专利名称：：在有症状的患者中鉴别急性和慢性心肌坏死的工具和方法在有症状的患者中鉴别急性和慢性心肌坏死的工具和方法本发明涉及诊断急性心血管事件的方法，所述方法包括测定患者样品中的心肌钙蛋白(cardiacTroponin)的量、测定所述患者样品中的利钠肽(natriureticpeptide)的量的步骤和通过将之前步骤中测定的量与参比量(referenceamounts)比较而诊断急性心血管事件。此外，本发明包括鉴别急性心血管事件和慢性心力衰竭的方法，所述方法包括测定患者样品中的心肌钙蛋白的量、测定所述患者样品中的利钠肽的量的步骤和通过将之前步骤测定的量与参比量比较鉴别急性心血管事件和慢性心力衰竭。本发明还包括实施这样的方法的装置和试剂盒现代医学的目标是提供人性化或个性化的治疗方案。那些是考虑患者个性需求或风险的治疗方案。一个特别重要的风险是存在心血管并发症，尤其是未被认知的心血管并发症，或这样的心血管并发症的流行。心血管并发症，尤其是心脏疾病，是西半球发病率和死亡率主要原因。心血管并发症可长时间保持无症状状态。因此，对于心血管并发症的存在的可靠的鉴别诊断比一般认为的更加困难和容易出错(error-prone)。明确地-〖兌，罹患急性心血管事件(如，心月几梗塞)的症状诸如胸痛的患者普遍经历以肌钙蛋白T为基础的诊断。为此，测定患者的肌钙蛋白T水平。如果血液中肌4丐蛋白T的量上升，即高于0.1ng/ml，假定为急性心血管事件并据此对该患者进行治疗。然而，通过使用现行的肌4丐蛋白T检查，相当部分的患者被假阳性地诊断为患有急性心血管事件。应该理解，随后的疗法功效很小或者甚至无效，由此导致更因此，对于想要实施准确鉴别诊断急性心血管事件的工具(means)和方法，存在明确的长期需求。所述工具和方法将容许鉴别诊断可靠和有效，并且将避免现行技术的缺陷。这样，必须4巴存在于本发明的技术难题看作应答前述需求的工具和方法的准备。决。因此，本发明涉及诊断急性心血管事件的方法，所述方法包括的步骤有a)测定患者样品中的心肌钙蛋白的量；b)测定所述患者样品中的利钠肽的量，以及c)通过将步骤a)和b)中测定的量与参比量比较，诊断急性心血管事件。本发明的方法优选是体外方法。此外，其可包括除了在那些之上明确提及的步骤之外的步骤。例如，更多的步骤可涉及样品前处理或诊断数据的评估。如本文所用的术语"诊断，，指依据罹患急性心血管事件或本说明书中提到的任何其它疾病的患者，对其可能性进行评价。如应为本领域技术人员所理解的，这样的评价通常不意欲对要诊断的患者达100%准确。然而，该术语要求具统计学显著意义的部分可被诊断的患者(如，队列研究(cohortstudy)中的组群)雍患心力衰竭或在将来具有罹患该病的风险。一部分是否是具有统计学显著意义，可由本领域专业技术人员使用多种众所周知统计学评价工具，如，可信区间测定、p-值测定、Student'st-检验、Mann-Whitney检验等不多费周折地确定。详细资料可在Dowdy和Wearden,研究用统计学(StatisticsforResearch),JohnWiley&Sons,NewYork1983中找到。优选的可信区间为至少90%,至少95%，至少97%，至少98%或至少99%。p-值，优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。依据本发明的诊断包括对相关疾病、症状或其风险的监测、确诊、细分类和预测。监测是指对已经诊断的疾病或并发症的持续追踪，如分析疾病进程或具体治疗对疾病或并发症进程的影响。确诊是指使用其它指标或标志对已经作出的诊断进行强化或进一步证实。细分类是指依据所诊断的疾病的不同的亚类的明确诊断，如，依据疾病的轻度或重度类型明确诊断。预测是指在其它症状或标志已经成为证据或已经产生明显变化之前，预测疾病或并发症。术语"急性心血管事件，，指所有突然出现，即没有前期临床体征或症状的以及严重侵袭舒张期或收缩期血流速率的事件。从组织病理学上看，急性心血管事件在本文指的将是伴随心肌细胞突然缺血，其伴随着所述细胞严重坏死。优选地，罹患急性心血管事件的患者还将罹患以下典型症状，诸如胸、上腹部、臂、手腕或颚不适或由此的疼痛，尤其是，胸痛可放射至臂、背或肩。急性心血管事件的另外的症状可为莫名其妙的恶心或呕吐、持续的呼吸短促、虚弱、眩暈、头昏眼花或晕厥以及其任何组合。优选地，本文中的急性心血管事件指的是急性冠脉综合征(ACS)，即或者为不稳定性心绞痛(UAP)或者是心肌梗塞(MI)。最优选地，急性心血管事件是MI，包^tl:升高的MI和非-ST-升高的MI。此外，心血管事件还包括中风。有关定义、症状和临床体征，诸如心电图体征的更多的细节在欧盟心脏病学会/美国心脏病学会(JointEuropeanSocietyofCardiology/AmericanSocietyofCardiology),2000，美国心脏病学会杂志(JAmericanCollegeofCardiology),Vol.36,No.3:959-969中找到。可依据纽约心脏协会分类系统(NewYorkHeartAssociationclassificationsystem),3夺各症状分类。I级患者没有明显心血管疾病症状。体育锻炼(Physicalactivity)不受限，并且一般的体育锻炼不引起不适当的乏力、心悸或呼吸困难(呼吸短促)。II级患者体育锻炼轻微受限。他们在休息时感到舒适，但一般的体育锻炼导致乏力、心悸或呼吸困难。III级患者显示体育锻炼显著受限。他们在休息时感到舒适，但低于一般程度的活动引起乏力、心悸或呼吸困难。IV级患者在没有不适时也不能进行任何体育锻炼。他们在休息时显示心机能不全的症状。如果进行任何体育锻炼，加重不适。因此，可将患者分为不表现临床症状的和有症状(如，呼吸困难)的患者。本文所用的术语"患者"指动物，优选哺乳动物，更优选人。然而，本发明设想，患者将优选表现已知与急性心血管事件相关的症状，即胸痛、呼吸困难和如上描述的其它症状。更优选地，患者将表现至少依据NYHA的II级的各种症状，最优选表现依据III或IV级的症状。依据本发明测定利钠肽或心肌钙蛋白的量，是指优选为半定量或定量检测量或浓度。检测可直接或间接进行。直接检测指基于从利钠肽或心肌4丐蛋白自身获得的信号以及与存在于样品中的肽的分子数量直接相关的信号强度，检测利钠肽或心肌钓蛋白的量或浓度。这样的信号-在本文有时指强烈信号-可例如通过^r测利钠肽或心力几钩蛋白的特异性物理或化学性质的强度值来获得。间接检测包括检测由次要成分(即不是利钠肽自身的成分)或生物读取系统(biologicalreadoutsystem),如，可检测的细胞反应、配体、标记物或酶反应产物中所获得的信号。依据本发明，可通过所有已知用于测定样品中肽的量的工具，实现测定利钠肽或心肌钙蛋白的量。所述工具包括可用来以多种夹心的(sandwich)、竟争性的或其它测定的方式标记分子的免疫分析装置和方法。所述测定将产生一种指示存在或缺乏利钠肽或心肌4丐蛋白存在与否的信号。此外，优选地，该信号强度可直接或间接地(如，呈反比)与存在于样品中的多肽的量相关连。更多适宜的方法包括检测对利钠肽具有特异性的物理或化学性质，诸如其精细的分子质谱或NMR光语。所述方法优选包括，生物传感器、与免疫分析偶联的光学仪器、生物芯片、分析装置，诸如质谱仪、NMR-分析仪或色谱仪。另外，方法包括基于微板ELISA-的方法、全自动化或遥控免疫分析(例如，在ElecsysTM分析仪上可得到)、CBA(—种酶法钴结合分析(Gobalt在Roche-Hitachi分析仪上可得到)和胶乳凝集分析法(例如在Roche-Hitachi，分析仪上可得到)。在优选的实施方案中，用于测定利钠肽或心肌钓蛋白的量的方法包括以下步骤(a)将可引起细胞反应的表示肽量的强度的细胞与肽接触一段适当的时间，(b)检测细胞反应。为了检测细胞反应，优选将样品或已加工的样品加至细胞培养基中，检测内在或外在细胞反应。所述细胞反应可包括可检测的报告基因的表达或如肽、多肽或小分子物质的分泌。所述表达或物质将产生与肽的量相关的强烈信号。在另一个优选的实施方案中，用于测定利钠肽或心肌钩蛋白的量的方法包括以下步骤检测由样品中利钠肽或心肌钩蛋白中可获得的特异性强烈信号。如上所述，这样的信号可为在对于利钠肽或心肌钩蛋白特异性的质i普或NMR光语中观察到的、对于利钠肽或心肌4丐蛋白特异性的m/z变量上观察到的信号强度。在另一个优选的实施方案中，测定利钠肽的量的方法包括以下步骤(a)将肽与特异性配体接触，(b)(任选)去除未结合的配体，(c)检测结合的配体的量。结合的配体将产生强烈信号。依据本发明的结合包括共价结合和非共价结合两者。依据本发明的配体可为结合本文描述的利钠肽或心肌钩蛋白的任何化合物，如，肽、多肽、核酸或小分子。优选的配体包括抗体、核酸、肽或多肽，诸如利钠肽的受体或心肌钩蛋白及其片段的结合配偶体(bindingpartners),所述结合配偶体由肽的结合域、适配子(aptamers)，如，核酸或肽适配子组成。制备这样的配体的方法为本领域所熟悉。例如，适宜的抗体或适配子的鉴定和生产也由供应商提供。本领域技术人员熟悉生产具有较高亲和力和特异性的衍生物的方法。例如，可将随机突变引入核酸、肽或多肽。然后，依据本领域已知的筛选程序，如，噬菌体展示载体，可检验这些衍生物的结合性。本文涉及到的抗体包括多克隆和单克隆抗体及其片8原或半抗原的Fv、Fab和F(ab)2片段。本发明还包括人源化杂交抗体，其中表现所需要的抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人接受体抗体结合。供体序列将通常至少包括供体的结合抗原的氨基酸残基，但也可包括供体抗体的其它结构性和/或功能性相关的氨基酸残基。可通过本领域众所周知许多方法制备这样的杂合子(hybrids)。优选地，配体或试剂特异性地结合至利钠肽。依据本发明的特异性结合意指配体或试剂不应该与存在于被分析的样品中的另一个肽、多肽或物质充分结合(与之"交互反应(cross-react)，，)。优选地，特异性结合的利钠肽应该以高于任何其它相关的肽或多肽的至少3倍，更优选至少IO倍且尤其更优选至少50倍的亲和力结合。如果例如，依据其在WesternBlot(蛋白质印迹)上的大小，或通过其在样品中相当高的丰度仍然能明确地区别和检测，非-特异性结合是可容许的。可通过任何本领域已知的方法，4企测配体的结合。优选地，所述方法是半定量的或定量的。适宜的方法在以下描述。首先，可例如通过NMR或表面等离子共振(Plasmonsurfaceresonance)直4妄才全测配体的结合。第二，如果配体也作为有兴趣的肽或多肽的酶活性的底物，则可检测酶反应产物(如，通过检测裂解的底物的量，如，在WesternBlot上，可检测蛋白酶的量)。或者，配体可自身表现酶特性，并且配体/利钠肽或配体/心肌钙蛋白复合物或由利钠肽或心肌4丐蛋白分别结合的配体，可与适宜的允许通过产生强烈信号来检测的底物接触。为了检测酶反应产物，底物的量优选饱和。也可在反应之前用可检测的标记对底物进行标记。优选将样品与底物接触一段足够的时间。一段足够的时间指的是可用于检测所必须的时间，优选产生可检测的量的产物的时间。可^^测必须用于显现给定(如，可^r测的)产物量的时间，替代^r测产物的量。第三，可将配体与允许检测和测定的标记物共价或非共价耦合，并才企测配体。可用直接或间接的方法进行标记。直接标记包括将标记物直接(共价或非共价)耦连至配体。间接标记包括将第二配体与第一配体结合(共价或非共价)。第二配体应该特异性与第一配体结合。所述第二配体可与适宜的标记物耦合和/或成为结合至第二配体的第三配体的标耙(受体)。应用第二、第三甚或更高序位的配体常常是用于增强信号。适宜的第二和更高序位的配体可包括抗体、第二抗体和众所周知链霉亲和素-生物素系统(VectorLaboratories,Inc.)。也可用一个或更多个如本领域已知的标签使配体或底物成为"标靶"。然而，这样的标签可成为更高序位配体的标靶。适宜的标签包括生物素、地高辛(digoxygenin)、His-Tag、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc-tag、A型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，标签优选在N-末端和/或C-末端。适宜的标记物是任何可用适当的检测方法4企测的标记物。典型的标记物包括金颗粒、乳力交珠、二氢吖喷:酉旨(acridanester)、鲁米诺(发光氨,luminol)、钌、具酶活性的标记物、放射性标记物、磁性标记物("如，磁珠"，包括顺磁性的和超磁性的标记物)和荧光标记物。具酶活性的标记物包括如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、p-半乳糖苦酶、荧光素酶及其衍生物。适宜的用于检测的底物包括二-氨基-联苯胺(DAB)、3,3'-5,5'-四曱基联苯胺、NBT-BCIP(氯化4-硝基四唑蓝和5-溴代-4-氯代-3-吲咮基-磷酸盐，由RocheDiagnostics可得到为已制备好的储备液)、CDP-StarTM(AmershamBiosciences)、ECFTM(AmershamBiosciences)。适宜的酶-底物复合物可导致有色的反应产物、荧光或化学发光，这些可依据本领域已知的方法(如，使用感光胶片或适宜的照相机系统)检测。为了检测酶反应，类似地应用以上给出的标准物。典型的荧光标记物包括荧光蛋白质(诸如GFP及其书亍生物)、Cy3、Cy5、TexasRed、Fluorescein和Alexa染料(如，Alexa568)。更多的荧光标记物可例如,人MolcularProbes(Oregon)得到。也预期使用量子点(quantumdots)作为荧光标记物。典型的放射性标记物包括"S、125I、32P、"P等。可采用任何已知的和适当的方法，如，感光胶片或磷光图像(phosphorimager),检测放射性标反应中)、电化学发光(电致化学发光)、RIA(放射免疫分析)、ELISA(酶-联免疫吸收剂分析)、夹心(sandwich)酶免疫4企验、电化学发光夹心酶免疫分析(ECLIA)、解离-增强镧系荧光免疫分析(DELFIA)、亲近闪烁检测法(SPA)、比浊法(turbidimetry)、悬浮体散射浊度测定法(nephelometry)、乳胶增强的比浊法或悬浮体散射法度测定法或固相免疫检验。本领域已知的更多的方法(诸如凝胶电泳法、2D凝胶电泳法、SDS聚丙烯胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、Western印迹和质谱)，可单独应用或与标记或以上描述的其它4企测方法联合^f吏用。在另一个优选的实施方案中，用于测定利钠肽的量的方法包括(a)将包含作为特异性的用于利钠肽或心肌钓蛋白的配体的固体载体与含有利钠肽或心肌钓蛋白的样品接触，和(b)检测结合至载体的利钠肽或心肌钩蛋白的量。优选选自核酸、肽、多肽、抗体和适配子的配体，优选以固定的形式存在于载体上。用于制备固体载体的原料为本领域众所周知，并且此外还包括商业上可用到的柱原料、聚苯乙烯珠、乳胶珠、磁珠、胶体金属微粒、玻璃和/或硅片和表面、硝化纤维素条、膜、薄片、孔和反应盘的孔、塑料管等。配体或试剂可与许多不同的载体结合。众所周知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、右旋糖苦、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和i兹铁矿。对于本发明的目的，载体的性质可为或者稳定或者不稳定。安置/固定所述配体的适宜的方法众所周知，并且包括，但不限于离子的、疏水的、共价的相互作用等。还预期使用"悬浮阵列技术(suspensionarrays)"作为依据本发明的阵列(NolanJP，SklarLA.(2002)。悬浮阵列技术平面阵列范例进展(Suspensionarraytechnology:evolutionoftheflat-arrayparadigm).TrendsBiotechnol.20(1):9-12)。在这样的悬浮阵列中，载体(如微珠或微球)以悬浮形式存在。该阵列由可能标记了的、携带不同的配体的不同的微珠或微球组成。生产这样的阵列(例如，基于固相化学和对光不稳定的保护基团)的方法，为普遍已知的(US5,744,305)。本文所用的术语"量"包括利钠肽或心肌钩蛋白的绝对量、利钠肽或心肌4丐蛋白的相对量或浓度，以及相关的任何值或参数。这样的值或参数包括通过直接检测从所述肽助所获得的来自所有特异性物理或化学性质的强烈信号值，如，以质语或NMR光语表示的强度值。此外，包括所有由本说明书中另处特定的间接检测获得的值或参数，如，由生物读取系统应答由特异性结合的配体的肽或强烈信号获得的测定的表达水平。应该理解，也可通过所有标准数学运算，获得与上述量或参数相互关联的值。术语"心肌4丐蛋白"指在心脏细胞，优选心内膜下细胞中表达的所有肌铞蛋白异构体。这些异构体为本领域充分描述，像，如在Anderson1995,循环研究(CirculationResearch),vol.76,no.4:681-686和Ferrieres1998，临床化学(ClinicalChemistry),44:487-493中描述的那样。优选地，心肌钩蛋白指肌4丐蛋白T和/或肌钓蛋白I。因此，可在本发明方法一起，即同时或顺序地，或分别测定两个肌钩蛋白，即根本不测定其它异构体。人肌钙蛋白T和人肌钙蛋白I的氨基酸序列在Anderson,loccit和Ferrieres1998，临床化学(ClinicalChemistry),44:487-493中公开。术语"心肌钩蛋白"还包括上述特异性肌钾蛋白变体，即优选肌4丐蛋白T或肌钙蛋白I的变体(variants)。这样的变体至少具有与特异性心肌钙蛋白相同的基本的生物学和免疫学性质。尤其是，如果它们是通过在本说明书中提及的相同的特异性检验方测定，如，通过采用特异性辨认所述心肌钙蛋白的多克隆或单克隆抗体ELISA分析法测定，则它们共享相同的基本的生物学和免疫学性质。此外，应该理解，如依据本发明提及的变体将具有一个不同的氨基酸序列，原因是由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或增加，其中变体的氨基酸序列仍优选至少有50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%与特异性肌钙蛋白的氨基酸序列是一致的。变体可为等位基因的变体或任何其它的特异性同源、旁系同源(paralogs)或直系同源(orthologs)的种类。此外，本文所提及的变体包括特异性心肌钙蛋白或上述类型的变体的片段，只要这些片段具有如以上提及的基本的免疫学和生物学性质即可。这样的片段可为，如肌钩蛋白的降解产物。进一步包括的是由于转译后修饰，诸如磷酸化或十四烷基化而不同的变体。术语"利钠肽"包括心房利钠肽仏trialNatriuretic￡eptide(ANP))-型肽和脑利钠肽(旦rainNatriureticpeptide(BNP))-型肽及其具有相同的预期潜能的变体。依据本发明的利钠肽包括ANP-型肽和BNP-型肽及其变体(见，如，Bonow,R.0.(1996)。对心脏利钠肽的新洞察(Newinsightsintothecardiacnatriureticpeptides).Circulation93:1946-1950)。ANP-型肽包括pre-proANP、proANP、NT-proANP和ANP。BNP-型肽包括pre-proBNP、proBNP、NT-proBNP和BNP。Pre-pro肽(在pre-proBNP的情况下有U4个氨基酸)包括一个短的信号肽，其经酶裂解释放pro肽(在proBNP的情况下有108个氨基酸)。pro肽进一步被裂解为N-末端pro肽(NT-pro肽，在NT-proBNP的情况下有76个氨基酸)和活性激素(在BNP的情况下有32个氨基酸，在ANP的情况下有28个氨基酸)。依据本发明的优选的利钠肽是NT-proANP、ANP、NT-proBNP、BNP及其变体。ANP和BNP是活性激素并且具有比其相应的无活性的配对物NT-proANP和NT-proBNP较短的半衰期。BNP在血液中代谢，然而，NT-proBNP以完整的分子在血液中循环并且经肾消除。NTproBNP的体内半衰期比BNP的长120min,BNP的半衰期为20min(SmithMW,EspinerEA,YandleTG，CharlesCJ,RichardsAM.人脑利钠肽的延迟代谢反映对中性肽链内切酶的4氐抗(Delayedmetabolismofhumanbrainnatriureticpeptidereflectsresistancetoneutralendopeptidase).JEndocrinol.2000;167:239-46.)。对NT-proBNP的分析前处理(Preanalytics)是更稳健的，使得易于将样品转移至中心实验室(MuellerT，GegenhuberA，DieplingerB,PoelzW，HaltmayerM.内源性B-型利钠肽(BNP)和氨基末端proBNP(NT-proBNP)在冰冻血浆样品中的长期稳定性(Long-termstabilityofendogenousB-typenatriureticpeptide(BNP)andaminoterminalproBNP(NT-proBNP)infrozenplasmasamples).ClinChemLabMed2004;42:942-4.)。可将血液样品于室温储存几天或可邮寄或船运而没有回收损失。相反，将BNP于室温或4。摄氏度下储存48小时导致浓度损失至少20%(MuellerT，GegenhuberA,等，ClinChemLabMed2004;42:942-4，同上；WuAH,PackerM,SmithA，BijouR,FinkD，MairJ,WallentinL，JohnstonN,FeldcampCS,HaverstickDM,AhnadiCE,GrantA,DespresN，BluesteinB，GhaniF.BayerADVIACentaur自动化的B-型利钠肽化验在心力衰竭患者中的分析和临床评价多个点的研究(AnalyticalandclinicalevaluationoftheBayerADVIACentaurautomatedB-typenatriureticpeptideassayinpatientswithheartfailure:amultisitestudy).ClinChem2004;50:867-73.)。因此，依赖于关键的时间-进程或特性，对于活性或者非活性形式的利钠肽的检测可为有益的。依据本发明的最优选的利钠肽是NT-proBNP或其变体。如上所简述的那样，本发明所提及的人NT-proBNP是优选包含76个氨基酸的多肽，其相应于人NT-proBNP分子的N-末端部分的长度。人BNP和NT-proBNP的结构已经在先前技术，如，WO02/089657、WO02/083913,Bonow1996,对心脏利钠肽的新洞察(Newinsightsintothecardiacnatriureticpeptide).Circulation93:1946-1950中详细描述。优选地，如用于本文的人NT-proBNP是如在EP0648228Bl中公开的人NT-proBNP。这些在先技术文件通过关于本文公开的NT-proBNP及其变体的特异性序列方面的引用而结合于本文。依据本发明所提及的NT-proBNP还包括以上公开的所述人NT-proBNP的特异性序列的等位基因和其它的变体。特别是，构思了变体多肽，其氨基酸水平至少为60%，更优选至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%或至少99%与人NT-proBNP相同。基本类似并且还构思了蛋白水解的降解产物，其仍然由诊断工具或通过直接针对各自的全长肽的配体确认。还包括的是与人NT-proBNP的氨基酸序列比较，具有缺失、取代和/或增加氨基酸的变体多肽，条件是所述多肽具有NT-proBNP性质。本文所提及的NT-proBNP性质是免疫学和/或生物学性质。优选地，与那些NT-proBNP比较，NT-proBNP变体具有免疫学性质(即表位成分)。这样，所述变体将通过前述的用于测定利钠肽的量的工具或配体确认。可通过在Karl等(Karl1999.新的、低检测范围的N-末端-proBNP(NT-proBNP)检验法的开发(Developmentofanovel,N-Terminal-proBNP(NT-proBNP)assaywithalowdetectionlimit).ScandJClinInvest59:177-181),Yeo等.(Yeo2003.RocheNT-proBNP检验法的多中心评估和与BiositeTriage4企马会法的比4交(MulticenterevaluationoftheRocheNT-proBNPassayandcomparisontotheBiositeTriageassay)。ClinicaChimicaActa338:107-115)和在下面的实施例1中描述的检验法检测NT-proBNP的生物学和/或免疫学性质。变体还包括经转译后修饰的肽，诸如糖基化的肽。依据本发明的变体也是在收集样品后，例如通过共将标记物，尤其是放射性或荧光性标记物价或非-共价联接至肽而已被修饰的肽或多肽。术语"样品"指体液样品、分离的细胞样品或来自组织或器官的样品。体液样品可通过众所周知的技术得到，且优选包括血液、血浆、血清或尿液样品。组织或器官样品可通过，如活组织切片检查从任何组织-或器官得到。分离的细胞可通过分离技术，诸如离心或细胞分选(cellsorting),,人体液或者组织或器官得到。优选地，细胞-、组织或器官样品从那些表达或产生本文所提及的肽(即利钠肽和心肌钙蛋白)的细胞、组织或器官中得到。15本文所用的比较包括将包含在被分析样品中的利钠肽或心肌4丐蛋白的量，与适宜的本说明书中其它处特定的参比源的量进行比较。应该理解，本文所用的比较指相应的参数或值的比较，如，绝对量与绝对参比量的比较，浓度与参比浓度的比较，或从检验样品中得到的强烈信号与相同类型的参比样品的强烈信号的比较。在本发明方法的步骤(b)中所提及的所述比较，可用手工或电脑辅助实施。对于计算机辅助比较，可将测定量的值与由计算机程序储存于数据库中的相应的适宜的参比量的值比较。电脑程序可进一步评价比较的结果，即以适宜的输出格式自动提供想要的诊断。本文所用的术语"参比量"指通过以上所提及的比较允许评估患者是否将罹患急性心血管事件或本说明书中所提及的其它疾病的量。因此，所述参比可或者来自于罹患急性心血管事件的患者或者来自至少对于急性心血管事件而言是健康的个体。可适用于个体患者的参比量可依多种生理参数，诸如年龄、性别或亚种群(subpopulation)不同而异。因而，可采用本发明方法从与检验样品一起(即同时或顺序地)分析的参比样品中，测定适宜的参比量。原则上，依据本发明已经发现，在慢性心力衰竭期间，发现如在血浆中的心肌钙蛋白的量也将增加。此外，将要成为的慢性心力衰竭越严重，血浆中利钠肽的量将越高。因而，对于健康的个体，血浆心肌4丐蛋白和利钠肽量的升高，将与罹患慢性心力衰竭的更高可能性相关。在其它方面，仅仅是血浆心肌钓蛋白的量的升高与罹患急性心血管事件的更高风险相关。更优选地，依据本发明已经发现，心肌钙蛋白的参比量至少为0.01ng/ml和利钠肽的参比量少于500pg/ml，表示急性心血管事件。此外，心肌钓蛋白的参比量至少为3.5ng/ml和利钠肽的参比量至少为500pg/ml，也表示急性心血管事件(即与发生急性心血管事件的比较高的可能性相关)。令人惊讶的是，本发明进行的研究中已经发现，通过考虑两个生物标记物，即心肌4丐蛋白和利钠肽，而不是只考虑现行的金标准标记物肌钩蛋白T，可避免涉及急性心血管事件诊断的假阳性结果。有利的是，可对罹患急性心血管事件的患者进行可靠的诊断并与罹患其它疾病的患者鉴别开来。应该理解，患者将极大地受益于这种更可靠的诊断，因为可易于实施特异性的和有效的治疗。因此，以上及以下所作出的术语的定义和解释，适用于本说明书中描述的所有实施方案和附随的权利要求书。由以上得出的结论是，在本发明方法的特别优选的实施方案中，(i)心肌钩蛋白的参比量至少为0.01ng/ml和利钠肽参比量少于500pg/ml或(ii)心肌钙蛋白的参比量至少为3.5ng/ml和利钠肽的参比量至少为500pg/ml，表示急性心血管事件。另外，本发明涉及鉴别急性心血管事件和慢性心力衰竭的方法，所述方法包括的步骤为a)测定患者样品中的心肌钙蛋白的量；b)测定所述患者样品中的利钠肽的量，和c)鉴别急性心血管事件和慢性心力衰竭通过将步骤a)和b)中测定的量与参比量比较进行。本文所用的术语"鉴别，，意指区别罹患急性心血管事件的患者和罹患慢性心力衰竭的患者，其中所述患者显示基本上相同的临床体征和症状并均在现行应用的肌钙蛋白T检验中显示急性心血管事件阳性。管事件或者慢性心力衰竭，或者一起诊断两种疾病。本文所用的术语"慢性心力衰竭"指慢性，即持久性的心力衰竭。心力衰竭以舒张期或收缩期血流速率减弱，并因而心功能减退为特征。然而，不是表现伴随心肌细胞严重坏死的突然缺血，本文所指的慢性心力衰竭优选伴随心肌细胞持续坏死事件，其导致连续发生心功能减退。有利的是，本发明一通过提供前述用于鉴别诊断急性心血管事件和慢性心力衰竭的方法一使得在可靠性和时间以及成本上一有效地17区别所述疾病病症。因此，采用特异性的和有效的疗法而不是非特异性的和非有效的疗法，可易于治疗罹患所述疾病的患者。本发明方法的特别优选的实施方案涉及如下在本发明方法的优选的实施方案中，心肌钙蛋白的参比量在0.01ng/ml和3.5ng/ml之间，且利钠肽的参比量至少为500pg/ml表示慢性心力衰竭。在本发明方法的另一个优选的实施方案中，(i)心肌钙蛋白的参比量至少为0.01ng/ml和利钠肽的参比量小于500pg/ml或(ii)心肌钙蛋白的参比量至少为3.5ng/ml和利钠肽的参比量至少为500pg/ml，表示急性心血管事件。在本发明方法的优选的实施方案中，利钠肽是BNP，更优选的是NT-proBNP。在本发明方法的再优选的实施方案中，利钠肽是ANP,更优选的是NT-proANP。在本发明方法的另外的优选的实施方案中，所述心肌4丐蛋白是肌钙蛋白T和/或肌钙蛋白I。还有，在本发明方法的优选的实施方案中，所述患者是人。本发明还涉及用于诊断急性心血管事件的装置，所述装置包括a)测定患者样品中的心肌钙蛋白的量的工具；b)测定样品中利钠肽的量的工具；以及c)将所述量与适宜的参比量进行比较的工具，通过所述比较诊断急性心血管事件进行。本文所用的术语"装置"指工具体系，其包括至少在操作上相互联系的前述工具以实现预期目标。用于测定利钠肽或心肌钓蛋白的量的如何以操作的方式将所述各工具连贯起来，将取决于包含在装置中各工具的类型。例如，当工具被用来自动化测定肽的量时，则可将由所述自动化操作工具所得到的数据通过如计算机程序处理，以诊断急性18心血管事件或本文所提及的其它疾病。优选地，在这样的情况下所述各工具包括在单一装置中。所述装置可包括一个用于检测样品中肽的量的分析单元和用于处理得到的数据，以用来鉴别诊断的电脑单元。或者，在使用工具诸如试纸(teststripes)来测定肽的量时，则用于诊断的工具可包括对照试纸或对照表，其指定测定量为已知与急性心血管事件或本文所提及的其它疾病相关的量，或已知表示为健康个体的量。所述试纸优选与利钠肽或心肌钩蛋白特异性结合的配体偶联。所述试纸或装置优选包括用于检测所述肽与所述配体结合的工具。优选的用于检测的工具连同以上涉及本发明方法的实施方案一起公开。在这样的情况下，所述各工具在操作上是联系的，使得该系统的使用者将测定的量的结果与其由于手册中给出的说明书和解释所作出的诊断值相关联。在这样的实施方案中，所述工具可以分开的装置呈现，并且，优选地，包装在一起作为一个试剂盒。本领域专业技术人员将会认识到，如何不经周折地将各工具联系起来。优选的装置是那些无需专业临床医生的特别知识即可应用的装置，如试纸或只需要装载样品的电子装置。结果的输出可以以需要由临床医生解读的诊断性的原始数据的形式给出。然而，优选地，装置的输出信息是经加工的诊断性的原始数据，不需要临床医生对此进行解读，即从其输出信息，就应该必然清楚地知道患者是否罹患轻度或中度心力衰竭。更优选的装置包括分析单元/装置(如，生物传感器、阵列、偶联至特异性辨认利钠肽的配体的固体载体、表面等离子共振装置、NMR光语仪、质谱仪等)或以上依据本发明方法所提及的评估单元/装置。此外，本发明还包括用于鉴别急性心血管事件和心力衰竭的装置，所述装置包括a)测定患者样品中的心肌钙蛋白的量的工具；b)测定样品中利钠肽的量的工具；以及c)将所述量与适宜的参比量进行比较的工具，通过所述比较鉴别急性心血管事件和心力衰竭。最后，本发明涉及用于实施本发明方法的试剂盒，所述试剂盒包括..a)测定患者样品中的心肌钓蛋白的量的工具；b)测定样品中利钠肽的量的工具；以及c)将所述量与适宜的参比量进行比较的工具，通过所述比较鉴别急性心血管事件和心力衰竭。本文所用的术语"试剂盒"指上述各工具的组合，优选地，以分开的形式或在单个容器中提供。所述容器也优选包括实施本发明方法的说明书。本说明书中提到的参考文献通过对于其全部公开内容并且尤其是本说明书中提及的公开内容的引用结合于本文。下面的实施例将仅对本发明进行阐述。无论如何不应该被解释为限制本发明的范围。实施例1:病例研究在病例研究中，依据本发明方法，12个患者被证实罹患急性冠脉综合征。通过开始进行的肌钩蛋白T检验，以及随后进行的高敏感性肌钩蛋白T检验，对显示急性心血管事件症状后的所有患者进行了研究。结果显示在随后的表l中。如从表中明显看到，采用高敏感性检验，所有患者对肌钓蛋白T呈现阳性。此外，也显示患者的NT-proBNP值。在最后一列指出最终的诊断。随后的表中所显示的12个患者的数据证明，可将肌钙蛋白T以及NT-proBNP值联合使用，以诊断急性冠脉综合征，诸如ST段升高或非ST段升高的心肌感染(STEMI或NSTEMI)。表l:N-12名产生TnT阳性的ACS患者<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>实施例2:病例研究对于73个之前已知有心力衰竭的、罹患急性心血管事件的一组患者，检测NT-proBNP、BNP、NT-proANP以及肌钩蛋白T。所述检测在患者到达急诊医院以及随后的12小时后和24小时后的时间点进行。在上述检测时间点之间没有显示肌钓蛋白T量升高的患者被认为是表现为慢性坏死。依据以下标准，已将这些患者再分组肌钩蛋白T低于检测水平、肌钓蛋白T高于检测水平，然而，低于临床临界点0.1ng/ml和肌钙蛋白T高于临床临界点值0.1ng/ml。如从表2中明显看到，升高的肌钩蛋白T值伴随显著升高的BNP、NT-proBNP和NT-proANP量。应该注意的是，持续的肌钙蛋白T升高，高于3ng/ml值很少见。表2于时间点0时，根据TnT类别对慢性心力衰竭患者分类肌钓蛋白T类別<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例3:病例研究在另一组罹患冠心病的患者(n=235)中，对其NT-proBNP和肌钙蛋白T进行了研究。患者不罹患急性心血管事件，即最后的急性心血管事件出现在至少一周以前。如以上实施例2中所述，将患者分组。研究结杲在下表3中显示。表3:确证为冠状动脉疾病的患者中的高敏感性肌钩蛋白T类别。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>权利要求1.一种鉴别急性心血管事件和慢性心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤a)测定患者样品中的心肌钙蛋白的量；b)测定所述患者样品中的利钠肽的量，以及c)通过将步骤a)和b)中测定的量与参比量比较，鉴别急性心血管事件和慢性心力衰竭。2.权利要求1的方法，其中0.01ng/ml和3.5ng/ml之间的心肌钙蛋白的参比量和至少500pg/ml的利钠肽的参比量为慢性心力衰竭的指标。3.权利要求1或2的方法，其中(i)至少0.01ng/ml的心肌钙蛋白的参比量和少于500pg/ml的利钠肽的参比量，或(ii)至少3.5ng/ml的心肌钩蛋白的参比量和至少500pg/ml的利钠肽的参比量为急性心血管事件的指标。4.一种诊断急性心血管事件的方法，所述方法包括以下步骤a)测定患者样品中的心肌钙蛋白的量；b)测定所述患者样品中的利钠肽的量，以及c)通过将步骤a)和b)中测定的量与参比量比较，诊断急性心血管事件。5.权利要求4的方法，其中(i)至少0.01ng/ml的心肌钓蛋白的参比量和少于500pg/ml的利钠肽的参比量或(ii)至少3.5ng/ml的心肌钓蛋白的参比量和至少500pg/ml的利钠肽的参比量为急性心血管事件的指标。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述利钠肽是BNP。7.权利要求6的方法，其中所述BNP是NT-proBNP。8.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述利钠肽是ANP。9.权利要求8的方法，其中所述ANP是NT-proANP。10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述心肌钓蛋白是肌钙蛋白T和/或肌钓蛋白I。11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述患者是人。12.—种用于诊断急性心血管事件的装置，所述装置包括a)测定患者样品中的心肌钙蛋白的量的工具；b)测定样品中利钠肽的量的工具；以及c)将所述量与适宜的参比量进行比较的工具，由此诊断急性心血管事件。13.—种用于鉴别急性心血管事件和心力衰竭的装置，所述装置包括a)测定患者样品中的心肌钓蛋白的量的工具；b)测定样品中利钠肽的量的工具；以及c)将所述量与适宜的参比量进行比较的工具，由此鉴别急性心血管事件和慢性心力衰竭。14.一种用于实施权利要求1-11中任一项的方法的试剂盒，所述试剂盒包括a)测定患者样品中的心肌钓蛋白的量的工具；b)测定样品中利钠肽的量的工具；以及c)将所述量与适宜的参比量进行比较的工具，由此鉴别急性心血管事件和慢性心力衰竭。全文摘要本发明涉及诊断急性心血管事件的方法，所述方法包括测定患者样品中的心肌钙蛋白的量、测定所述患者样品中的利钠肽的量的步骤和通过将之前步骤测定的量与参比量比较而诊断急性心血管事件。此外，本发明包括鉴别急性心血管事件和慢性心力衰竭的方法，所述方法包括测定患者样品中的心肌钙蛋白的量、测定所述患者样品中的利钠肽的量和通过将之前步骤测定的量与参比量比较而鉴别急性心血管事件和慢性心力衰竭。本发明还包括实施这样的方法的装置和试剂盒。文档编号G01N33/68GK101410716SQ200780010683公开日2009年4月15日申请日期2007年3月21日优先权日2006年3月24日发明者A·霍什,G·赫斯申请人:霍夫曼—拉罗奇有限公司