后减少，当孵育时间为3h时检测结果达到最大值。分析原因如下CTC染料刚刚与细菌细胞进行孵育时，需要一定的适应期适应环境的改变，之后进行呼吸代谢；当CTC染料与细胞反应时间过长时，细胞代谢活性下降，且长时间的反应使CTC染料对细胞产生毒害作用。由此，本发明确定的CTC染料对活性细菌染色的最佳的孵育时间为3h。实施例2、采用CTC-FCM方法检测活性细菌含量的检测效果一、CTC-FCM 方法I、将大肠杆菌菌液接种于营养肉汤培养基，37°C、160rpm振荡培养16h。2、取100 μ L步骤I得到的菌液，用PBS缓冲液稀释至lmL，然后4°C、12000rpm离心5min，收集菌体沉淀并重悬于IOOmL PBS缓冲液，得到活菌浓度为105CFU/mL的菌悬液(菌悬液甲)。3、用无菌水将CTC染料配置成浓度为lOmmol/L的CTC储备溶液。4、将菌悬液甲在70°C、300rpm振荡灭活IOmin (本步骤的目的是热灭活细菌)，得到的菌悬液命名为菌悬液乙。5、分别配制如下样本液样本液I :菌悬液乙；样本液II : 2体积份菌悬液甲+8体积份菌悬液乙；样本液III 4体积份菌悬液甲+6体积份菌悬液乙； 样本液IV 6体积份菌悬液甲+4体积份菌悬液乙；样本液V 8体积份菌悬液甲+2体积份菌悬液乙；样本也VI:菌悬液甲。6、分别配制各个样本液的反应体系由20 μ L步骤3制备的CTC储备溶液、10 μ L步骤5制备的样本液和70 μ L O. 85g/100mL NaCl水溶液组成。将反应体系37°C避光(即黑暗条件)孵育3h后取样，利用流式细胞仪计数可发出红色荧光的物质，每个可发出红色荧光的物质代表一个活性细菌。计算细菌浓度时，先将可发出红色荧光的物质的数量除以用于流式细胞仪计数的溶液的体积(O. 050mL)，然后再乘以10(因为步骤2的菌悬液与反应体系的体积比为1:10)，得到步骤5得到的样本液中的活性细菌浓度，单位为“个/mL”。二、对照方法(平板培养计数法)同时，将步骤一的5得到的各个样本液分别涂布于营养肉汤培养基平板上，37°C避光培养48小时，通过计数CFU计算样本液中的活性细菌浓度。进行三次重复实验，结果取平均值。结果见表2和图3。图3中，横坐标表示培养法计数所得结果的对数值，纵坐标表示CTC-FCM检测方法所得结果的对数值。表2通过流式细胞仪检测得到的各个样本液中的活性细菌浓度(Iog10活性细菌浓度)
权利要求
1.一种检测活性细菌含量的方法，是将CTC染料与待测液体样本共孵育，然后通过流式细胞仪检测所述待测液体样本中的活性细菌含量。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述“通过流式细胞仪检测所述待测液体样本中的活性细菌含量”的实现方法如下采用流式细胞仪，在450/630nm的激发光下计数可发出红色荧光的物质，每个可发出红色荧光的物质代表一个活性细菌。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述共孵育的时间为3小时。
4.如权利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于所述CTC染料的初始工作浓度为 2mmol/L。
5.如权利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于所述细菌为大肠杆菌。
6.一种检测活性细菌含量的方法，是将CTC染料与待测固体样本的在液相体系中共孵育，然后通过流式细胞仪检测所述待测液体固体样本中的活性细菌含量。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述“通过流式细胞仪检测所述待测固体样本中的活性细菌含量”的实现方法如下采用流式细胞仪，在450/630nm的激发光下计数可发出红色荧光的物质，每个可发出红色荧光的物质代表一个活性细菌。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述共孵育的时间为3小时。
9.如权利要求6至8中任一所述的方法，其特征在于所述CTC染料的初始工作浓度为 2mmol/L。
10.如权利要求6至9中任一所述的方法，其特征在于所述细菌为大肠杆菌。
全文摘要
本发明公开了一种检测活性细菌含量的方法，特别涉及一种通过联合使用CTC染料染色和流式细胞仪来检测活性细菌含量的方法(简称CTC-流式细胞仪法或CTC-FCM法)。本发明提供的第一种检测活性细菌含量的方法，是将CTC染料与待测液体样本共孵育，然后通过流式细胞仪检测所述待测液体样本中的活性细菌含量。本发明中采用灵敏的检测仪器(流式细胞仪)检测微弱标记的细胞以及确定最佳实验条件，可以大大提高所测定的活性细菌的准确度，以达到准确、快速检测活性病原菌的目的。本发明所采用的方法快速、简便，具有广谱识别性，能够准确、快速检测到活性病原菌，可以用于环境样品中活性病原菌的检测。
文档编号G01N15/14GK102967545SQ20121043884
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者何苗, 李丹, 林怡雯, 杨天 申请人:清华大学